Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

DNA metilasyonu, çoğunlukla, DNA metil-Transferazlar tarafından (DNMTs) katalize sitozin karbon 5 konumunu 5-metilsitozin (5mC) oluşturmak için bir metil grubu eklenmesi anlamına gelir. 5mC büyük bir epigenetik işareti kez transkripsiyon baskı, x kromozomu inactivation ve transposon¹susturmak için sinyalleri memeli genom, görür. DNA metilasyonu iptali on-Elf translocation (TET) protein ailesi tarafından aracılık ettiği. TET enzimler ait demir (II) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxycytosine (5caC) 5mC art arda gelen oksidasyon katalizler 2-oxoglutarate bağımlı dioxygenases. TET-aracılı 5mC oksidasyon ek bir memeli genom üzerinde epigenetik kontrol katmanı uygular. TET keşfi TET proteinlerin biyolojik fonksiyonları ve onların büyük katalitik ürün 5hmC açıklayacak epigenetik alanındaki yoğun ilgi yol açtı. 5hmC sadece bir ara TET-aracılı aktif DNA demethylation²sırasında^,3,4, değil ama aynı zamanda kararlı bir epigenetik görevi görür^{5,6,7,8 işareti} . DNA hydroxymethylation son derece gen ekspresyonu ile ilişkili ve anormal olmasına rağmen DNA hydroxymethylation bazı insan bozuklukları^9,10,11ile nedensel ilişkileri ilişkili değişikliklerdir DNA üzerindeki epigenetik değişiklikler ve fenotipleri arasında sık sık kurulacak zorlu kalır, hangi kısmen doğru eklemek veya DNA genom içinde kaldırmak için güvenilir aracı olmadığı için atfedilen zamansal ve mekansal tanımlı Çözünürlük.

Burada aracı (çalışmaların nedensel ilişkileri karşı karşıya engel aşmak için elma şarabı) arasında DNA hydroxymethylation ve gen transkripsiyonu remodeling bir kimyasal indüklenebilir epigenome kullanımı raporu Tasarım varsayımına dayanır bu TET2 katalitik etki alanını (TET2CD) memeli hücrelerinde ifade iki etkin olmayan parçaları içine bölünmüş ve enzimatik işlevi bir kimyasal indüklenebilir dimerization yaklaşım ( alarak geri yüklenebilir Şekil 1A). Böl-TET2CD sistemi kurmak için TET2CD, Cys-zengin bölge ve düşük karmaşıklık bölge¹²yoksun TET2-DNA kompleks bildirilen kristal yapısı temelinde bir çift iplikli β-helix (DSBH) kat oluşan altı sitelerinin seçilmesini. Sentetik bir gen Rapamycin indüklenebilir dimerization modülü FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) kodlama ve rapamycin^14,15, kendi kendine sıyırmada peptid T2A birlikte memeli hedefinin FKBP rapamycin bağlayıcı etki (FRB) polipeptid sıra^16,17, tek tek TET2CD içinde seçilen split siteleri içine eklenir. TET2 seçimi mühendislik hedefimiz olarak aşağıdaki önemli noktalar üzerinde temel alır. TET2 ilk, somatik mutasyonlar DNA hydroxymethylation eşlik eden azalma ile sık sık Miyeloid bozuklukları ve kanser¹⁰için kaçınılması gereken duyarlı sitelerin yararlı bilgiler sağlar, dahil olmak üzere insan hastalıklarda gözlenir ekleme. İkinci olarak, TET2 katalitik domain, özellikle düşük karmaşıklık bölgesinde, büyük bir kısmı böylece bize bir simge durumuna küçültülmüş Böl-TET2 indüklenebilir epigenetik değişiklikler için tekne etkinleştirme enzimatik işlevi¹², gereksiz. 15 yapıları eleme sonra onun enzim aktivitesinin en yüksek rapamycin indüklenebilir restorasyon memeli sistemdeki sergilenen bir yapı seçilmiş ve elma şarabı¹⁸belirlenmiş. Biz burada indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik rapamycin ile yeniden elde etmek için mCherry öğesini elma suyu nasıl kullanılacağını açıklar ve elma şarabı aracılı 5hmC üretim modeli hücresel sisteminde HEK293T doğrulamak için üç yöntem mevcut.

1. hücre kültürü, plazmid Transfection ve kimyasal indüksiyon

1. Kültür ile % 10 ısı inaktive fetal sığır serum, 100 U/mL penisilin ve streptomisin %5 CO₂37 ° C'de takıma bir yapisan hücre kültürünü (örneğin, insan embriyonik böbrek HEK293T hücre) (DMEM), Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda.
2. Elma şarabı plazmid hücrelerle transfect.
   1. En az 18 h transfection önce tohum 0,3 x 10⁶ hücre uygun DMEM 2.5 ml 6-şey tabak içinde iyi ve hücreleri 37 ° C'de % 60-80 confluency ulaşmak için gecede kuluçkaya.
   2. Kullanmadan önce oda sıcaklığına transfection reaktif önceden ısıtmak.
   3. Yer 250 µL serum-Alerjik orta steril bir tüp.
      Not: Bu miktar % 80'i confluency ile 6-şey plaka için hazırlanmıştır. Gerekirse, orantılı olarak orta miktarda plakaları veya hücre sayıları boyutları göre belirleyin.
   4. Elma şarabı¹⁸ veya TET2 katalitik domain kodlama plazmid 2,5 µg Ekle (TET2CD pozitif kontrol olarak)^12,13 serum-Alerjik orta içine ve yavaşça karıştırın pipetting tarafından.
   5. Transfection reaktif 7.5 µL seyreltilmiş DNA karışıma ekleyin ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
   6. 20-30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya.
   7. Önceden ısıtılmış medya değiştirmek ve karışımı drop-wise wells için ekleyin ve hafifçe DNA karışımı ve transfection reaktifi olarak dağıtabilmenizi hücre kültür plaka sallamak.
   8. Hücreleri ve karışımı bir gecede kuluçkaya ve ortamı ile taze tam DMEM 2 ml içeren transfection reaktif değiştirir.
3. Kimyasal indüksiyon
   1. Seyreltik 2 mM (DMSO içinde çözünmüş) rapamycin stok uygun tam orta 20 µM bir konsantrasyon için.
   2. Transfected hücreleri 200 son bir konsantrasyon ulaşmak için 2 mL ortamda muhafaza seyreltilmiş rapamycin 20 µL eklemek nM.
      Not: 48 h için kuluçka sonra hücreleri 5hmC nesil miktar veya başka herhangi bir aşağı akım uygulama için hazırsınız demektir. Gerekirse, indüksiyon verimliliği hücreleri daha fazla 5hmC miktar aşağıda açıklandığı gibi her 3 h yaptırmayı tarafından izlenen ve şekil 1' de gösterilen.
   3. İçin daha iyi miktar 5hmC indüksiyon verimlilik tohum hücreleri 3 saatte izlemek için kuyu ayırın.

2. miktar Rapamycin kaynaklı 5hmC üretim Immunostaining tarafından

1. 5hmC ayirt boyama
   Not: PBS plaka tüm hücrelerde kapsayacak şekilde 3 N HCl ile % 4 paraformaldehyde, %0.2 yüzey aktif (örneğin Triton X-100) oluşan fiksasyon çözüm yeterli miktarda ekleyin. Örneğin, 500 µL çözüm için iyi bir 6-şey plaka yeterli. Oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirin.
   1. Hücreleri gidermek için 15 dakika ortam sıcaklığı, rapamycin tedavi hücrelere PBS içinde %4 paraformaldehyde ekleyin. Kontrol grubu için hücreleri mCherry-elma rapamycin tedavisi olmadan ifade kullanın. Kışkırtmak değil.
      Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir. Uygun koruma giymek.
   2. Sabitleştirici çözüm atın. Sabit % 0,2 yüzey aktif hücre zarının permeabilize için PBS için 30 dk içinde hücrelerle kuluçkaya.
   3. Permeabilization çözüm atın. 3 N HCl permeabilized hücrelere ekleme ve 15dk için DNA'yı denatüre kuluçkaya.
   4. HCl. ekle 100 mM Tris-HCl arabelleğe (pH 8.0) pH nötralize için 10 min için hücreleri atın.
   5. Tüm çözüm atın. Hücreler için PBS ile iyice yıkayın 3 - 5 kez. PBS iyice kaldır.
      Not: PBS her yıkama adım için yeterli miktarda ekleyebilirsiniz. Örneğin, PBS 1 mL 6-şey plaka için yeterli.
   6. Hücreleri % 1 BSA ve yüzey aktif (örneğin ara 20) PBS içinde nazik sallayarak ile 1 h için % 0.05 oluşan engelleme arabelleği ekleyerek engellemek.
   7. Engelleme çözüm atın. Seyreltilmiş 5hmC antikor (1: 200) hücrelere ekleme ve oda sıcaklığında 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
   8. PBS hücrelerle 15dk için üç kez yıkayın.
   9. Seyreltilmiş fluorophore (FITC) Ekle-Birleşik hücreler için ikincil antikor (1: 200) ve 1 h için kuluçkaya.
   10. PBS hücrelerle üç kez kalan antikorlar kaldırmak için kapsamlı bir şekilde yıkayın.
   11. 250 ng/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (çekirdek leke DAPI) 5 dk. Kaldır boyama çözüm ekleyin.
   12. Slayt veya cam-alt kültür çanak confocal görüntüleme için immunostained hücreler bağlayın. Temsil edici bir sonuç şekil 1Badımında gösterildi.
2. Akış Sitometresi
   Not: 96-şey yuvarlak alt plaka boyama yordamını kullanın. Genellikle, 150 µL reaktifler, her şey için yeterli olur.
   1. FACS arabellek (PBS % 1 BSA, 2 mM EDTA ile) transfected ve rapamycin kaynaklı hücrelerinde resuspend. Kontrol grubu için rapamycin tedavisi olmayan hücreler elma şarabı ifade kullanın.
   2. Fix ve hücreleri adım 2.1 içinde açıklandığı gibi permeabilize.
   3. 2 N HCl 10 min için DNA denatüre hücrelere ekleyin.
   4. HCl. Nötrleştir atın ve adım 2.1 içinde açıklandığı gibi hücreleri engellemek.
   5. Seyreltilmiş anti-5hmC antikor (1: 200) hücrelere ekleme ve oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya
   6. FACS arabellek içeren hücreleri üç kez yıkayın. FACS arabellek iyice kaldır.
   7. Seyreltilmiş fluorophore (FITC) Ekle-Birleşik Floresans aktif hücre (FACS) analiz sıralama için ikincil antikor (1: 400) ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
   8. FACS arabellek içeren hücreleri üç kez yıkayın.
   9. Örnekleri FACS analiz için hazırsınız demektir. Temsil edici bir sonuç şekil 1 c-Dgösterildi.

3. nokta-leke tahlil 5hmC ve 5-metilsitozin (5mC) ölçmek için tutarlar

1. Bir ticari DNA ekstraksiyon kiti kullanarak transfected ve rapamycin kaynaklı hücrelerden genomik DNA izole et. Kontrol grubu için rapamycin tedavisi olmayan hücreler elma suyu transfected kullanın.
2. Isı 80 ° C ve öncesi emmek nitroselüloz membran çift distile H₂O ve o zaman 6 x 10 min için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek vakum fırın.
3. 60 µL bir 96-şey PCR plakasına eşit miktarda DNA (Toplam 2 µg TE arabelleği) yükleyin. Geri kalan wells TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 30 µL ekleyin.
4. İki kat seri dilutions çözüm 30 µL satır 1 2 satırda aynı sütun konumu aktararak 96-şey plaka üzerinde dikey olarak yapmak. Tekrar karıştırın ve sınır ulaşan kadar sonraki satırda wells çözüm 30 µL aktarmak.

Kimyasal indüklenebilir 5mC 5hmC dönüşüm immunostaining tek hücre düzeyinde, transfected (mCherry-pozitif) hücre popülasyonlarının Akış Sitometresi Analizi veya şekil 1' de gösterildiği gibi daha nicel bir nokta-leke tahlil tarafından doğrulanabilir. TET2 veya TET2CD, katalitik etki alanı çalışma pozitif bir denetim kullanılmıştır. Başvurular 18-20 rapamycin kaynaklı değişiklikler genom geniş eşleme ile ilgili daha fazla bilgi için bkz: 5hmC ve Kromatin erişilebilirlik.

Şekil 1: elma suyu-aracılı indüklenebilir DNA hydroxymethylation HEK293T hücrelerdeki. (A)tasarım (elma şarabı) remodeling kimyasal-indüklenebilir epigenome Aracı'nın üzerinde bir bölünme dayalı TET2 enzim. (B) temsilcisi immunostaining sonuçları HEK293T hücrelerdeki elma suyu-mCherry (önce üst paneli) ifade ve sonra (alt paneli) rapamycin tedavisi (200 nM). Yeşil, 5hmC, kırmızı, elma suyu-mCherry, mavi, DAPI çekirdekleri boyama. Ölçek çubuğu 10 µm. (C) elma suyu miktar-aracılı 5hmC Üretim Akış Sitometresi Analizi tarafından =. HEK293T hücreleri ile elma suyu-mCherry TET2CD-mCherry (pozitif kontrol) olarak, transfected bir anti-5hmc birincil antikor ve FITC etiketli bir ikincil antikor ile lekeli. Sadece TET2 (mCherry) ve 5hmC (FITC) çift-pozitif hücreler Geçişli ve belirtti. (D) saat ders 5hmC elma şarabı ifade HEK293T hücrelerde kimyasal indüklenebilir üretim yönetim veya rapamycin geri çekilmesi aşağıdaki (200 nM). n = 5, 5hmC düzeyleri HEK293T hücrelerdeki rapamycin indüklenebilir değişiklikleri ölçmek için ortalama ± SD (E) nokta-leke tahlil olarak gösterilen veriler. HEK293T hücreleri ile bir elma suyu veya TET2CD yapısı transfected. 5hmC bilinen bir miktarı ile sentetik Oligonükleotid olumlu bir denetimi (üst satırı) olarak kullanılmıştır. Etilen giriş DNA'ın toplam miktarda boyama mavi tarafından görüntülenmiştir yükleme Denetim Masası'ndaki alt gösterildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.