Method Article

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

DOI:

10.3791/56799

⸱

January 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre göç yara iyileşmesi için zorunlu bir yönüdür. Yapay oluşturma araştırma hayvan modellerinde genellikle pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler sonuçlarında potansiyel hassas eksik ise yaralar. Vitro kültür epitel hücre hatları yara iyileşmesi ve tedaviler bu hücrelerde etkisini hücre göç davranışlara araştırma için uygun bir platform sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi kez birleşmesi olmayan koşullarda okudu; Ancak, bu yaklaşım koşulları şifa doğal yara benzemeyebilir. Mekanik yollarla epitel bütünlüğünü bozan gerçekçi bir model oluşturur, ancak moleküler tekniklerin uygulanması engelleyebilir. Sonuç olarak, temel mikroskobu teknikleri epitel hücre geçiş eğitimi için en iyi durumda tüp bebek. Burada iki belirli yöntemleri, yapay yara karalama tahlil ve nicel ve nitel veri, sırasıyla, epitel hücreleri göçmen performansı üzerinde elde edebilirsiniz yapay geçiş açık tahlil, ayrıntılı.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel boşluğu son kapatılması ve kesintiye yüzey1restorasyonu için sorumlu olduğu gibi hücre göç yara iyileşmesi için gereklidir. Hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan karmaşık bu süreçte fizyolojik şartlarda2yakınındaki çoğaltma olanağı sağlar. Ancak, bu yaklaşım genellikle potansiyel olarak farklı süreçler, yara iyileşme süreci karmaşık doğası gereği incelenmesi için duyarlık eksikliği pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler, sonuç.

Vitro kültür epitel hücre hatları bu hücreler yara iyileşmesi ve hücre göç davranışı üzerinde tedavinin etkilerini oynamak rol araştırma için hay....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar

  1. Hücre monolayer hazırlık
    1. Steril koşullarda çalışma, tohum ve kültür şişe serum takıma orta kullanarak Mv1Lu veya HaCaT epitel hücrelerinde büyür. Orta bir kez her 24-48 h yenileyin. Hücrelerin % 80 izdiham ulaştıktan sonra hücreleri kullanarak bir uygun yöntemi, Yani, trypsinization9bağlantısını kesin.
      Not: Mv1Lu ve epitel hücre hatları EMEM ve DEMEM kültür ortamına kullanarak kültürlü HaCaT sırasıyla, 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve % 5 CO2kontrollü bir atmosfer ile 37 ° C'de inkübe. Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar: Epidermal büyüme faktörü (EGF) promosyon göç değerlendirilmesi:

EGF epitel hücre çoğalması ve geçiş ve böylece olumlu bir denetim geçiş promosyon miktarının için iyi bilinen bir uyarıcı olduğunu. Mv1Lu ve HaCaT hücre monolayers yara karalama deneyleri içinde kullanılan ve ön arıtma resimler elde edilmiştir. 10 ng/mL EGF ile aşı sonra hücreleri için 19 h fiksasyon ve tedavi sonrası r.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilt veya mukoz kesintileri bariyer fonksiyonu fibroblastlar veya epitel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri eylemleri ile geri yüklenir. Manivela, tabi bu hücreler karmaşık bir işlem apoptosis, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve önemlisi, fibroblast ve epitel hücre göç, son mekanizması kesintiye dokusunun restorasyonu için sorumlu olan ve Tam da yara tedavisi düzenleyici potansiyelini belirlenirken epitel hücreleri, fizyolojik davranışını tanımlayan kapatma yüzeysel epi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu ilan eder.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz geliştirmek ve fiili duruma bu teknikleri rafine yardımcı eski üyeleri laboratuarının sayesinde vermek istiyorum: Dr Celia Martinez-Mora; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Canada'da ve Dr Antonia Alcaraz-García. Biz kuvvetle bu tekniklerin gelişimi desteklemek için hastane Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca için borçlu bulunmaktadır. Ayrıca Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Estatal planı ben + D + ı ve Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant No: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Biz Ayrıca Universidad de Murcia, IMIB-Arrixac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FransaL0102-500İsteğe bağlı %10 FBS takviyesi
Eagles' s Minimum Esansiyel Orta (EMEM)LonzaBE12 -662Fİsteğe bağlı %10 FBS takviyesi
L-GlutaminLonzaBE17-605E2 mM'de kullanın
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ABDDE17603A
Tripsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDT4049Uygun şekilde seyreltin
Poli-L-LizinSigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDP9155
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-0671x
24 oyuklu kültür plakalarınaBD FALCON//SARSTED734-0020
6 oyuklu kültür plakalarıSARSTEDT83-3920
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDE9644Kullanılan 10 ng / mL
Yuvarlak kapak camıMENZEL-GL & Auml; SERMENZCB00120RA020KISA ALAN DERİNLİĞİ
Takviyeli tıraş bıçağı no. 743Martor (VWR aracılığıyla)MARO743.50
200 & mikro; l steril aerosol pipet uçlarıVWR732-0541
20 & mikro; l steril aerosol pipet uçlarıVWR732-0528
Dijital kamera birleştirilmiş faz kontrast mikroskobuMotic İspanyaMoticam kamera 2300 3.0 M Piksel USB 2.0; Motic Optik AE31
Konfokal mikroskopZEISS Microimaging, AlmanyaLSM 510 META
10 cm Kültür kabıBD FALCON353003
Tavşan poliklonal anti c-Jun antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-1694Kullanılmış 1:100
Anti-tavşan IgG (poliklonal keçi) AF 488InvitrogenA11008Kullanılmış 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD14530Kullanılmış 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (metanol içinde) (kırmızı)InvitrogenA12381Kullanılmış 1:100
Sığır Serumu AlbüminiSanta Cruz BiyoteknolojiSC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDT9284
Yağsız sütBD DIFCO232100
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri, ABDSürüm 1.50i
Zen LSM 510 görüntü işleme yazılımıZEISS Microimaging, AlmanyaSürüm 5.0 SP 1.1
seyreltin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
  3. Alcaraz, A., et al. Amnio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MigrationWound Healing AssayArtificial Wound ScratchMigration Front AssayPhase Contrast MicroscopyFluorescence MicroscopyImage Processing SoftwareVariance FilteringThreshold AdjustmentFill Holes

Related Articles