Method Article

Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol

DOI:

10.3791/56800

⸱

September 16th, 2020

 ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Institute of Toxicology, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Modern Toxicology of Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, 3Center of Gallbladder Disease, Shanghai East Hospital, Institute of Gallstone Disease, Tongji University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevresel organoklorin pestisitlerinin (OKP) hepatositlerde mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisinin anlaşılması metabolik bozukluklara neden olan OKP'lerin mekanizmasının araştırılmasında önemlidir. Bu yazıda hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması nda ayrıntılı yöntemler yer alıyor.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazı, hepatositlerde çevresel organoklorin pestisitlerinin (OCP) neden olduğu metabolik bozuklukların nedenini daha iyi anlamak için hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması için ayrıntılı yöntemler sunmaktadır. HepG2 hücreleri β-heksaklorosiklohekza (β-HCH) 24 saat boyunca genel popülasyonda eşdeğer bir iç maruziyet dozuyla maruz kaldı. Hepatositlerde ultrayapı iletim elektron mikroskobu (TEM) tarafından incelendi ve mitokondrinin hasarını gösterdi. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5'-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mitokondriyal yeşil floresan sonda ile lekelendikten sonra mitokondri floresan yoğunluğu floresan mikroskopi ile gözlendi. ATP düzeylerini belirlemek için luciferin-luciferase reaksiyonu kullanıldı. MMP katyonik boya JC-1 tarafından tespit edildi ve akış sitometrisi altında analiz edildi. OCR hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü. Özetle, bu protokoller hepatositlerde mitokondriyal fonksiyonun saptanmasında ve mitokondri hasarlarının araştırılmasında kullanılmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoklorin pestisitlerinin (OKS) sağlık üzerindeki etkileri, örneğin üreme paraziti, immünolojik toksisite, metabolik değişiklikler daha önce incelenmiştir1,2,3. Hücresel metabolizmayı saptamak ve mitokondriyal disfonksiyon bulmak için yöntemler bilim adamları mitokondriyal fonksiyonun rolünü anlamak için etkin(yani., mitokondriyal STAT3 düzeyleri, laktat, pirüvat, laktat-pirüvat oranı, koenzim Q10, mitokondriyal proton sızıntısı, biyoenerjit, biyogenez ve dinamikler) yaşlanma gibi alanlarda, obezite, diyabet, kardiyovasküler fonksiyon, kanser, ve güvenlik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler ve deney protokolleri ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi ve Nanjing Tıp Üniversitesi Yerel Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. TEM tarafından Mitokondriyal ultrayapı

  1. HepG2 hücrelerinin toplanması
    1. 100 mm'lik tabaklarda Tohum HepG2 hücreleri. 37 °C ve %5 CO2'desaklayın.
    2. 1,5 mLEP tüpte %0,25 EDTA içeren hücreleri sindirin.
    3. Oda sıcaklığında (RT) 3 dk için 1000 x g santrifüj. Supernatant atın.
    4. 4-6 x 105 HepG2 hücreleri toplayın.
  2. 1 mL%5 glutaraldehit (Solvent: çift distile su) pipetlerle ve 4°C'de 2 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinin mitokondri cristae'si belirgin şekilde hasar görmüştür. Dağınık mitokondri ler belirgin bir şekilde genişletildi, düzensiz şekilli ydi ve mitokondriyal sırt nispeten anormal mitokondriyal mimari ile kayboldu(Şekil 1).

Mitokondriyi temsil eden ortalama mitokondriyal yeşil floresan yoğunluğu β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinde(Şekil 2),<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algılama protokolünün başarısı için kritik olan, fenotipten mekanizmaya kadar çalışma kapsamında yer alan çeşitli deneysel yöntemlerin kullanılmasıdır. Bu çalışmada DMEM'de HepG2 hücreleri penisilin ve streptomisin ve %10 fetal sığır serumu ile kültürlendi. Hücreler %40-50 birleştiğinde β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) eklenmiş ve 24 saat kuluçkaya yatırıldı. İlk olarak, temsilci OKP'lerin neden olduğu hepatositteki ultrastrüktürel değişiklikleri gösteren TEM'i kullandık, β-HCH, mitokondri yapısının bozulmasını gösterdi .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81573174, 81570574) tarafından desteklenmiştir; Jiangsu Eyaleti Üstün Gençlik Fonu (SBK2014010296); Çin Eğitim Bakanlığı Araştırma Projesi (213015A); Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (PAPD) Öncelikli Akademik Program Gelişimi, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Önemli Gelişimi; ve Devlet Kilit Çevre Kimyası ve Ekotoksikoloji Laboratuvarı Açık Proje Programı (KF2015-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Transmisyon elektron mikroskobu FEITecnai G2 Spirit Bio TWINYüksek kontrastlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme, Düşük doz gözlem ve görüntüleme, Düşük sıcaklık gözlemi, Olağanüstü analitik performans, Kolaylık ve performans için otomasyon
Mito-Tracker GreenBeyotimeC1048Mito-Tracker Green, canlı hücre mitokondriyal spesifik floresan boyama için kullanılabilen mitokondriyal yeşil bir floresan probdur.
Lazer taramalı konfokal mikroskopZeiss700BTasarım kompakt, kararlı, ışık yolu en kısa, yüksek ışık hassasiyeti, yaratıcı teknoloji ve gelişmiş tarama teknolojisi birlikte mükemmel bir 3 boyutlu numune görüntüsü üretir.
Geliştirilmiş ATP Test KitiBeyotimeS0027Geliştirilmiş ATP Test Kiti, yaygın çözeltilerde, hücrelerde veya dokularda ATP (adenozin 5'-trifosfat) seviyelerini tespit etmek için kullanılabilir. Hücreler ve doku numuneleri, numune hazırlığını tamamlamak için bölünebilir, 0.1nmol / L'ye kadar algılama hassasiyeti, kemilüminesans 30 dakika boyunca sürdürülebilir.
LuminometreBertholdCentro LB 960Luminometre kemilüminesans dedektörüdür, test numunesinin kendisi hafif olabilir, uyarılmasına gerek yoktur. Luminometre, kemilüminesansı tespit eden cihazdır.
BCA Protein Test KitiBeyotimeP0012BCA Protein Test Kiti, protein konsantrasyonlarını tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir.
Çok modlu okuyucuTECANInfiniteM200Çok modlu okuyucu, protein rızasını tespit etmek için kullanılabilir.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79(2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionHepatocytesOrganochlorine PesticidesHepG2 CellsTransmission Electron MicroscopyFluorescence MicroscopyFlow CytometryExtracellular Flux AnalyzerATP LevelsOxygen Consumption Rate

Related Articles