Yöntem makalesi

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

DOI:

10.3791/56855

⸱

22 Ağustos 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Southwest Hospital, Third Military Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart bir Western blot Protokolü 500 hematopoetik kök veya progenitör hücre olarak birkaç analiz etmek için optimize edildi. En iyi duruma getirme dikkatli hücre örneği işleme, tüpleri arasında aktarımlarını sınırlama ve doğrudan Laemmli örnek arabellek hücrelerde lysing içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik kök hücre (HSCs) nadir hücreleri, fare kemik iliği sadece 25.000 ~ fenotipik içeren uzun süreli kullanıma HSCs. Batı blotting iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve HSCs (500-15000 hücreleri) az sayıda analizi için uygun. Fenotipik HSCs saf, doğru sayılır ve Laemmli örnek arabellekte doğrudan lysed. Hücreler eşit sayıda içeren Lysates Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz edildi ve leke hazırlanmıştır ve standart Western blot protokolleri takip işlenir. Bu iletişim kuralı, 2000-5000 kullanarak HSCs düzenli olarak analiz edilebilir ve bazı durumlarda veri olabildiğince az 500 hücreler, çoğu yayınlarda bildirdi 20,000-40,000 hücrelere kıyasla olarak elde edilebilir. Bu iletişim kuralı diğer hematopoetik hücrelerin genel olarak uygulanabilir olmalıdır ve az sayıda hücre standart Laboratuvar yordamları kullanarak rutin çözümleme sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik kök hücre (HSCs) tüm kan soy çıkmasına neden olabilir kendini yenileyerek hücrelerdir. Onlar nispeten nadir biyokimyasal analizler zor işleme kemik iliği hücrelerinde vardır. Akış Sitometresi gibi nadir hücrelerin analiz etmek için uygun yaklaşımlar göreli miktarda hücre yüzey işaretleyicileri ve intraselüler protein miktarının için son derece yararlı olmuştur. Ancak, çözümleme hücre içi proteinlerin hücre permeabilization yordamlar antikor erişimi etkinleştirmek için kullanımı gerektirir ve tüm hücre yüzey epitopları bu yordamları1,2hayatta. Buna ek olarak, farklı protein izoformlarının veya bölünme ürünleri arasında ayırımcılık antikorlar genellikle akış sitometresi için kullanılabilir değildir ve bu nedenle müfettişler, hala analiz türleri kesin Batı lekesi güvenmek.

Hücre lysates Western blot Analizi çoğu laboratuarlarında rutin bir işlemdir. Hücre epitopları hücre yüzey moleküllerin korumak yerel koşullar altında saf ve hücre lysates daha sonra hazırlanan ve analiz. Ancak, nüfus tarafından Western blot nadir İlköğretim hücredeki protein analizi hayvanlar yeterince hücre elde etmek için çok sayıda ötenazi gerektirebilirsiniz. Birkaç adım için küçük ayarlamalar yaparak, geleneksel Batı blotting Protokolü proteinler HSCs (500-15.000 bağlı olarak faiz protein) nispeten az sayıda tespit edebilir başardı. Doğru bir şekilde dikkatle hücre kaybı, en aza indirmek için borular arasında hücre aktarımlarını azaltma hücre Pelet işleme hücreleri, sayım ayarlamaları dahil ve hücrelerin konsantre bir yükleme ile tanımlanmış bir dizi lysing arabellek içeren proteasome ve fosfataz inhibitörleri. Yayımlanmış raporların çoğu Batı lekesi 20.000 veya daha fazla HSCs3,4,5,6,7ile elde içerir; Bu basit bir prosedür hücreleri ve deneysel hayvan 4 ve 40 kat arasında tarafından eşdeğer veri üretmek için gereken sayısını azaltır. Protokol sonuçları hücre başına bazında değil, bir iç kontrol normalleştirmek için tasarlanmıştır. Bu veri bir iç kontrol için normalleştirilmiş Eğer göz ardı edilebilir protein düzeyleri olarak genel indirim olarak algılanmasını sağlar. Bir hücre başına bazında normalize önemini gen ifadesi verileri8analiz için tanımlanmıştır ve Western blot tarafından protein miktarının aynı ilke geçerlidir. Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı herkes için az sayıda hücre analiz etmek gerek yararlı olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanım ve bakım kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Yordamı fare hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSCs ve HPs) analizi için geliştirilmiş, ancak diğer hücre popülasyonlarının analiz için adapte edilebilir.

1. akış sitometresi yalıtım HPs ve fare HSCs

  1. Fare kemik iliği hücreleri edebiyat6' açıklandığı gibi hasat.
    Not: Resim 1 ve Şekil 2sunulan verilerde, kemik iliği C57BL/6J fareler hasat.
  2. Soy tükenmesi kemik iliği hücrelerinin üreticinin yönergelerini izleyerek bir fare soy tükenmesi kit kullanarak gerçekleştirin.
  3. Hücre yüzey işaretleyicileri ilgi karşı antikor içeren hücreler açıklanan7kuluçkaya. Resim 1 resim 2görüldüğü deneylerde antikorlar Sca-1, Kit, Flt3 ve lineage (LIN) işaretleri Mac1, Gr1, CD3e, B220 ve Ter119 için kullanılır.
  4. 2.000-20.000 Lin- Sca1 sıralama+Seti+ Flt3- hücreleri (HSCs) veya Lin-Sca1-Seti+ hücrelere 1,5 mL Eppendorf tüpleri 0.1 mL fosfat içeren (HPs) arabelleğe alınmış serum %2 fetal sığır (PBS) Serum (FBS).
    Not: Resim 1 ve Şekil 2gösterilen veri için akış sitometresi ile 70 µM başlığı kullanarak hücreleri sıralanmış. 1.4 mL en fazla toplama birimdir.

2. numune hazırlama

Not: Bu adım önemlidir. Örnek çok dikkatli bir şekilde işlemek. Süpernatant kaldırırken, hücre Pelet değil rahatsız etmek için dikkatli olun.

  1. Santrifüj 1.5 mL tüpler, sallanan bir kova rotor 4 ° C'de sıralanmış hücreleri içeren hücreden süpernatant ile yaklaşık 100 µL hariç hepsi 5 dk. Kaldır 500 x g cips çok nazikçe bir pipet ve 20 µL damlalıklı bahşiş kullanarak. Pelet rahatsız etmeyin.
    1. Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve sıralanmış örnek hacmi az 0.2 mL ise, hücreleri ilk düşük bağlama 0.2 mL PCR tüpleri Santrifüjü önce aktarın.
    2. Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve birim 0.2 mL den fazla ise, spin 5 min için bir santrifüj-4 ° c, 500 x g, ile aşağı hücreleri ve tüm 200 µL süpernatant, kaldırın. Kalan 200 µL süpernatant, in pelleted hücreleri yeniden askıya sonra hücreleri 0.2 mL PCR tüpleri için aktarmak ve spin aşağı tekrar. Tüm ama 20-30 µL Pelet sonra ikinci spin kaldırmak ve hücreleri yeniden askıya alma.
  2. Tüp süpernatant sol hücrelerde resuspend. Gerekiyorsa, ek PBS % 2 eklemek FBS/PBS (de %2 sığır serum albumin (BSA) kullanabilirsiniz / PBS veya PBS yalnız) bir konsantrasyon 5 elde etmek için x104 5 x 105 hücre/ml.
    Not: hücre sayar kullanım hücreler askıya alma için kullanılan birim tahmin etmek için sitometresi tarafından toplanan.
  3. 2-5 µL yeniden askıya alınan hücrelerin (üreticinin yönergeleri izleyerek) bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre9kullanarak bir doğru hücre konsantrasyonu belirlemek için kullanın.
  4. Bir birimi yeniden askıya alınan hücrelerin hücrelere yeni 1,5 mL tüpler için istediğiniz sayıyı içeren aktarın. Şekil 1' deki deneme için 2.000, 1000 veya 500 HSCs veya HPs transfer edildi. Hücreler için istediğiniz sayıyı Western blot tarafından elde edilen sinyal gücüne bağlıdır ve ampirik olarak belirlenir. 20 µL veya 100 µL Eppendorf pipet ucu kullanarak aktarımı gerçekleştirmek.
  5. Bir sallanan kova rotor 4 ° c, 500 x g, 5 min için hücrelerde santrifüj kapasitesi.
  6. 100 x hisse senedi çözümler üretmek için üreticinin yönergelerine göre proteasome ve fosfataz inhibitörleri olarak DMSO geçiyoruz.
  7. 2 x Laemmli örnek arabellek distile su eşit miktarda ile yapılabileceği 4 x Laemmli örnek arabellek sulandrarak hazırlayın. 2 x inhibitörleri 2 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri 100 x stokunun uygun bir miktarda ekleyin.
    Not: 2 x Laemmli örnek arabellek önceden yapılabilir, ama proteasome ve fosfataz inhibitörleri hemen ve 2 x Laemmli örnek arabellek (plus inhibitörleri) hücre Pelet hücreleri, koşullar için açıklandığı gibi eklemeden önce aşağıdaki adımda eklenmelidir.
  8. Dikkatli bir şekilde hücre Pelet ve hücre Pelet ile tüp içinde kalan süpernatant için süpernatant bir bölümünü kaldırmak, 2 x Laemmli örnek arabellek artı 500 son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri eşit bir birim ekleme hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği.
    Not: 20 µL toplam hacmi 2.000 hücrelerde Pelet süpernatant ile 18 µL kaldırmalısınız hücreleri (adım 2.6) centrifuging sonra adım 2.5, bir tüp ve kalan süpernatant ile 2 µL aktarırsanız Örneğin, (2 µL) eşit hacmi ekleyin 2 x 500 hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için Laemmli örnek arabellek.
  9. Lysate en kısa zamanda üretmek için Pelet resuspend. Bu noktada, örnekleri hemen SDS-sayfa jelleri electrophoresed veya olabilir ek sıvı N2 içinde donmuş ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.

3. Elektroforez

  1. Lysates 95 ° c ısı bloğundaki veya kaynar suda 5 dk için ısı.
  2. 1-40 µL (500 kadar 20.000 hücre eşdeğerleri içeren) lysates, kullanarak standart protokolleri10SDS-sayfa jelleri 100V adlı electrophorese.
    Not: Lysate jel yüklenen hacmi arzu edilen sinyal oluşturmak için gereken hücre sayısı tarafından belirlenir ve ilgi ve antikor kalitesini protein bereket on bağlı olacaktır. Şekil 1 ' deki verileri 2.000, 1000 ve 500 hücre karşılıkları lysate ile elde edilmiştir. Kuyu genişliğini 3 mm için 1,5 mm. 1.5 mm diş olabilir aralığında piyasada bulunan bir tarak makas kullanarak daha geniş dişleri ile kesilmelidir.

4. transfer ve blok

Not: standart protokolleri11takip bir Western blot gerçekleştirin. Belgili tanımlık merdiven burada kısaca özetlenmiştir:

  1. Distile su ile 10 s sonra yıkama membran kısa bir süre için bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran metanol ile pretreat.
  2. Protein SDS-sayfa jel aktarım cihazları üreticisi tarafından sağlanan el kitabındaki yönergeleri takip membran aktarın.
  3. Devri, blok membran ile %5 Sığır serum albumin (BSA) PBST içinde 2 mL (PBS % 0.1 ile ara) standart protokolleri11takip 4 ° C'de gecede.

5. antikor etiketleme

  1. Membran ile antikor gecede 4 ° C'de satıcı tarafından önerilen antikor dilutions kullanarak bir shaker üzerinde kuluçkaya.
    Not: Biz HSCs ve HPs ve karşılık gelen antikor dilutions için doğrulanmış, antikorlar malzemeler tablo gösterilir. Standart prosedürler8kullanarak antikor etiketleme gerçekleştirin.

6. algılama

  1. Membran 3 kez, PBST her makinaya oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
  2. Membran ile Oda sıcaklığında 1 min için geliştirilmiş Kemiluminesan tampon 2 mL kuluçkaya. Üreticinin yönergeleri, veya autoradiography film ve film işlemci aşağıdaki bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri algılayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

500-2000 arıtılmış HSCs ve HPs temsilcisi sonuçlarını resim 1 ve Şekil 2gösterilir. Şekil 1 ' deki β-aktin sinyal az 500 HSCs üzerinden tespit edilebilir ve bir fare kemik iliği HPs saf. Lysates 1.5 mm kuyu yükleme yükleme 3.0 mm kuyu içine daha çok daha güçlü bir sinyal gönderici 500 HPs üretilen unutmayın. Şekil 2 olduğunu EIF4G bir Western blot ve Rps6 fosforilasyon (...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot spesifik proteinlerin ve sinyal yolları aktivasyonu dokular veya hücreleri tespit için ortak bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yordam ufak değişiklikler getirerek, biz düzenli olarak 15 farklı proteinler (Malzemeler tablo) 15.000 HSCs ve bazı durumlarda olabildiğince az 500 HSCs olarak tespit edebildik. The Most bu protokolündeki kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde hücreleri sayma, 2) tüpler arası sayısını en aza indirme ve 3) doğrudan Laemmli örnek arabellek içeren hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bildirmek için hiçbir çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 CA149976 (N.A.S) Bu eser desteklenen verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
sodyum dodesil sülfat (SDS)Fisher ScientificBP166-500SDS-PAGE
TEMEDFisher ScientificBP150-20SDS-PAGE
%30 Akrilamid Bis çözeltisiBio-Rad1610158SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8TEKNOVAT1588SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8TEKNOVAT1068SDS-PAGE
Amonyum PersülfatFisher ScientificBP179-25SDS-PAGE
mini-protean 3 tarakBio-Rad1653360SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra HücreBio-Rad1658005EDUSDS-PAGE
Transfer SistemiBio-Rad1704155EDUtransfer
PowerPac HC Güç KaynağıBio-Rad1645052EDUelektroforez
Görüntüleme SistemiBio-Rad1708195sinyal algılama
4x Laemmli Numune TamponuBio-Rad1610747EDUnumune hazırlama
10x Tris/Glisin/SDS Elektroforez TamponuBio-Rad1610732EDUelektroforez
2-MerkaptoetanolBio-Rad1610710EDUnumune hazırlama
RTA Mini PVDF Transfer Kiti, 40 için lekelerBio-Rad1704272transferi
Proteaz İnhibitörü KokteylSigma11697498001numune hazırlama
Fosfataz İnhibitörü KokteylleriAltın BiyoteknolojiGB-450-1numune hazırlama
EIF4GHücre sinyalizasyonu2469WB antikoru, 1000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referansı (şekil): Şekil 2
p-Rps6Hücre sinyalleme4858WB antikoru, 1000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): Şekil2
aktin (HRP konjuge)abcamab49900WB antikoru, 500 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:5000
referans(şekil): Şekil 1, Şekil2
LC-3Abcamab4839415000 hücrede doğrulanmış WB antikoru
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans(şekil): ref5 (Şekil 5)
S6Hücre Sinyali: 15000 hücre
antikor konsantrasyonunda doğrulanmış 2317 WB antikoru: 1:1000
referans(şekil): ref5 (Şekil 4)
4EBP1Hücre Sinyali9644WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans(şekil): ref5 (Şekil 4)
p-4EBP1Hücre Sinyali2855WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (Şekil 4)
TSC2Hücre Sinyali15000 hücrede doğrulanmış 4308 WB antikoru
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (Şekil 4)
HSP90Hücre Sinyali15000 hücrede doğrulanmış 4877 WB antikoru
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (Şekil 5)
PTENHücre Sinyali9188WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (FigS1)
mTORHücre Sinyali298315000 hücrede doğrulanmış WB antikoru
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (FigS1)
p-mTORHücre Sinyali5536WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (FigS1)
PP2ABHücre Sinyali4953WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans(şekil): ref5 (FigS1)
p-AMPKahücre sinyalizasyonu2535WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:1000
referans (şekil): ref5 (FigS1)
aktinSanta Cruzsc-47778WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır
antikor konsantrasyonu: 1:3000
referans (şekil): ref5 (Şekil 4)
soy tükenme kiti (fare)Miltenyi Biotec130-090-858hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin saflaştırılması
LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-041-305hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin saflaştırılması
SCFPeproTech250-03fosforilasyon stimülasyonu
APC-Cy7 c-kit antikoruThermoFisherA15423hücre sıralama
anti-B220ThermoFisher48-0452-82hücre sıralama
anti-CD3eThermoFisher48-0031-82hücre sıralama
anti-Mac1ThermoFisher48-0112-82hücre sıralama
anti-Gr1ThermoFisher48-5931-82hücre sıralama
anti-Ter119ThermoFisher48-5921-82hücre sıralama
1.0 mm Entegreli Ara Plakalar SpacersBio-Rad1653311SDS-PAGE
BSAAraştırma Ürünleri UluslararasıA30075membran bloke edici
serumAtlanta BiologicalsA12450orta takviye
hücre sayacıInvitrogenAMQAF1000hücre sayma
hemositometresiThermoFisher  S17040hücre sayma
flimDenville ScientificE3012sinyal algılama
tıbbi film işlemcisiKonicaSRC-101Asinyal algılama
Süper Sinyal Batı Femto Maksimum Hassasiyet Substrat TeorisiScientific34096sinyal algılama
Allegra X-15R Santrifüj (Rotor SX4750A)Beckman CoulterX-15Rörneği hazırlık
BLUEstain protein merdiveniAltın BiyoteknolojiP007-500elektroforez
hücre sıralayıcıBDFACSAria IInumune hazırlama
IncublockDenville ScientificI0510elektroforezi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SDS PAGEH cre Say mLaemmli rnek TamponuFosfataz nhibit rProteazom nhibit rGeli tirilmi Kemil minesansBeta AktinAk Sitometrisi

İlgili makaleler