Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

7.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56836

⸱

30 Kasım 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

Bu makalede

Özet

Burada, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) embriyonik Zebra balığı quantitate için basit bir yöntem mevcut. Disosiye Zebra balığı HSPCs methylcellulose içinde içine olgun kan ayırt destekleyici faktörler ile kaplama. Bu kan algılama kusurları ve kolayca yapılacak eleme uyuşturucu sağlar sağlar.

Özet

Hematopoiesis, hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPCs) olgun kan oluşturan farklı hücre soy çok sayıda ayırmak önemli bir hücresel işlemidir. Yalıtım ve bu HSPCs tanımlaması zor çünkü onlar tanımlanmış ex post facto; Onlar sadece kendi farklılaşma belirli hücre soy içine sonra tanımlanabilir. Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) hematopoiesis eğitim için bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar rahimgeliştirmek ve 48 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından HSPC farklılaşma değerlendirmek için kesin HSPCs. deneyleri üretilip ve nükleer silahların yayılmasına karşı yetenekleri geliştirilmiştir, nakli kullanan ve sonraki sulandırma hematopoetik sisteminin yanı sıra özel transgenik hatları confocal mikroskobu ile görüntülenmesi. Ancak, bu deneyleri maliyet engelleyici, teknik olarak zor ve zaman alıcı birçok laboratuarlar için vardır. HSPCs değerlendirmek için bir vitro modeli geliştirilmesi olacak maliyet etkin, daha hızlı ve daha önce karşılaştırıldığında daha az mevcut zorluklar HSPC Biyoloji etkileyen mutagenesis ve uyuşturucu ekranlar hızlı bir şekilde değerlendirmek laboratuvarlar sağlayan yöntemlerini açıklanan. HSPCs değerlendirmek için bu roman vitro tahlil ayrışmış kaplama bütün Zebra balığı embriyo ve sadece HSPC farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı teşvik ekleyerek eksojen faktörler tarafından gerçekleştirilir. Embriyolar tek hücrelere ayrışmış ve onları bir tek progenitör hücre ortaya koloni oluşturan birimler (CFUs) oluşturmak neden HSPC destekleyici koloni uyarıcı faktör ile kaplama. Bu deneyleri moleküler yolları daha dikkatli incelenmesi HSPC yayılması, farklılaşma ve araştırmacılar omurgalı hematopoiesis temelleri ve onun bozukluk anlamak sağlayacak yönetmelik sorumlu izin vermelidir hastalık sırasında.

Giriş

Hematopoiesis olgun kan hücreleri bir canlının hayatta kalmak için gerekli sayıda yapma işlemidir. Bu farklılaşma hematopoetik kök hücre (HSCs) içeren bir anahtar gelişimsel olgun kan oluşturan gelişimsel olarak sınırlı hücre tipleri çeşitli içine süreçtir. Bu HSCs böylece sistem asla yorgun ve onlar ölene kadar erken embriyonik gelişme ısrar gerekir kendini yenilemesi gerekir. Omurgalılar, sürekli farklılaşma ve hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPCs) çoğalması yeterince sonrası Mitotik kan hücrelerinin çoğunluğu doldurmak için gerekli olan ve her gün geri dönüşümlü. HSCs ilk kısıtlı progenitör hücre alt kümeleri ayırt tarafından olgun kan hücreleri üretirler; sonunda T, B ve NK hücreleri üretmek, ortak lenfoid ataları (CLPs)1ve granülosit, eritrositler, makrofajlar ve megakaryocytes ortak Miyeloid ataları (CMPs)2 . Bu ataları belirli hücre soy oluşturmak için kararlı olan ve daha fazla daha fazla gelişim kısıtlı progenitör hücreler eritrositler ve trombosit veya granülosit oluşturmak myeloid erythroid ataları (milletvekilleri) gibi içine ayırt etmek bazofil, eozinofil, nötrofiller ve makrofajlar2üreten makrofaj ataları (GMPs). Belirlenmesi ve bu ataları yalıtma önemli moleküler yolları tanımlaması hematopoetik ayrımında yer sağlar ve lösemi gibi birçok hematopoetik hastalığın ortaya bu progenitör hücrelerin düzgün başarısız ayırt etmek.

Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) modeli sistemi embriyonik ve yetişkin hematopoetik çalışmaları için bir anahtar araştırma aracı haline gelmiştir. Zebra balığı için genetik analiz mükellef bulunmaktadır ve bir benzer damarlara ve insanlara hematopoetik sistem filogenetik en düşük omurgalı modeli türü bulunmaktadır. Zebra balığı embriyolar rahim geliştirmek ve 48 saat sonrası içinde fertilizasyon (hpf) oluşturmak HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebra balığı da çok bereketli, tek bir debriyaj 100 yumurta üzerinde döşeme kadın ile büyük ve deneysel çoğaltma için izin. Zebra balığı embriyo optik şeffaf, hematopoetik sistem mikroskobik görselleştirme için izin vardır. Zebra balığı HSCs runx1gibi işaretleme birkaç floresan transgenik satırlık: EGFP balık9, cd41: EGFP10, Balık ve kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 çift pozitif hayvanlar, HSC ortaya çıkması ve genişleme vivo içinde3,4,7,8, canlı, gerçek zamanlı görselleştirme için izin 9. Zebra balığı'nın hızlı nesil zaman ve geliştirme rahim mutagenesis çalışmalar11,12,13,14,15 ve uyuşturucu kullanımı yol açmıştır insan kanı bozuklukları için tedavi edici sözü tutun bileşikler için16,17,18,19,20 eleme. Genel olarak, koruma, varlığı ve kolay geliştirebilme imkanı transgenik hatları ve hızlı yenilenme zamanı hematopoetik sistem Zebra balığı hematopoetik çalışmaları için ucuz, hızlı, esnek ve ideal bir model haline getirdi.

İzole ve HSCs test birçok yöntem içinde memeli hematopoetik sistem geliştirdik. Müfettişler bir arada hücre yüzey reseptörlerinin yanı sıra HSCs21,22,23,24işaretlemek sızma boya25,26HSCs yeteneği yararlanmak için kullanabilir. Sonra onlar etiketlenir, Floresans aktif hücre (FACS) sıralama fiziksel ayırma sağlar. Bir hücreyi bir HSC kanıtlayan sözde HSCs dikim ve uzun vadeli, çok lineage sulandırma kan hücre tipleri olgun her şeyden gözlemleyerek endojen HSPCs yok etmek için bir ev sahibi hayvan irradiating gerektirir. Çok sayıda hücre yüzeyine antikorlar hematopoetik hücreler ve bağışıklık ekimi için eşleşen kolaylaştırmak doğuştan fare suşları karşı olduğundan bu deneyleri de farelerde, iş. Ancak, birkaç Zebra balığı hematopoietik hücre yüzeyine antikorlar oluşturulan kimlik ve HSCs yalıtım engelleyen27, olmuştur. Mark ve Zebra balığı HSCs yalıtmak için en yaygın bir hücre özgü organizatörü sıra floresan protein ifade sayede sürüş Transjenik hayvanlar ile yoludur. Çalışmalar görüntülenir ve HSCs dorsal aort ventral duvar bu tekniği3,4,8,9kullanan mikroskobu ile numaralandırılan. Ultraviyole Zebra balığı28,29 klonal suşları üretilip ve MHC eşlemeli hayvanlar30' u başarılı nakli gerçekleştirdik. Ancak, bu teknikler maliyet birçok laboratuvarları engelleyici vardır, teknik olarak zor ve zaman alıcı vardır. Bu sorunlara yönelik olarak laboratuvarları varlığı, nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ve HSPCs31,32,33ayırt etme kapasitesi için test etmek için birkaç vitro deneyleri üretilip, 34,35,36. Bu deneyleri yayılması ve HSPCs vitro31,32,33,34,35,36, kurtarma farklılaşma göster hematopoetik kusurları36ve keşfetmek ve sitokinler33,34,35test için verimli bir yöntem. Onlar da HSPC Biyoloji31,32için sorumlu genlerin tanımlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada, bu deneyleri bir adım daha ileri, HSPCs Nefelometri gelişmekte olan bir Zebra balığı embriyo içinde izin alıyoruz. Bu deneyleri de mutant hayvanlar HSPCs sayısında quantitate için kullanılması gereken ve hayvanlar yıkıcı hematopoetik ilaçlar ile tedavi. Aslında, bu deneyleri hızlı, mevcut birkaç teknik sorunlar ve HSPC numaraları quantitate, onların yayılması incelemek ve blok ayrımında araştırmak için ucuz yolu vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Chico, California eyalet Üniversitesi'nde Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Danışma Kurulu aşağıda açıklanan tüm yöntemleri onayladı.

1. çamaşır suyu 48 hpf Zebra balığı embriyolar

  1. 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastik kaplar oluşturmak 3 yıkama istasyonları: 1) ile 1 mL % 5 çamaşır suyu 1000 mL embriyo orta (E3; bkz: Tablo 1), 2) ile steril E3 ve 3) ile steril E3. Her kapsayıcı embriyo daldırın çözeltinin 500 mL olduğundan emin olun.
    Not: en az 10 embriyo test her koşul için gerekli olacaktır. Bu çamaşır yordamı 200 embriyo ağırlayacak.
  2. Transfer pipet ile embriyo bir çay süzgeci yerleştirin ve 5 dk. (ile embriyo içinde) çay süzgeci kaldırmak ve yıkama istasyonu #2 5 min için içine koyun yumurta yıkama istasyonu #1 daldırın; son 5 min için yıkama istasyonu #3 için yineleyin.
  3. Son yıkama sonra durulama embriyo çay süzgeci kısıtlayarak bu baş aşağı bir temiz 10 cm Petri kabına yavaşça embriyo durulama üzerinden kapalı steril E3 ile çay süzgeci ve transfer pipet.

2. Dechorionate embriyo

  1. Bir aktarım pipet ile kaldırın ve Petri kabına üzerinden mümkün olduğu kadar E3 atmak ve dechorionation proteaz (10 mg/mL) 500 μL embriyolar için ekleyin. 5 dk. hafifçe dokunun için tamamen chorions kaldırmak için Petri kabına yan oda sıcaklığında kuluçkaya.
  2. Serolojik pipet ile 20 mL steril E3 proteaz sulandırmak için ekleyin. Embriyo yerleşmek izin ve bir transfer pipet ile E3 kaldırın. Bu yıkama 3 kez dechorionation proteaz bütün izlerini kaldırmak için adımları yineleyin.

3. embriyo örnekleri hazırlama

  1. P1000 pipet kullanarak, 10 embriyo bir tek steril 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin.
  2. Bir pipet ile E3 kaldırmak ve atın.
    Dikkat: embriyo kolayca yerinden ve yıkama aşağıdakileri sırasında atılır gibi özenle pipet.

4. embriyo ayrılma için hazırlanması

  1. Laminar akış Hood'a örnekleri aktarmak ve yıkama embriyo 1 mL ekleyerek steril E3. Embriyo tüp altına yerleşmek ve süpernatant P1000 pipet ile kaldırmak izin verir. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin.
  2. Son yıkama sonra E3 kaldırmak ve atın. 10 mM dithiothreitol (DTT) 1 mL mukus kaplama (ve herhangi bir sporlar, mantar veya bakteri içinde sıkışmış) embriyonik Zebra balığı çevreleyen kaldırmak için E3 içinde ekleyin. Microcentrifuge tüp yatay olarak yatıyordu ve laminar akış başlıklı 25 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.

5. embriyo ayrılma

  1. Örnek 3 kez ile 1 mL steril DPBS (Ca2 + ve Mg2 +ile) yıkayın. Sonra son yıkama DPBS 500 μL (ile Ca2 + ve Mg2 +) ekleyin ve 5 mg/mL (26 U/mL) ayrılma proteaz 5 μL ekleyin.
    Dikkat: Bu enzim Ca2 + ve Mg2 +ihtiyacı var, bu yüzden DPBS Bu iyonlar içerdiğinden emin olun.
  2. Örnekleri üzerinde 60 dk. yer örnekleri laminar akış Hood için bir yatay orbital Çalkalayıcı-180 rpm'de 37 ° C'de kuluçkaya ve örnekleri tam ayrışmış kadar embriyo bir P1000 ile triturate.
    Dikkat: embriyo düzenli olarak ne zaman onlar ayrışmış haline belirlemek için denetleyin. Embriyo çözüm bir miktar doku mevcut olmalıdır; tamamen homojen olmaması gerekir. Mümkündür (bkz. ek şekil 1) HSPCs yok edecek aşırı Özet.

6. Disosiye embriyo hazırlanması

  1. Ayrışmış pipet 10 embriyo 5 mL polistiren üst rezervuarı üzerine alt tüp 35 mikron hücre süzgeç kap ile yuvarlak.
  2. Bir pipet ile durulama Petri tüp (Ca2 + veya olmayan Mg2 +) steril PBS ve 5 mL polistren tüp içeren transfer çözüm adım 6.1 hücrelerden filtre. Sıvı 4 mL 5 mL polistren tüp mevcuttur kadar yineleyin.
    Not: Ca2 + veya Mg2 + içerdikleri değil sürece PBS, DPBS veya diğer izotonik tamponlu çözümleri bu aşamada kullanılabilir
  3. 4 ° C ve 300 x g homojenize hücre örnek cips 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi. Bir pipet ile kaldırmak ve yuvarlak alt tüp süpernatant atın. Tüp alt kısmında pelleted hücreleri bozmak değil için dikkat ediniz. PBS 100 μL hücrelerde resuspend.

7. Methylcellulose hazırlanması

  1. 1 x tam methylcellulose (Tablo 1) hisse senedi çözüm üretmek ve 2.5 mL steril yuvarlak alt 14 mL tüpler 3 mL şırınga ve 16 G iğne ile ekleyin. Bir tüp test her koşul için kullanın.
  2. Sitokinler, küçük moleküller veya diğer ajanlar her örnek için soruşturma olması için ekleyin.
    1. Myeloid farklılaşma için uyarıcı faktör (Gcsf)34 methylcellulose orta % 1 sazan serum ve 0.3 mg/mL rekombinant Zebra balığı granülosit koloni ekleyin. Bkz: Svoboda vd. 37 sazan serum ve rekombinant sitokinler oluşturmak nasıl tam açıklama için.
    2. Erythroid farklılaşma için % 1 sazan serum ve 0.1 mg/mL rekombinant Zebra balığı Eritropoietin (Epo)38 methylcellulose Orta olarak ekleyin.
    3. Multilineage ataları incelemek için Epo ve Gcsf ekleyin.
      Dikkat: Orta bireysel kolonileri ayırt etmek viskoz olmayacak gibi sitokinler ve katkı maddeleri toplam hacminin % 10 daha fazla toplam değil.

8. Methylcellulose için Disosiye embriyo eklenmesi

  1. Bir pipet kullanarak 100 μL Disosiye 10 embriyoların rekombinant sitokinler ve sazan serum ile hazırlanmış methylcellulose yüzeyine ekleyin. Cap kapak ve yavaşça tam örnek homojenize girdap. Her tüp Şimdi 10 embriyo Disosiye dokusunun içermelidir.
  2. 3 mL şırınga ve 16 G iğneler, aliquot 1 mL örnek içine 2 ayrı 35 mm Petri yemekler kullanarak. Örnek tamamen Petri kabına dağınık olduğunu emin olun. Her örnek için yineleyin.
  3. 35 mm Petri yemekler hücreleri ile methylcellulose içinde bir 15 cm Petri kabına yerleştirin. Her 15 cm yemek için bir 35 mm Petri tabağı ile 5 mL steril su örnekleri nemlendirmek için ekleyin. 32 ° C ve % 5 CO2 ' de 7-10 gün kuluçkaya.

9. görselleştirme birimleri (CFUs) oluşturan Colony HSPC elde edilen

  1. 7 gün sonra kuluçka, 40-100 X görselleştirme ve numaralandırma örnekleri ters bir mikroskop üzerine yerleştirin. Bu noktada, bireysel kolonileri bir pipet ile izole ve boyama ve/veya gen analize tabi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Embriyonik Zebra balığı HSPC sayıları değerlendirmek için 48 hpf embriyo sindirilir, methylcellulose içinde eksojen destekleyici hematopoetik büyüme faktörleri ile kaplama ve 7 gün (şekil 1A) inkübe. 7 gün sonra koloni oluşturan birimler (CFUs) numaralandırılmış (şekil 1B) ve Görüntülü (şekil 1C) olduğunu. Eklenen farklı sitokinler kontrol ederek, bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zebra balığı modeli sistemi ilkel ve kesin omurgalı hematopoiesis çalışmak için verimli, etkili ve ucuz bir model haline gelmiştir. Hızlı, ucuz ve az teknik zorluklar deneyleri nesil küçük moleküller testi, mutant embriyo çözümlemek ve moleküler pathways HSPC Biyoloji için önemli elucidating için yararlı olabilir. HSPCs in vitro kaplama--dan yetişkin Zebra balığı mutagenesis, sitokinler ve hematopoetik hataları incelemek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bu çalışmalar kurar ama embriyonik Zebra balığ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından sağlanan finansman (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. için), Kaliforniya Devlet Üniversitesi programı için eğitim ve araştırma biyoteknoloji (CSUPERB: omurgalı hematopoetik niş D.L.S. için moleküler kontrolü) ve California State Üniversitesi Chico (için A.C.B.) lisansüstü ofisinden.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

2+2+
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Iscove'un MDM Kök Hücre Teknolojilerinde %10 Sığır Serumu Albümini 9300
DPBS14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Yaşam Bilimlerish30256.01
  DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV&
nbsp; Jambon F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLİkizler Biyo-Ürünler100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco yaşam teknolojileri15-630-080
Penisilin / streptomisin (5000 U / mL < br / > ve 5000 mg / mL) L-Glutamin (200 mM) ileCorning Mediatech30-009-CI
Gentamisin Sülfat 10 mL (50 mg / mL)Corning Mediatech30-005-CR
1.5 mL MCF tüpFisherBrand05-408-129
Luer kilitli 3 mL 23gx1 enjeksiyon iğnesiBD Safety Glide305905
5 mL polistiren hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüpCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL Polistiren yuvarlak tabanlı tüpCorning Falcon352057
10 mm polistiren easygrip Petri kabı CorningFalcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001ayrışma proteazı
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001dekoryonasyon proteazı
15 cm Petri kabıCorning Falcon351058
ABZebra Balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (ZIRC)ZL1zebra balığı türü
kullanılan Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563
Kalsiyum ve MagnezyumLife Technologies ile (

Kaynaklar

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644(2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hematopoetik Kök Projenitör HücrelerZebrafish Embriyo AnaliziIn Vitro HSPC AnaliziKoloni Oluşturan BirimlerEmbriyo Disosiyasyon ProtokolüMetilselüloz Koloni AnaliziHematopoetik Projenitör SayımıZebrafish Kan GelişimiSitokin Stimülasyon AnaliziHSPC Diferansiyasyon Proliferasyonu
Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.