Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Çalışmalar giderek artan sayıda edilmiş mikroRNA (miRNAs) Tanı ve Prognozunda kanserleri, biyolojik olarak keşfetmek veya izleme ve diğer hastalıklar tespit nonclinical ve klinik çalışmalar^1,2'^,3 . Nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) Bu teknik Mikroarray⁴ ve RNA sıralamanın tabanlı platformlar⁵daha fazla duyarlı olduğundan tek tek hedef miRNAs, değerlendirmek için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Genel olarak, miRNA ifade ΔCq yöntem⁶kullanarak örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri soruşturma için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, miRNAs dolaşan göreli miktar yardımcı programı onların küçük miktarlarda nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, teknik değişim zor çünkü farklı laboratuvarlar RT-qPCR deneysel protokoller farklı, hangi için tutarsız açar özelleştirebilir veya hatta çelişkili sonuçlar farklı çalışmalar, sonuçlarını karşılaştırmak yapar Farklı çalışmalar⁷.

Endişeleri yukarıda belirtilen içinde görüş-in mutlak miktar miRNAs vücut sıvıları içinde küçük miktarlarda değerlendirilmesi için daha uygun olabilir. Mutlak miktar yöntem bilinen ilgili hedef miRNA⁸için sırayla aynı sentetik RNA oligonucleotides konsantrasyonları oluşturulan standart bir eğri kullanır. Sağlık ve Çevre Bilimleri Enstitüsü (HESI) teknik komite genomik üzerinde son zamanlarda birden çok test sitede plazma miRNAs, mutlak ölçümleri sonuçlarını karşılaştırmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır. Sonuçlar miRNAs mutlak Nefelometri için standart bir protokol kullanarak birden çok test siteleri⁹arasında karşılaştırılabilir sonuç vermedi gösterdi. Bu da çalışmanın açıklanan RT-qPCR tahlil yöntemi birden çok miRNA hedefleri ve düşük ifade miRNAs tespiti yardım etmek için ön amplifikasyon çoğaltılmış analiz içeren HESI'ın standart iletişim kuralı için hemen hemen aynıdır.

Bu çalışmada, EDTA-plazma kandan hazırlanan bir sabit hacmi (200 µL) toplanan bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven (n = 50) kullanılan¹⁰yapıldı. Aşağıdaki iletişim kuralı ayıklama miRNA ve RT-qPCR öncesi amplifikasyon dahil olmak üzere, plazma numuneleri, hazırlanması için yordamı açıklar. Daha da önemlisi, böylece hedef miRNAs örneklerde miktarı nitelikli bir süreç ile birlikte onaylanabildiğini protokolü hakkında ek teknik bilgiler dahil, oldu. İlk olarak, her miRNA standart eğri onun miktar biyolojik örneklerde önce kendi bireysel algılama aralığı için doğrulandı. İkinci olarak, geçerli metodoloji kalitesini kapsamlı bir dış denetim (cel-miR-238) Cq değerlerinin yoluyla değerlendirilmiştir. Bu nedenle, bu platformun farklı çalışmalar veya laboratuar sonuçlarını karşılaştırmak için daha bilgilendirici ve güvenilir veri verir.

Temsilcisi sonuçları olarak 8 miRNAs profilleri bu rapora dahil burada açıklanan tahlil yöntemi. Bu miRNAs (miR-1, miR-208a, miR-208b ve miR-499a) kalp ve iskelet kası (miR-133a ve miR-206) kemirgenler ve insanlar^{3(miR-122 ve miR-192), karaciğer doku yaralanması ile potansiyel Emanet biyolojik ilişkili olarak önerilmiştir, 11,12,13}.

Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Daiichi Sankyo Co., Ltd. tarafından kabul edildi

1. numune hazırlama

1. Kan (en az 0.5 mL) cynomolgus maymunlar femoral ven EDTA 2 K içeren tüpler içine toplamak.
   Not: Bu antikoagülanlar sonraki PCR^14,15inhibe çünkü sitrat ve heparin kabul edilebilir değildir.
2. Toplanan örnekleri hemen buz ve plazma yalıtım koleksiyonunun 2 saat içinde için süreç üzerine koyun.
3. 10.000 x g 5 min için 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi.
4. Süpernatant Santrifüjü 16.000 x g hücre artıkları ve kalan trombosit kaldırmak 5 min için 4 ° C'de, ardından 2 mL microtube içine aktarın.
   Not: MiRNAs miktar önemli ölçüde trombosit kirlenme¹⁶tarafından etkilenebilir.
5. 200 µL aliquots süpernatant, taze 2 mL-mikrotüpler yerleştirin ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
   Not: Her örnek sabit bir hacim RNA çıkarma için kullanılır; Bu nedenle, aliquot hacmi tam olması gerekir.

2. RNA çıkarma

1. Donmuş numuneler (Kimden adım 1.5) buz çözme.
   1. Örnek buza RNA ayıklama sırasında soğuk tutmak. Lizis reaktif chill ve kullanmadan üzerinde buz önce kloroform.
2. Lizis reaktif, Sample (200 µL), fenol ve guanidin isothiocyanate monophasic solüsyon içeren 5 cilt (1000 µL) ekleyin ve 1 dk. için vortexing tarafından kuvvetle karıştırın.
3. 5 nM sentetik 5 µL eklemek Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
4. Kloroform 1 hacmi (200 µL) ekleyin ve 1 dakika vortexing tarafından kuvvetle karıştırın.
5. 2-3 dk için buz üzerinde tutun ve 12.000 x g 15dk için 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi.
6. Sulu faz için yeni bir microtube dikkatli bir şekilde aktarın.
   Not: herhangi bir organik faz (kırmızı) veya Interphase (beyaz) aktarılmaz. Toplanan sulu faz hacmi artan teknik değişim sonucu tutarsızlık işleme önlemek için tek tip olmalıdır. Sulu faz bu protokol için transfer her zamanki miktarı 650 µL oldu.
7. 1,5 birimleri (975 µL) etanol ve de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
8. Örnek bir karşılık gelen sütun ve 3 min vakum manifoldlar kullanarak için vakum kurutma ardından Bağdaştırıcı, içine aktarın. Örnek birim 700'den fazla µL ise, kalan çözüm işlemek için bu adımı yineleyin.
   Not: Sütun tabanlı RNA izolasyon vakum ve Santrifüjü yöntemi ile uyumludur.
9. Etanol 200 µL vakum kurutma için 1 dk ardından sütun ekleyin.
10. RWT arabellek 800 µL vakum kurutma için 2 dk ardından sütun ekleyin.
11. RPE arabelleği 800 µL vakum kurutma için 2 dk ardından sütun ekleyin.
12. 2.11 arasındaki adımları yineleyin.
13. Etanol 300 µL vakum kurutma için 1 dk ardından sütun ekleyin.
14. Sütun yeni bir microtube üzerine yerleştirin ve 12.000 x g 1 dk (15-25 ° C) oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi.
15. Sütun için yeni bir microtube aktarmak ve 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
16. Oda sıcaklığında (15-25 ° C) 3 dk ve 1 dk. için 8.000 × g oda sıcaklığında (15-25 ° C), santrifüj taşımaktadır.
17. Eluate sütun için yeniden uygulayın.
18. 2.16. adımı yineleyin ve-80 ° C'de eluate kullanmak kadar saklamak.

3. cDNA sentezi

1. Donmuş numuneler (Kimden adım 2.18) çözülme.
2. Hedef miRNAs için karşılık gelen sentetik RNA oligonucleotides bilinen konsantrasyonu hazırlayın.
   1. Sentetik RNA Oligonükleotid qPCR içinde standart bir eğri oluşturmak için kullanın. 1 x 10⁸ kopya/µL konsantrasyon hisse senedi çözüm depolama amacı ile hazırlanmıştır.
   2. Hisse senedi çözüm 10 kat 1 x 10⁷ kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 10⁵ kopya/µL (önceden yükseltilmiş örnekleri) çalışma çözüm standart eğri oluşturmak için en yoğun olarak elde etmek için sulandırmak. Genel olarak, standart eğri konsantrasyonları için önerilen Aralık 1 x 10⁷ ' ye 1 x 10² kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 10⁵ ' e 1 x 10⁰ kopya/µL (önceden yükseltilmiş örnekleri) dir.
3. Multiplex RT astar havuzu 20 x RT astar hedef miRNAs için eşit miktarda karıştırılarak hazır olun.
   Not: Şekil 2' de gösterildiği gibi 4 hedef miRNAs içeren bir havuzu 20 x RT astar her havuzda miRNAs karıştırılarak yapılabilir. Cel-miR-238 (dış denetimi) hedef miRNAs her tüpün içinde biri olarak dahil edilmelidir. Az 4 hedef miRNAs durumunda, 1/10 TE arabellek 20 x RT astar yerine eşit miktarda ekleyin.
4. RT tepki karışımı hazırlayın: (adımından 3,3), havuz 100 mM dNTPs dTTP ile 0,15 µL, ters transkriptaz (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT arabellek, RNase inhibitörü (20 U/µL) 0,19 µL 1 µL 3 µL RT astar ve su 4,16 µL nükleaz ücretsiz.
5. Mix 10 µL RT tepki pipetting tarafından RNA örnek (Kimden adım 3.1) veya oligonucleotides (Kimden adım 3.2) 5 µL karıştırın ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
6. Ters transkripsiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 16 ° C 30 dk, 30 dk, 42 ° C için tarafından takip son ters transkriptaz inactivation adım 5 dk. 85 ° C'de mağaza ters kopya etmek örnekleri-80 ° c kadar kullanmak.

4. preamplification (isteğe bağlı)

Not: Cq değerleri 35 veya daha sonraki qPCR yukarıda göstermek miRNAs önceden güçlendirilmiş.

1. Donmuş numuneler (Kimden adım 3.6) çözülme.
2. Sentetik RNA oligonucleotides RT ürün 10 kat seri dilutions olun; 1 x 10-⁵ 1 x 10⁰ kopya/µL standart eğri oluşturmak için.
3. Multiplex tahlil astar havuzu eşit birimleri (5 µL) karıştırılarak tahlil astar x 20 hedef miRNAs son konsantrasyon 200-fold seyreltilmiş her tahlil astar ile hazırlamak son hacmi 1000 µL'TE arabellek tarafından.
   Not: kimin hedef miRNAs sonraki qPCR öncesi amplifikasyon ve olanlar için cel-miR-238 (dış denetimi) olmadan tespit olabilir tahlil astar astar havuza dahil değildir.
4. Öncesi amplifikasyon tepki karışımı hazırlayın: 2 x kullanıma hazır preamplification reaktif, tahlil astar Havuzu (Kimden adım 4.3) 3.75 µL ve su nükleaz ücretsiz 6,25 µL 12.5 µL.
5. Mix 22,5 µL öncesi amplifikasyon tepki pipetting tarafından ters kopya etmek örnek (Kimden adım 4.1) veya oligonucleotides (Kimden adım 4.2) 2.5 µL karıştırın ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
6. Reaksiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 95 ° C 10 dakika; 15 s ve 60 ° C 4 dakika süreyle-80 ° C'de önceden yükseltilmiş örnekleri kullanmak kadar saklamak için 95 ° C 12 döngüsü tarafından takip ettim.

5. kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR)

1. Donmuş numuneler (Kimden adım 3.6 veya adım 4.6) çözülme.
2. Örnekleri 5-fold seyreltik steril su ile.
3. Sentetik RNA oligonucleotides türetilmiş RT ürünün 10 kat seri dilutions hazırlamak; 1 x 10⁷ ' ye 1 x 10² kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 10⁵ ' e 1 x 10⁰ kopya/standart eğriler oluşturmak için µL (önceden yükseltilmiş örnekleri).
4. QPCR reaksiyon karışımı hazırlayın: 2 x kullanıma hazır amplifikasyon reaktif, 20 x tahlil reaktif, ileri/geri PCR astar ve hedef miRNA için karşılık gelen yoklama içeren 1 µL ve 7 µL nükleaz ücretsiz su 10 µL.
5. 18 µL qPCR reaksiyon karışımından hızlı optik 96-iyi tepki tabakaları bana aktarın ve (Kimden adım 5.2 veya adım 5.3) seyreltilmiş örnekleri 2 µL kuyu ekleyin.
   Not: Örnekleri ve qPCR için standartlar çoğaltmaları ayarlanır.
6. Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve kısaca santrifüj kapasitesi.
7. Tepki gerçek zamanlı bir termal cycler çalıştırın: 20 95 ° C s 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip, 1 s ve 60 ° C 20 s.

6. veri analizi

1. Her örnek ile ilgili gerçek zamanlı termal cycler çalışan veri analiz yazılımı kullanarak ham kopya sayısını hesaplamak için.
   Not: Eşik satırı el ile çalışma, tüm plakaları "1.0" onların Cq vadilerin yasland tekrarlanabilirlik onaylamak için ayarlanır. Cut-off düzeyi Cq ayarla > 40 döngüleri.
2. Yinelenenleri alınan her örneğin ham kopya sayısı ortalamasını hesaplamak.
3. Düzeltme faktörü cel-miR-238 karşılık gelen tüp içinde tüm örnekleri kopya sayısı ortalama cel-miR-238 her örnek kopya sayısı bölünerek hesaplayın.
   Not: Şekil 2' de gösterildiği gibi cel-miR-238 (dış denetimi) dahil olmak üzere 4 hedef miRNAs kadar her tüp içerir. Bu nedenle, düzeltme faktörü karşılık gelen cel-miR-238 değerini kullanarak her tüp için hesaplanır.
4. Düzeltilmiş kopya sayısını her örnek (Kimden adım 6.2) ortalama ham kopya sayısı bölerek her örnek için düzeltme faktörü (Kimden adım 6.3) tarafından hesaplamak.
5. Tarafından her örnek (Kimden adım 6.4) ayarlanan ham kopya sayısını çarparak mutlak kopya sayısını hesaplamak için her örnek seyreltme faktörü.
   Not: Adım 5.2 türetilmiştir bu iletişim kuralı, "5" seyreltme faktörüdür.
6. Cq değerler günlük cDNA konsantrasyon karşı her seri seyreltme için arsa PCR güçlendirme yamaç üzerinden verimliliği hesaplayın.
   Not: verimlilik hesaplamak için formül; E = (10^(-1/yamaç) -1) x %100.
7. Cel-miR-238 E formülü kullanarak tüm örnekleri Cq değerleri kullanarak teknik değişim hesaplamak = (2 x amplifikasyon etkinliği)^{ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq))}.
   Not: Adımlar 6.5 ve 6.7 yordamı kalite değerlendirmesi için kullanılır.

RT-qPCR tarafından miRNA testin iş akışı ve kalite assessment
Şekil 1 qPCR10kullanarak kan örnekleri miRNA tahlil iş akışı gösterir. Deneyler kalitesini cel-miR-238 dış denetimi de dahil olmak üzere tarafından doğrulanabilir. Bu RNA ayıklama teknik farklılığı ortaya çıkaracaktır ve sonraki RT-qPCR işler. Bu çalışmada, Cq değerleri 50 örnekleri hesaplanan ortalama ± SD 21,0 ± 0,4 (Tablo 1) yapıldı. Cel-miR-238 öncesi amplifikasyon adım nedeniyle düşürülmüştü, Cq değeri olsaydı 24.2 ± 0,4 (Tablo 1). Burada açıklanan tahlil yönteminde teknik değişim ölçüde daha az 3 kat Cq değerleri arasındaki farkı temel alan tahmin edilmiştir. Bile dahil edilecek ek öncesi amplifikasyon adım vardı değişim derecesi tutarlı kaldı. Fare, sıçan ve insan bu laboratuvar (veri gösterilmez) gerçekleştirilen gibi bu değerleri farklı hayvan türleri, diğer örnekleri için o ile uyumlu.

Hedef miRNA için standart eğri tespit aralığı

Örnekleri öncesi yok amplifikasyon

1 x 107 kopya/µL konsantrasyonları, sentetik RNA oligonucleotides ters kopya etmek (RT) ürün seri olarak sonraki qPCR önce düşürülmüştü. Bu serisi öncesi amplifikasyon adım tespit tüm biyolojik örneklerin tutarlı kapsama sağlamış standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. 1 x 102 kopya/µL konsantrasyon standart örnek Cq değerleri genellikle yakın düzeyleri için her hedef miRNA kesik vardı. Bu nedenle, algılama sınırı 1 x 102 kopya/µL (şekil 3) olarak tahmin edildi.

Önceden yükseltilmiş örnekleri

Öncesi amplifikasyon gerektiren örnekleri tespit aralığı belirlemek için iki farklı dizi seyreltilmiş örnekleri, şekil 4' te gösterildiği gibi karşılaştırıldı. Standart eğri A oluşturmak için önce ön amplifikasyon adım RT ürünün seri dilutions hazırlanmıştır. O zaman önceden güçlendirilmiş standartları dizi sonraki qPCR için kullanıldı. Standart eğri B oluşturmak için ilk seyreltme önceden yükseltilmiş örnekleri 1 x 105 kopya/µL bir konsantrasyon için yapılmıştır. Bu standart eğrileri görünüşte farklı algılama sınırları (şekil 5) gösterdi. Standart eğri B doğrusal Aralık 1 kopya/µL aşağı artış olsa da, standart eğri A konsantrasyonlarda 10'dan daha az belirli amplicons için kullanılamadı2 veya 103 kopya/µL (şekil 5). Bu sonuç miRNAs son derece küçük miktarlarda bile öncesi amplifikasyon adım ile değerlendirildi önerdi. Cq değerler olduğunda buna ek olarak, önceden yükseltilmiş örnekleri dikkatle yorumlanmalıdır > 30, çünkü önceden yükseltilmiş örnekleri algılama sınırları kapatmak için bu değeri. Bu nedenle, bir kural olarak, standart eğri B burada, tespit aralığı belirledikten sonra açıklanan yöntemi yalnızca standart araziler yetersiz sayıda kullanarak önlemek için kullanılmıştır.

Sonuç olarak, miktar (LLOQ) alt sınırı 102 kopya/µL miRNAs (şekil 3 ve şekil 5) çoğu için yapıldı. Sadece daha yüksek bir LLOQ miR-1 gösterdi (103 kopya/µL) (şekil 5). Ortalama amplifikasyon verimliliği yaklaşık % 90, korelasyon katsayısı (R2) ile 0.998 1.000 için değişen standart eğrilerinin olduğunu. Doğru bir RT-qPCR tahlil işaretlerinden bir doğrusal R2 0,98 ve PCR güçlendirme verimliliğini 90-017daha büyük veya eşit olarak kabul edilir. Bu nedenle, tahlil standart eğrileri kalitesini doğrulandı.

MiRNAs küçük miktarlarda için ön amplifikasyon etkileri

Cq değerleri 35 veya daha yüksek yukarıda sonraki qPCR gösterdi miRNAs önceden güçlendirilmiş. Bu yordamı miRNAs küçük miktarlarda tespiti gelişmiş. Örneğin, pre amplifikatör miR-206 Cq değerleri (Ortalama ± SD) azalma 27.0 ± 2.2 37,9 ± 1.9, süre önceden güçlendirilmiş miR-206 oldu. Yinelenen ölçüm çiftleri arasında önemli farklılıklar öncesi güçlendirilmiş örneklerinde yüksek Cq değerlerinde (şekil 6) tespit edildi. Buna ek olarak, önceden yükseltilmiş örnekleri hemen hemen eşit değerler çoğaltmaları (şekil 6) gösterdi. Bu sonuçlar bu öncesi amplifikasyon örnekleri küçük miktarlarda durumlarda daha doğru ve güvenilir veri sağlamak için etkili olacağını belirtti.

Plazma miRNAs cynomolgus maymunlar içinde profilleme

Kurulan tahlil platformu kullanarak, 50 cynomolgus maymunlar vardı üzerinden 8 miRNAs (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208a, miR-208b ve miR-499a) plazma seviyeleri (Şekil 7)10analiz. MiR-1, miR-206 ve miR-499a öncesi amplifikasyon onların düşük ifade seviyeleri nedeniyle gerekli ise bu tahlil, miR-122, miR-133a ve miR-192 öncesi amplifikasyon tespit edildi. Ancak, ne miR-208a ne de miR-208b bile öncesi güçlendirme ile saptanabilir. Verileri normal dağıldığı değil; Bu nedenle, bir Logaritmik dönüşüm onların ortalama ve standart sapma hesaplamak için gerçekleştirilen. Muayene, miR-122 miRNAs arasında en yüksek ortalama plazma seviyesi (5.71 x 104 kopya/µL), (20) ile küçük bir Dinamik Aralık gösterdi. Buna ek olarak, büyük dinamik aralıkları (581-fold), miR-1 için gözlendi miR-133a (971-fold) ve miR-206 (426-fold).

Resim 1 : RT-qPCR tarafından miRNA testin şematik iş akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Şematik iş akışı miRNA tahlil, ters transkripsiyon. 4 hedef miRNAs içeren bir havuzu 20 x RT astar her havuzda miRNAs karıştırılarak yapılabilir. Cel-miR-238 (dış denetimi) hedef miRNAs her tüpün içinde biri olarak dahil edilmelidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: kalite değerlendirmesi miktar döngüsü (Cq) değerlerinde cel-miR-238. Teknik varyasyonlar miR-238 her tahlil Cq değerlerinden değerlendirildi. Öncesi amplifikasyon olmadan (sol) adımı veya elli örnekleri (sağ) karşılık gelen iki gruba ayrıldı. Varyasyon E formül kullanılarak hesaplanan = (2 x amplifikasyon etkinliği)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Amplifikasyon etkinliği standart eğrinin eğimini hesaplanır. Öncesi amplifikasyon adım gerektiren örnekleri öncesi amplifikasyon adımı sırasında seyreltilmiş (miR-238 kendisi önceden yükseltilmiş değildi). Bu rakam bizim rapor10değiştirildi.

Şekil 3 : Arsa pre amplifikatör örnekleri için standart eğrilerinin. Standart eğrileri (N = 3, yinelenen) günlük konsantrasyon Cq. lineer regresyon analizi hesaplanan amplifikasyon verimliliği için karşılık gelen yamaç belirlemek için karşı komplo tarafından oluşturuldu. Standart eğrileri miR-122 (üst), miR-192 (orta) ve miR-133a (alt) test mesafeden Cq ve konsantrasyon arasında doğrusal ilişki gösterdi. Standart eğrileri hata çubukları üç bağımsız deneyleri bir standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Yordam önceden yükseltilmiş örnekleri için standart eğriler oluşturmak için. (Standart eğri A) Sentetik oligo (1 x 105 kopya/µL) temsilcisi bir konsantrasyon transkripsiyonu, standart örnek 10 kat seri seyreltme dizi hazırlayarak takip geri vitese gitti. Önceden güçlendirilmiş bu standartları için sonraki qPCR kullanılmıştır. (Standart eğri B) Sentetik oligo (1 x 105 kopya/µL) temsilcisi bir konsantrasyon transkripsiyonu ve önceden güçlendirilmiş geri vitese gitti. O zaman, standart örnekleri 10 kat bir seri seyreltme serisi sonraki qPCR önce hazırlanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Önceden yükseltilmiş örnekleri için standart eğrileri A ve B arsa. Standart eğri A (n = 1, yinelenen) ve standart eğri B (n = 3, yinelenen) günlük konsantrasyon Cq. lineer regresyon analizi hesaplanan amplifikasyon verimliliği için karşılık gelen yamaç belirlemek için karşı komplo tarafından oluşturuldu. (Üst) Standart eğri B (düz çizgi) Cq ve konsantrasyon arasında doğrusal ilişki miR-1 test mesafeden gösterdi, ancak standart eğri bir (noktalı çizgi) 1 x 102 kopya/µL, görünüşe göre non-spesifik amplicon gösterdi. (Orta ve alt) Standart eğri bir (noktalı çizgi) hiçbir amplicon 1 x 102 kopya/µL ya da alt, konsantrasyonları gösterdi standart eğri ise B (düz çizgi) gösterdi Cq ve konsantrasyon arasında doğrusal ilişki miR-499a test mesafeden ve miR-206. Standart eğri B, hata çubukları üç bağımsız deneyleri bir standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : Güçlendirme arsa pre amplifikatör ve önceden yükseltilmiş örnekleri için. (Üst) miR-206 temsilcisi örneklerinde (A, B, C) olmadan (üst), amplifikasyon arsa veya öncesi amplifikasyon (alt) ile. Ölçüler içinde yinelenen tuzağa düşürüldük. Çoğaltmaları pre amplifikatör örnekleri, özellikle yüksek Cq örnekleri (A ve B) olarak ayarlamak iki örnek arasındaki farklar vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 : Plazma mikroRNA (miRNAs) cynomolgus maymunlar mutlak değerini. MiRNAs ifade düzeyleri nokta araziler tarafından gösterilir. Ortalama ve değer ve üstü (gri kutusunda gösterilen) demek, iki standart sapma aşağıdaki için logaritmik dönüşüm sonra belirlenmiştir. Bu rakam bizim rapor10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması vardır.