Yöntem makalesi

DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

DOI:

10.3791/56815

⸱

9 Kasım 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı manyetik parçacıklar sentezi ve değerlendirilmesi yolu ile dinamik ve elektroforetik ışık saçılma DNA'ya bağlanıcı özellikleri açıklar. Bu yöntem partikül büyüklüğü, onların polydispersity değişiklik izleme üzerinde odaklanır ve zeta potansiyeli oynamak parçacık yüzey Binbaşı bağlama DNA gibi malzemelerin rolü.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik parçacıklar kullanarak DNA izolasyonu Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Araştırma yüksek öneme sahip bir alandır. Bu iletişim kuralı DNA-manyetik parçacıklar dinamik ışık saçılma (DL) ve elektroforetik ışık saçılma (ELS) bağlama değerlendirilmesi açıklar. DLS göre analiz partikül büyüklüğü, polydispersity ve zeta potansiyel gibi parçacıklar fizikokimyasal özellikleri üzerinde değerli bilgiler sağlar. İkinci DNA gibi malzemelerin Elektrostatik bağlamadaki önemli rol oynayan parçacık yüzey ücretten açıklar. Burada, karşılaştırmalı bir analiz nano tanecikleri ve microparticles ve DNA bağlama ve elüsyon üzerindeki etkileri üç kimyasal değişimleri patlatır. Dallı tarafından kimyasal değişimleri polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate ve (3-aminopropyl) triethoxysilane incelenmiştir. DNA negatif yük sergileyen beri zeta potansiyel parçacık yüzey üzerine DNA'ın bağlama azalır bekleniyor. Kümeleri oluşturan parçacık boyutu da etkiler. Bu parçacıklar izolasyon verimliliğini ve DNA'ın elüsyon araştırmak için parçacıklar düşük pH (~ 6), yüksek iyonik gücü ve dehidratasyon çevre DNA ile karıştırılır. Parçacıklar mıknatıs üzerinde yıkanmış ve sonra DNA Tris-HCl tampon tarafından eluted (pH = 8). DNA kopya sayısı nicel Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanarak tahmin ediliyor. Zeta potansiyeli, parçacık boyutu, polydispersity ve kantitatif PCR veri değerlendirilen ve karşılaştırıldığında. DLS bir anlayışlı ve parçacıklar DNA izolasyonu için tarama işlemi için yeni bir bakış açısı ekler analiz yöntemi destekleyen var.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA izolasyon Moleküler biyolojide en önemli adımlardan biri. Nükleik asit ayıklama yöntem geliştirme genomik, metagenomics, epigenetik ve transcriptomics ortaya çıkan alanların büyük etkisi vardır. Çok çeşitli tıbbi dahil olmak üzere DNA izolasyonu (adli/tanılama araçları ve prognostik biyolojik) için Biyoteknolojik uygulamaları ve çevresel uygulamalar (metagenomic biyolojik çeşitlilik, patojen yaygınlık ve gözetim) vardır. Arındırmak ve farklı malzemelerden ve kan, idrar, toprak, tahta ve diğer tür örnekleri gibi farklı ölçeklerde DNA izole etmek için artan talep oluştu. 1 , 2 , 3 , 4

Ne zaman bir manyetik alan tarafından immobilize Nano ve mikro ölçekli parçacıklar için DNA izolasyonu yüksek onların yüzey alanı nedeniyle ve özellikle uygundur. Parçacıkların boyutu veya şarj, fizikokimyasal özellikleri hedef biomolecules şekilde bağlanabilemeleridir büyük ölçüde etkileyebilir. 5 farklı kimyasal değişimleri (yüzey kaplama) bağlama biomolecules, daha fazla arttırmak ve parçacıklar stabilize etmek için kullanılabilir. Birçok farklı stratejileri bağlama için kovalent ve kovalent olmayan etkileşimleri göre sınıflandırılır. 6 parçacık kompozisyon metalik, alaşım ve yoğunluğu, porozite ve yüzey üzerinde etkili olabileceği diğer maddeleri birleşme tarafından uygun olabilir, ancak parçacıkların boyutunu doğrudan mıknatıslanma özelliklerini etkiler. 7 küçük parçacıkların yüzey şarj ölçmek için güvenilir yolu yoktur. Bunun yerine, kayan uçak (nanopartikül yüzey uzak mesafe), Elektrik potansiyeli ölçülebilir. 8 bu değer zeta potansiyel denir ve genellikle DLS yolu ile nano - ve microparticle istikrar değerlendirilmesi için kullanılan güçlü bir araçtır. 9 değerini sadece pH ve iyonik gücü dağıtıcı çevre, aynı zamanda parçacıkların yüzey özellikleri üzerinde son derece bağımlı olduğundan, bu da arasındaki etkileşim nedeniyle bu yüzey değişiklikleri kanıtlayabilirim parçacıklar ve molekül ilgi. 10

Öte yandan, B-DNA formu onun yağış (toplama) ne zaman karşılaştırmak için yaygın olarak kolaylaştırmak susuz koşulları (A-DNA formu) sergiler sıkıştırılmış biçimler DNA yapısında meydana gelen. (Elektrostatik iyonik ve H-bond) DNA bağlama diğer malzemelere onların sterically erişilebilir fosfat nedeniyle kontrol büyük güçleri ve azot (özellikle guanin) temelleri. 7 , 10

Bu çalışmada, manyetik nano tanecikleri ve microparticles üç temsilcisi kimyasal değişimleri analiz edilir (şekil 1A). Nano tanecikleri ve microparticles kimyasal modifikasyonu ve sentez yöntemi açıklanmıştır. Bu anlaşmaları DNA bulutlu (pH, iyonik gücü ve dehidratasyon) teorik ilkeleri için bir bağlama çözüm DNA bağlama ve elüsyon değerlendirmek için kullanılır. Kantitatif PCR DNA elüsyon verimliliğini temsilcisi nano tanecikleri ve microparticles (şekil 1B) değerlendirmek için kullanılır. Partikül Büyüklüğü, polydispersity dizini ve zeta potansiyel (şekil 1 c) parçacık yüzeyinde oluşan fizikokimyasal değişiklikleri görselleştirmek için kullanılan önemli parametreleridir. Manyetik partikül yüzeyine kimyasal karakterizasyonu vurgulamak önemlidir. Bu adımı bu iletişim kuralının kapsamı dışında iken, kimyasal değişimleri verimliliğini araştırmak için çeşitli modern teknikler uygulanabilir. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform Infrared spektroskopisi (FTIR) parçacık yüzey kızılötesi spektrum değerlendirmek ve ücretsiz kimyasal değiştiriciler spektrum karşılaştırmak için kullanılabilir. X-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) malzeme yüzeyi elemental kompozisyon tanımlamak için kullanılan bir tekniktir. Diğer elektrokimyasal, mikroskobik ve spektroskopik yöntemler parçacık sentez kalitesini ışık için kullanılabilir. DNA-Manyetik Parçacık etkileşimleri DLS yoluyla çözümlemek için yeni bir bakış açısı bu iş vurgulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. manyetik nano tanecikleri sentez

    1. FeCl 3 Ekle 20 mmol sitrat (MNPs) ile manyetik nano tanecikleri sentezi stabilize ∙ 6 H 2 O (5.406 g) ve FeCl 10 mmol 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) deoxygenated Çift Kişilik distile su (ddd su) 20 ml. Kabı kadar şeffaf bir çözüm elde edilen mekanik karıştırıcı kullanarak N 2 atmosfer altında şiddetle çözümde elde heyecan.
    2. Hızlı mekanik karıştırma altında 150 mL 1 M NH 4 OH, damla damla bırakarak huni (take 1 saat veya daha fazla gerekirse) kullanarak ekleyin. Tüm NH 4 OH ekledikten sonra çözüm beceremeyeceğin bir kap aktarın. 30 dakika süreyle 75 ° C'de gemi ve ısı çözüm vida
      Dikkat: NH 4 OH aşındırıcı ve çevre için tehlikeli olarak sınıflandırılır.
      Not: NH 4 OH çözüm yüksek dereceli % 28 NH 4 OH deoxygenated su kullanılarak su hazırlayın.
    3. Mıknatıs ve yıkama 100 mL ddd su kullanarak kullanarak siyah çökelti toplamak. 3 kez tekrarlayın. 50 mL 0.5 M tri sodyum sitrat dihydrate çökelti ekleyin. Gemi vida.
      Not: tri sodyum sitrat dihydrate deoxygenated çözüm kullanın.
    4. Yeniden dağıtmak çökelti sonication (35 kHz, % 100 genliği) ve 1 h için 80 ° C'de ısı damar yolu ile
      Not: Bir sonicator yeterli güç gereklidir.
    5. Oda sıcaklığında için çözüm soğumaya bırakın. Bir mıknatıs kullanarak çökelti toplamak ve süpernatant kaldırın. Ddd su sonicator (35 kHz, % 100 genliği) kullanarak 50 ml siyah çamur yeniden dağıtmak.
    6. Aliquots (~ 25 mL) 50 mL santrifüj tüpler içine aktarmak ve 20 mL aseton ekleyin. Santrifüj kapasitesi 2400 x g 10 dk de ve supernatants kaldırmak.
    7. Yeniden dağıtmak çökelti ve su uygun hacminin düşük moleküler ağırlıklı kesme diyaliz cihaz (500-1000 Da) için 24 h kullanarak karşı çözüm diyaliz
      Not: diyaliz cihaz üretici göre hazırlamak ' s gereksinimleri.
  2. Manyetik nano tanecikleri dallı polyethylenimine (MNPs_PEI) ile modifiye sentezi
    1. elde edilen MNPs çözüm (~0.1 g/mL) 2 mL bir cam kabı ekleyin. 38 mL ddd su ekleyin ve süspansiyon (10 dakika) (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
    2. 10 mL % 10 dallı polyethylenimine (ortalama 25 kDa) hızlı mekanik karıştırmaya altında eklenir. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin
    3. Toplamak mıknatıs kullanarak çökelti ve süpernatant kaldırın. Çökelti 20 mL ddd su yeniden dağıtmak. 5 kez yineleyin sonra son süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
  3. Manyetik nano tanecikleri parçacıklar sentezi silis (MNPs_TEOS) ile modifiye
    1. elde edilen MNPs çözüm (~0.1 g/mL) 10 mL bir cam kabı ekleyin. 60 mL su ve 130 mL etanol ekleyin. Çözüm solüsyon içeren temizleyicide ve % 28 NH 4 OH 6 mL ekleyin.
    2. Tetraethyl orthosilicate 1 mL hızlı mekanik karıştırma altında ekleyin. Çözüm için sonraki 12 h. ilave edin
    3. Siyah çökelti mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 kere) yıkayın. Yeniden dağıtmak parçacıklar ddd 10 mL su ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
  4. Amino grupları ile (MNPs_APTES) değiştiren manyetik nano tanecikleri sentezi
    1. elde edilen MNPs_TEOS çözüm (~0.1 g/mL) 5 mL bir cam kabı ekleyin. 45 mL su ve 50 mL etanol ekleyin. Çözüm (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
    2. Hızlı mekanik karıştırma altında (3-aminopropyl) triethoxysilane 0.5 mL ekleyin. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin
    3. Siyah çökelti mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 kere) yıkayın. Yeniden dağıtmak parçacıklar ddd 5 ml su ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.

2. Manyetik Microparticles sentez

    1. Ekle 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH ve ddd beceremeyeceğin bir gemi suya 205.875 mL manyetik microparticles sentezi sitrat (MMPs) ile stabilize. 6.675 mL 1 M FeSO 4 manyetik karıştırma sırasında ekleyin. 2 h. için Önceden ısıtılmış su banyosu (90 ° C) hemen gemiye transfer
      Not: KNO 3 ve ddd çözümlerinde KOH su hazırlayın.
    2. Oda sıcaklığında için çözüm soğumaya bırakın. Mıknatıs ve yıkama ddd su 50 mL (5 kez) kullanarak kullanarak siyah çökelti toplamak. 50 mL 0.5 M tri sodyum sitrat dihydrate çökelti ekleyin. Gemi vida.
    3. Yolu ile sonication (35 kHz, % 100 genliği) ve ısı gemi 1 h. toplamak siyah çökelti mıknatıs ve yıkama ddd su 50 mL (10 kez) kullanarak kullanarak için 80 ° C'de çökelti redisperse.
    4. Değiştirmek MMPs dallı polyethylenimine (MMPs_PEI), ile silis (MMPs_TEOS) ve amino grupları (MMPs_APTES) MNPs iletişim kuralına benzer. Daha fazla bilgi için sırasıyla 2.2, 2.3 ve 2.4, bölümlerine bakın.
  2. Manyetik microparticles dallı polyethylenimine (MMPs_PEI) ile modifiye sentezi
    1. 5 mL MMPs çözeltisi (~0.1 g/mL) bir cam kabı ekleyin. 38 mL ddd su ekleyin ve çözüm (35 kHz, % 100, 10 min genliği) solüsyon içeren temizleyicide. Hızlı mekanik karıştırma altında 10 mL % 10 polyethylenimine (ortalama 25 kDa) dallı ekleyin. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin
    2. Bir mıknatıs kullanarak çökelti toplamak ve süpernatant kaldırın. Çökelti Çift Kişilik distile su 20 ml redisperse. 5 kez yineleyin sonra nihai çözüm (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
  3. Manyetik microparticles silika (MMPs_TEOS) ile modifiye sentezi
    1. 5 mL MMPs çözeltisi (~0.1 g/mL) bir cam kabı ekleyin. 60 mL su ve 130 mL etanol ekleyin. Süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide ve % 28 NH 4 OH 6 mL ekleyin.
    2. Tetraethyl orthosilicate 1 mL hızlı mekanik karıştırma altında ekleyin. Çözüm için sonraki 12 h. ilave edin
    3. Siyah çökelti bir mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 kere) yıkayın. 5 mL ddd su parçacıkları redisperse ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
  4. Manyetik microparticles amino grupları (MMPs_APTES) ile modifiye sentezi
    1. MMPs_TEOS çözüm (~0.1 g/mL) 3 mL bir cam kabı ekleyin. 45 mL su ve 50 mL etanol ekleyin. Süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.
    2. Hızlı mekanik karıştırma altında (3-Aminopropyl) triethoxysilane 0.5 mL ekleyin. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin
    3. Siyah çökelti mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 saat) yıkayın. 3 mL ddd su parçacıkları redisperse ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.

3. Manyetik partikül boyut analiz DLS kullanarak

bir arka saçılma dedektörü açısı (173 °) ve ışın dalga boyu 633 geçerlidir
  1. partikül büyüklüğü suda
    1. kullanımı bir DLS enstrüman nm.
      Not: Arka saçılma DLS nerede birden çok saçılma önlenebilir konsantre örnekleri için uygundur. Yan saçılma (Dedektör açısı 90°) ve ileri saçılma (Dedektör açısı 15°) DLS daha küçük parçacıklar için uygundur ve parçacıklar, sırasıyla karışık.
    2. Önceden su, ölçümü için solüsyon içeren temizleyicide parçacıklar 3 dakika süreyle
      Not: parçacıkların seyreltilmiş çözüm kullanın. Bu amaçla, parçacıkların 9,6 µL su 96 µL ile karıştırmak.
    3. Dikkatle 50 µL parçacık çözüm polistren lateks pipet cuvettes ve kabarcıklar oluşumunu önlemek.
      Not: her örnek için tek kullanımlık küvet (malzemelerin tablosuna bakın) kullanın.
    4. Küvet netliğini ve ışık demeti yönüne dikkat edin. Hücre içinde örnek sahibinin Ekle ve odası kapatın.
    5. Ölçüm için aşağıdaki parametreleri kullanın: sıcaklık: 25 ° C; dağıtıcı faz (demir) Kırılma indisi: 2.344; Kırılma indisi dağıtıcı ortamı (su): 1,333
      Not: özellikle roman ya da hibrid malzemeler geliştirirken daha kesin sonuçlar için bir Refraktometre kullanarak Kırılma indeksi ölçümü gerçekleştirmek.

4. DNA hisse senedi, manyetik parçacıklar ve bağlayıcı arabelleğe hazırlama

  1. DNA hisse senedi
    1. Kullanım 10 mM Tris-HCL tampon (pH = 8) seyreltme ve DNA'ın depolama için. Özellikle Laboratuvarı (Bölüm 5.2 tepki ayarları ve koşullar için bakın) doğrudan bir PCR protokolü ile çoğaltılabilir standart bir DNA örneğini kullanın. 498 baz çifti (bp) eksen gen bakteriyofaj λ denetiminden yükseltmek için aşağıdaki astar kullanın. İleri astar: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Astar ters: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. ticari DNA arıtma kit kullanarak arındırmak PCR ürünü.
      Not: ticari kitleri silis sütunlara göre yordamı kullanarak verim > 100 ng/µL saf DNA'sı.
      3. Spektrofotometrik yöntemle DNA
    3. ölçü konsantrasyonu (260 Absorbans nm). 10 çalışma çözümleri için yukarıda belirtildiği gibi 10 11 kopya/µL DNA stokunun seyreltik 10, 10 9, 10 8 ve 10 7 kopya/µL.
      Not: PCR ürünü kopya sayısı ortalama molekül ağırlığı her bp için 650 Da olduğunu varsayarsak aşağıdaki denklemi göre hesaplanabilir:
      DNA kopya/µL = (ng/µL miktar * 6.022x10 23 kopya/mol) / (498 bp * BP 650 g/mol * 1 x 10 9 ng/g)
  2. manyetik parçacıklar
    1. parçacıklar tortu mıknatıs olmadan için izin ve süpernatant kaldırın. 1:20 mix v/v oranı ddd su ile manyetik parçacıkların (parçacıklar: su).
      Not: Birim dayalı yaklaşım MNPs ve MMPs eşit kitlelerin kolayca karşılaştırmak zor olduğundan manyetik parçacıklar miktarlarda tanımlamak için kullanılır.
  3. Bağlama arabellek
    1. 0,75 M sodyum asetat-HCL çözüm hızlı hazırlanması için (pH = 6), 3 M sodyum asetat 1 mL 1 mM HCL ile 3 mL karıştırın.
      Not: tüm çözümler bağlamada kullanılan 4'te saklanabilir ° C. Not düşük sıcaklık bağlama etanol çözüm durumunda özellikle önemli ölçüde artırır. Dikkatli bir şekilde daha iyi tekrarlanabilirlik için çözümler sıcaklığını ve tarama doğruluğunu kontrol.

5. Verimlilik, DNA yalıtım kullanarak kantitatif PCR test

  1. tarafından değiştirilmiş MMPs veya MNPs DNA izolasyon
    1. 96-şey plaka ve küçük hacimli deneyler için 96-şey plaka için özelleştirilmiş bir mıknatıs kullanın.
    2. Aşağıdaki bağlama çözüm karışımı kullanın: 8 µL modifiye MMPs veya MNPs, 10 µL sodyum asetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL % 85 etanol, 10 µL DNA (10 10 kopya çözüm).
    3. Mix pipetting tarafından iyi ve plaka 3 dk için mıknatıs yerleştirin. Plaka üzerinde mıknatıs olsa da, çözümü kaldırın ve 100 µL % 85 etanol yıkama ekleyin.
    4. Kaldır etanol.
      Not: birkaç saniye boyunca kurumaya etanol izin ama çatlaklar gösterme veya aşırı kuru parçacıklar izin vermeyin. Parçacıklar aşırı kuru onlar elüsyon çözüm ile çözülmeye zor olacak.
    5. Plaka mıknatıs kaldırın ve 40 µL elüsyon çözüm ekleyin. De pipetting tarafından karıştırın. Plaka üzerinde geri mıknatıs yerleştirin ve eluted DNA toplamak (~ 37 µL). Eluent-20 ° c kadar daha fazla çözümleme depolamak.
  2. Kantitatif PCR
    1. Haddad ve ark tarafından protokolüne göre stok DNA adım 4.1.1 xis gen kopyalarını ölçmek için hazırlamak için kullanılan astar kullanın. 10
    2. ana mix çözüm örnekleri test edilecek miktarına göre hazırlamak, sonra karışımı PCR tüpleri veya beyaz arka plan 96-şey plaka dağıtmak.
    3. Aşağıdaki miktarları 20 µL PCR karışımı tam bir birim için kullanın: 10 µL polimeraz / boya karışımı enterkalasyon (malzemelerin tabloya bakın), 2 µL DNA örneği, 2 µL ileri astar (10 µM), 2 µL ters astar (10 µM)
    4. Thermocycler göre aşağıdaki programı kurun: 95 ° C için 120 s, 40 döngüsü (95 ° C 15 s, 15 64 ° C s, 68 ° C 45 için s), 5 dk. 68 ° C
    5. Kullanma triplicates standartlar ve örnekleri, döngüsü eşik hesaplamak ve her örnek alındı DNA kopya sayısını tahmin etmek için standart bir eğri oluşturur. Burada kullanılan alet bu otomatik olarak gerçekleştirir.
    6. Burada, DNA'ın kopya sayısını toplam elüsyon birim (~ 40 µL) için tahmin edilmektedir. Alındı DNA çözüm (tamamen 10 11 kopya) bağlama için eklenmiş orijinal tutar karşılık gelen yüzdesi 0-100 aralığı dışında farklı.

6. DNA-manyetik parçacıklar bağlama Analysis DLS kullanarak

  1. Bağlama DNA
    1. büyük bir hacim için deneylerde (1,5 mL tüp), aşağıdaki bağlama çözüm karışımı kullanın: 96 µL modifiye MMPs veya MNPs, 120 µL sodyum asetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL % 85 etanol, 120 µL DNA (10 10 kopya çözüm) veya 120 µL Tris-HCL tampon (10 mM, pH = 8) denetimi için.
  2. Zeta potansiyel analizi
    1. hazırla iki ciltleme çözümleri, bir DNA ve başka Tris-HCL tampon 6.1.1. adımda anlatıldığı gibi denetim için. Kabarcıklar oluşumunu önlemek için dikkatli bir şekilde 800 µL bağlama karışımı bir tek kullanımlık pipet.
      Not: tek kullanımlık küvet yüzey zeta potansiyel (malzemelerin tablosuna bakın) ölçümlerinde kullanın.
  3. DLS cihazda ölçüm için aşağıdaki parametreleri kullanın: Smoluchowski modeli ile bir F(ka) 1.5, sıcaklık: 25 ° C, Kırılma indisi dağıtıcı faz (demir): Dağıtıcı ortamı (su) 2.344, Kırılma indisi: 1,333.
    Not: DNA-Manyetik Parçacık etkileşim oranı doğrudan çoğaltır ölçüm etkiler. Tek bir ölçüm aracı tarafından 60-70 s alır. Burada, enstrüman gecikme aralıkları ile 1 dk 10 ölçümler almak için talimat aldım. Kolaylık olması açısından, sonuçları zaman gösterilecek ilk okuma 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ve 18 dk =.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal sentez ve manyetik parçacıklar değiştirilmesi için burada açıklanan protokolünü kullanarak, altı manyetik parçacıklar sentezlenmiş ve DNA bağlama için analiz. Analiz bir özeti Tablo 1' de gösterilen. Partikül Büyüklüğü su ve bağlama çözüm karşılaştırarak, bu tüm parçacıklar 2-22 kıvrımlar tarafından çözüm bağlama içinde toplanan açıktır. Bazı parçacıklar daha fazla DNA varlığında daha fazla folds için toplanan; Ancak bu doğrudan kantitatif PCR (Tablo 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için zeta potansiyel ile manyetik parçacıklar DNA bağlanma açıklar teorik ilkeleri altında soru vardı. Protokol sentez ve manyetik nano tanecikleri ve microparticles değişiklik açıklar. DNA kontrolü ve bağlama çözüm hazırlanması için yöntemi ayrıca açıklanmıştır. İki strateji DNA-parçacık etkileşimleri ile taranması için burada gösterilir: kantitatif PCR ve DLS yaklaşıyor. DLS sağlar parçacıklar olarak fizikokimyasal değişiklikler üç göstergeleri: partikül büyüklüğü, polydispersity dizini ve zeta potansiyel. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çek Bilim Vakfı (proje GA CR 17-12816S) ve CEITEC 2020 (LQ1601) tarafından mali destek büyük ölçüde kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Demir(III) klorür hekzahidratSigma-Aldrich207926Manyetik parçacık sentezi
Demir(II) klorür tetrahidratSigma-Aldrich380024Manyetik parçacık sentezi
Demir(II) sülfat heptahidratSigma-AldrichF8263Manyetik parçacık sentezi
AsetonPenta10060-11000Manyetik parçacık sentezi
Sodyum sitrat dihidratSigma-AldrichW302600Manyetik parçacık sentezi
Tetraetil ortosilikatSigma-Aldrich131903Manyetik parçacık sentezi
(3-Aminopropil) trietoksisilanSigma-Aldrich440140Manyetik parçacık sentezi
Polietilenimin, dallı, ortalama Mw ~ 25.000Sigma-Aldrich408727Manyetik parçacık sentezi
Amonyum hidroksit çözeltisiSigma-Aldrich221228-M Manyetik parçacık sentezi
EtanolPenta71250-11000Manyetik parçacık sentezi
Potasyum nitratSigma-AldrichP6083Manyetik parçacık sentezi
Potasyum hidroksitSigma-Aldrich1.05012Manyetik parçacık sentezi
ow-moleküler ağırlık kesme membranı (Mw = 1 kDa)Spektrum laboratuvarlarıG235063Manyetik parçacık sentezi
Üstten Karıştırıcıwiteg Labortechnik GmbHDH. WOS01035Manyetik parçacık sentezi
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998Manyetik parçacık sentezi
SonikatörBandelin795Manyetik parçacık sentezi
MARKA UV küvet mikroSigma-AldrichBR759200-100EAKüvet boyut ölçümü için
UV küvet mikro için MARKA kapağıSigma-AldrichBR759240-100EABoyut ölçümü için küvet kapakları
Katlanmış Kılcal Zeta HücreMalvernDTS1070 Zeta potansiyeli ölçümü için küvet
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600Boyut ve zeta potansiyeli ölçümü için cihaz
Infinite 200 PRO
NanoQuant cihazı		Tecan396 227 V1.0, 04-2010DNA konsantrasyonunun ölçümü için cihaz
SYBR Yeşil Kantitatif RT-PCR KitiSigma-AldrichQR0100PCR kiti
Mastercycler pro S enstrümanEppendorf6325 000.013Thermocycler
MinElute kitiQiagen28004DNA saflaştırma kiti
Sodyum asetatSigma-AldrichS7670DNA bağlanması

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dynamic Light ScatteringZeta Potential AnalysisParticle Size MeasurementPolydispersity IndexDNA Isolation ProtocolMagnetic Particle SeparationQuantitative PCR AnalysisNanoparticle Surface Modification

İlgili makaleler