Yöntem makalesi

Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

DOI:

10.3791/56836

⸱

30 Kasım 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) embriyonik Zebra balığı quantitate için basit bir yöntem mevcut. Disosiye Zebra balığı HSPCs methylcellulose içinde içine olgun kan ayırt destekleyici faktörler ile kaplama. Bu kan algılama kusurları ve kolayca yapılacak eleme uyuşturucu sağlar sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoiesis, hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPCs) olgun kan oluşturan farklı hücre soy çok sayıda ayırmak önemli bir hücresel işlemidir. Yalıtım ve bu HSPCs tanımlaması zor çünkü onlar tanımlanmış ex post facto; Onlar sadece kendi farklılaşma belirli hücre soy içine sonra tanımlanabilir. Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) hematopoiesis eğitim için bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar rahimgeliştirmek ve 48 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından HSPC farklılaşma değerlendirmek için kesin HSPCs. deneyleri üretilip ve nükleer silahların yayılmasına karşı yetenekleri geliştirilmiştir, nakli kullanan ve sonraki sulandırma hematopoetik sisteminin yanı sıra özel transgenik hatları confocal mikroskobu ile görüntülenmesi. Ancak, bu deneyleri maliyet engelleyici, teknik olarak zor ve zaman alıcı birçok laboratuarlar için vardır. HSPCs değerlendirmek için bir vitro modeli geliştirilmesi olacak maliyet etkin, daha hızlı ve daha önce karşılaştırıldığında daha az mevcut zorluklar HSPC Biyoloji etkileyen mutagenesis ve uyuşturucu ekranlar hızlı bir şekilde değerlendirmek laboratuvarlar sağlayan yöntemlerini açıklanan. HSPCs değerlendirmek için bu roman vitro tahlil ayrışmış kaplama bütün Zebra balığı embriyo ve sadece HSPC farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı teşvik ekleyerek eksojen faktörler tarafından gerçekleştirilir. Embriyolar tek hücrelere ayrışmış ve onları bir tek progenitör hücre ortaya koloni oluşturan birimler (CFUs) oluşturmak neden HSPC destekleyici koloni uyarıcı faktör ile kaplama. Bu deneyleri moleküler yolları daha dikkatli incelenmesi HSPC yayılması, farklılaşma ve araştırmacılar omurgalı hematopoiesis temelleri ve onun bozukluk anlamak sağlayacak yönetmelik sorumlu izin vermelidir hastalık sırasında.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoiesis olgun kan hücreleri bir canlının hayatta kalmak için gerekli sayıda yapma işlemidir. Bu farklılaşma hematopoetik kök hücre (HSCs) içeren bir anahtar gelişimsel olgun kan oluşturan gelişimsel olarak sınırlı hücre tipleri çeşitli içine süreçtir. Bu HSCs böylece sistem asla yorgun ve onlar ölene kadar erken embriyonik gelişme ısrar gerekir kendini yenilemesi gerekir. Omurgalılar, sürekli farklılaşma ve hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPCs) çoğalması yeterince sonrası Mitotik kan hücrelerinin çoğunluğu doldurmak için gerekli olan ve her gün geri dönüşümlü. HSCs ilk kısıtlı progenitör hücre alt kümeleri ayırt tarafından olgun kan hücreleri üretirl....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chico, California eyalet Üniversitesi'nde Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Danışma Kurulu aşağıda açıklanan tüm yöntemleri onayladı.

1. çamaşır suyu 48 hpf Zebra balığı embriyolar

  1. 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastik kaplar oluşturmak 3 yıkama istasyonları: 1) ile 1 mL % 5 çamaşır suyu 1000 mL embriyo orta (E3; bkz: Tablo 1), 2) ile steril E3 ve 3) ile steril E3. Her kapsayıcı embriyo daldırın çözeltinin 500 mL olduğundan emin olun.
    Not: en az 10 embriyo test her koşul için gerekli olacaktır. Bu çamaşır yordamı 200 embriyo ağırlayacak.
  2. Transfer pipet ile embriyo bir çay süzgeci y....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik Zebra balığı HSPC sayıları değerlendirmek için 48 hpf embriyo sindirilir, methylcellulose içinde eksojen destekleyici hematopoetik büyüme faktörleri ile kaplama ve 7 gün (şekil 1A) inkübe. 7 gün sonra koloni oluşturan birimler (CFUs) numaralandırılmış (şekil 1B) ve Görüntülü (şekil 1C) olduğunu. Eklenen farklı sitokinler kontrol ederek, bi.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı modeli sistemi ilkel ve kesin omurgalı hematopoiesis çalışmak için verimli, etkili ve ucuz bir model haline gelmiştir. Hızlı, ucuz ve az teknik zorluklar deneyleri nesil küçük moleküller testi, mutant embriyo çözümlemek ve moleküler pathways HSPC Biyoloji için önemli elucidating için yararlı olabilir. HSPCs in vitro kaplama--dan yetişkin Zebra balığı mutagenesis, sitokinler ve hematopoetik hataları incelemek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bu çalışmalar kurar ama embriyonik Zebra balığ.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından sağlanan finansman (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. için), Kaliforniya Devlet Üniversitesi programı için eğitim ve araştırma biyoteknoloji (CSUPERB: omurgalı hematopoetik niş D.L.S. için moleküler kontrolü) ve California State Üniversitesi Chico (için A.C.B.) lisansüstü ofisinden.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

2+2+

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Iscove'un MDM Kök Hücre Teknolojilerinde %10 Sığır Serumu Albümini 9300
DPBS14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Yaşam Bilimlerish30256.01
  DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV&
nbsp; Jambon F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLİkizler Biyo-Ürünler100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco yaşam teknolojileri15-630-080
Penisilin / streptomisin (5000 U / mL < br / > ve 5000 mg / mL) L-Glutamin (200 mM) ileCorning Mediatech30-009-CI
Gentamisin Sülfat 10 mL (50 mg / mL)Corning Mediatech30-005-CR
1.5 mL MCF tüpFisherBrand05-408-129
Luer kilitli 3 mL 23gx1 enjeksiyon iğnesiBD Safety Glide305905
5 mL polistiren hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüpCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL Polistiren yuvarlak tabanlı tüpCorning Falcon352057
10 mm polistiren easygrip Petri kabı CorningFalcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001ayrışma proteazı
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001dekoryonasyon proteazı
15 cm Petri kabıCorning Falcon351058
ABZebra Balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (ZIRC)ZL1zebra balığı türü
kullanılan Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563
Kalsiyum ve MagnezyumLife Technologies ile (

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hematopoetik K k Projenit r H crelerZebrafish Embriyo AnaliziIn Vitro HSPC AnaliziKoloni Olu turan BirimlerEmbriyo Disosiyasyon ProtokolMetilsel loz Koloni AnaliziHematopoetik Projenit r Say mZebrafish Kan Geli imiSitokin Stim lasyon AnaliziHSPC Diferansiyasyon Proliferasyonu

İlgili makaleler