Heparinized StarPEG Nanocoating ile pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği

Hücre tabanlı terapiler tedavi edici etkinliği düşük hücre saklama ve zavallı hayatta kalma^1,2sınırlıdır. Yüzey mühendisliği enzimatik manipülasyon yoluyla hücre, hücre tedaviler sonucu geliştirmek için peptid konjügasyon, bioorthogonal kimya, Biyomalzemeler ile fiziksel kapsülleme olmuştur istismar^{3,4, 5,6,7,8,9,10}. Geçerli protokol yüzey Mühendisliği yaşayan hücrelerin hücre yüzeyine bir ultrathin heparin dahil starPEG (heparin-PEG) nanocoating uygulayarak bir "kolay-için-evlat edinin" yöntemi kullanarak elde amaçlamaktadır. Pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği sunuldu burada of Langerhans adacıkları ve geçerli klinik adacık nakli aşağılayıcı sonuçlarının heterojen yapısı nedeniyle örnek olarak.

Nitekim, klinik adacık nakli Şu anda izole adacıkları karaciğer portal ven içine direkt enjeksiyon tarafından gerçekleştirilir ve bu yordamı yalnızca donör malzeme ve düşük terapötik etkinlik azlığı nedeniyle seçici hastalar için kullanılabilir ¹¹. aljinat ve inflamatuvar ilgili fibrozis^{12, kimyasal dengesizlik nedeniyle ideal daha az olmasına rağmen geleneksel, aljinat adacık kapsülleme ve yüzey modifikasyonu için en sık kullanılan biomaterial oldu 13}. Ayrıca, 100-200 µm arasında değişmektedir doğal adacıkları büyüklüğüne göre aljinat-adacık microcapsules hangi oksijen fizyolojik akışkanın mesafesini aşan daha büyük, 400 ve 800 µm arasında değişen vardır. Açıkorur adacık kapsülleme, i.e., adacıkları adacık hacminin önemli değişiklik olmadan Kapsüllenen, sonra geliştirilmiştir. Böylece, nanomembranes birikimi oluşur PEG, tetrafluoroethylene, silikon membran ya da çok katmanlı nanocoating ("katmanı tarafından katmanı" [LBL] tekniği olarak da bilinir) bildirdi, geliştirilmiş vitro adacık hayatta^{14 kaynaklanan ,15,16,17,18}, LBL yaklaşım gerektirir olmasına rağmen genellikle geniş adacıkları dönem adacık canlılığı uzlaşma olabilir birden çok katman ifade için teslim . Ayrıca, biomembrane katmanlar veya nanomembranes ve adacık yüzey arasındaki hidrofobik etkileşimler elektrostatik veya kovalent Hofstede dayanan nanomembranes istikrarsızlık da endişeleri^9,14 yol açmaktadır ^{, 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26}.

İntraportal adacık nakli, tedavi sonucunu encumbers başka bir sınırlayıcı faktör implante adacıkları ile kan trombosit toplamada kaynaklanan, doğrudan temas neden anlık kan-aracılı inflamatuar (IBMIR) reaksiyondur, Koagülasyon ve bağışıklık bir olumsuz etkisi veya istenmeyen hücresel etkinleştirme⁹. Bu sorunları gidermek için yıldız şeklinde Polietilen glikol (starPEG) oluşan bir ultra-ince nanocoating kurulan biyouyumluluk ve çok yönlülük adacık malzeme konut olarak hazırlanmıştır. Heparin, son derece sülfatlanmış glikozaminoglikan da starPEG nanocoating anti-inflamatuar, Anti-koagulant özelliklerini ve pro-anjiogenik büyüme faktörleri^{22işe alma tarafından vaskülarizasyon kolaylaştırmak yeteneği için kuruldu, 23}.

1. Starpeg Nanocoating Heparin dahil imalatı

1. Heparin succinimidyl süksinat (Heparin-NHS) sentezi
   1. Heparin 0.69 g tartmak ve buz gibi soğuk deiyonize su 2.0 mL geçiyoruz.
   2. NHS 0,23 g tartmak ve bir yuvarlak alt şişe buz gibi soğuk deiyonize suyla 0.5 ml geçiyoruz.
   3. EDC 0,77 g ağırlığında ve bir yuvarlak alt şişe buz gibi soğuk deiyonize suyla 0.5 ml geçiyoruz.
   4. Bir yuvarlak alt şişesi NHS ve EDC çözümlerinde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika oda sıcaklığında bankta karışık çözüm bırakın.
   5. 5,031 x g aşırı EDC ve NHS kaldırmak 10 min için EDC NHS karisimin santrifüj kapasitesi.
   6. 30 mL soğuk etanol karışım çözüm ve 10 dk santrifüj 5,031 x g de ekleyin.
      1. İki kez tekrarlayın.
2. StarPEG-heparin nanocoating hazırlanması
   1. 1.0 mL % 10 (w/v) starPEG-(NH₂)₈ yuvarlak alt şişe ekleyin.
   2. 0.67 mL % 10 (w/v) heparin-NHS aynı yuvarlak alt şişe ekleyin.
   3. StarPEG-(NH₂)₈ ve heparin-NHS karışık çözüm bir kuluçka viskozite ile net bir çözüm elde etmek 20 dk için 25 ° C'de yerleştirin.
      Not: yıldız - PEG-(NH₂)₈ deiyonize su 5(6) - ile desteklenmiş dağıldı dışında fluorescently etiketli heparin (FAM-heparin) gerekli deneyler için üretim yordamı aynıdır carboxyfluorescein N- succinimidyl ester %0,1 (molar oranı) starPEG-(NH₂)₈. )
3. Heparin-PEG nanocoating Fourier Transform Infrared spektroskopisi (FT-IR) tarafından karakterizasyonu
   1. Başlamadan önce akik harç, havaneli ve peletleme aygıtı (13 mm çapı ile küçük diskleri) aseton ve deiyonize su ile durulayın. Cam ürünleri kullanmadan önce fırında kuru.
   2. Mix yaklaşık 0.1-%1 heparin-PEG örnek ile ince KBr toz 200 – 250 mg.
   3. Akik havanda heparin-PEG ve KBr karışımı yerleştirin ve ince 2 µm çapı küçük granül haline ezmek.
   4. Karışımı bir Pelet cihaza aktarın. Yüksek sıkıştırma Kuvvetleri (8 T/cm²) 1-2 saydam peletleri oluşturmak üzere min için bir vakum uygulanır.
   5. Örnek Pelet Pelet aygıt uzak yavaşça çekin. Çatlaklar uğramak değil o kadar da zor değil çekmek dikkat et.
   6. Örnek granül bir Fourier Transform Infrared örnek kimyasal yapısı belirlemek için spektroskop için çok dikkatli bir şekilde aktarın.
4. Heparin-PEG nanocoating tarafından taranan elektron mikroskobu (SEM) gözenekli iç yapılarının incelenmesi
   1. Aşağıdaki yordamlar için standart 48-şey hücre kültür plaka ve pipetler hazırlayın.
   2. Heparin-PEG kopolimer çözüm 48-şey kültür plaka kuyu pipette.
   3. Plakayı 24 h için-80 ° C'de dondurmak.
   4. Lypophilize-50 ° c vakum ortamında örnekleri (0,1 Pa) 24 h için.
   5. Örnekleri bir alüminyum saplama yapışkan yüzeyi boyunca yayıldı.
   6. Altın örnekleriyle ceket ve iç gözenekli yapıları gözlemlemek için taranan elektron mikroskobunda gözlemlemek.
5. Heparin-PEG nanocoating yüzey atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından incelenmesi
   1. Temiz silis cam slaytlar piranha çözüm ile (%70 H₂SO₄, %30 H₂O₂) 40 dk 80 ° C'de.
   2. Slaytlar metanol 10 dakika ve sonra Toluen 10 min için solüsyon içeren temizleyicide.
   3. Slayt Vakum kurutma tarafından kuru.
   4. 3-aminopropyl-triethoxysilane çözüm (%2 Toluen), yavaşça sallayın bol slaytlar yıkayın.
   5. Metanol Toluen 10 dk sonra 10 min için slaytları solüsyon içeren temizleyicide.
   6. Yer 100 µL % 3 heparin-PEG çözüm bir çift pipet kullanarak slaytları yüzey üzerinde.
   7. Heparin-PEG bir atomik kuvvet mikroskobu altında yüzey inceleyin (bir rezonans frekansı 50-80 kHz, kuvvet sabit 0,350 N m 21, ipucu RADIUS 600 nm).

2. fare adacık yüzey Mühendisliği Heparin-PEG Nanocoating ile

1. Fare adacık yüzey kaplama heparin-PEG nanocoating ile
   1. Daha önce bildirilen Jüpiter¹⁹' collagenase sindirim ve histopaque degrade arıtma tarafından fare adacıkları ayıklayın.
   2. 1.5 mL tüp diseksiyon mikroskop altında 200 adacıkları futbolla.
   3. PBS 500 µL adacıkları ve 1 dk. için 503 x g , santrifüj ekleyin.
   4. Süpernatant alın ve heparin-PEG çözüm 250 µL ekleyin ve karışımı 10 dk. pipet yukarı ve aşağı adacıkları heparin-PEG çözüm ile karıştırmak izin vermek için buz üzerinde tutun.
   5. 1 dk. için 503 x g , santrifüj.
   6. Süpernatant kaldırın ve PBS 500 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet.
   7. Vasıl 503 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın ve daha fazla kullanmak için adacıkları tutun. Heparin-PEG ile kaplı fare adacıkları sınavına FAM-heparin-PEG aşağıdaki adımları adacık kaplama için kullanıldı.
2. FAM-heparin-PEG nanocoating ile kaplı fare adacıkları incelenmesi
   1. 1-2 mL RPMI boyalı adacıklar için % 10 fetal Sığır serum ile takıma 1640 ekleyin ve bu adacıkları bir ücret steril bakteri kültürü tabak içine aktarın.
   2. FAM-heparin-PEG nanocoating boyalı adacıklar bir ters floresan mikroskop altında Morfoloji ve floresan sinyallerini gözlemlemek.

3. işlevi Heparin-PEG, Sigara kaplı adacıkları göre fare adacıkları kaplı

1. Heparin-PEG kaplı fare adacıkları canlılık
   1. 20 heparin-PEG kaplı fare adacıklar BitTorrents ve 96-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine koyun.
   2. Her şey için 20 heparin-PEG kaplı fare adacıkları ile toplam 10 Wells doldurun.
   3. 20 noncoated denetim adacıklar BitTorrents ve aynı 96-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine koyun.
   4. Her şey için 20 noncoated denetim adacıkları ile toplam 10 Wells doldurun.
   5. RPMI % 10 fetal Sığır serum ile adacıkları içerir 96-şey plaka her kuyuya takıma 1640 200 µL koymak ve kültürü korumak için 14 gün.
   6. 2 günde adacık kültür ortamı değiştirin.
   7. Adacıkları ile yaşamak/kültür 14 gün sonunda kiti boyama ve bir ters floresan mikroskop altında gözlenen ölü bir tedavi.
   8. PI⁺ (kırmızı) hücreleri her adacık bir ters floresan mikroskop altında içinde saymak.
2. Heparin-PEG revaskülarizasyon fare adacıklar içinde vitro kaplı
   1. Kültür plaka dahil olmak üzere tüm deneysel plastik ön serin ve pipet kullanmadan önce en az 12 h ipuçları.
   2. Soğutma bir yastık üzerinde 24-iyi yer. Buz 250 µL eklemek soğuk büyüme faktörü indirgenmiş Matrigel 24-şey hücre kültür plaka her kuyuya. Yer için en az 30 dk 4 ° C'de kaplamalı 24-şey plaka.
   3. Matris çözüm buzdolabında ayarlama iken fare pankreas adacık endotel Mile Sven 1 (MS1) hücreleri trypsinize.
      1. Tüm kültür medya doku kültürü balonun kaldırın. Şişesi 5 mL de PBS ile yıkayın.
      2. PBS kaldırın ve tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Standart bir kuluçka 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
      3. Hücreleri ayırmak ve 5 mL serum desteklenen medya ekleyin şişeye dibine hafifçe dokunun.
   4. 15 mL santrifüj tüpü ve 5 min için 1000 x g , santrifüj hücreleri toplamak.
   5. Süpernatant almak ve 5 mL PBS de ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet.
   6. 1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant alır.
   7. Serum takıma DMEM ortamı tüpün içine ekleyin ve 50.000 hücreleri matris çözüm kaplı 24-şey plaka her kuyuya temel olarak belirler.
   8. 5 heparin-PEG boyalı adacıklar veya noncoated denetim adacıkları her kuyunun içine ekleyin.
   9. DMEM medya serum takıma iyi başına 500 µL toplam her kuyunun içine ekleyin.
   10. Hafif bir mikroskop altında 4 h ve 24 h kuluçka sonra tüp oluşumu gözlemlemek.
3. Heparin-PEG boyalı adacıklar glikoz uyarılmış insülin salgılanması
   Not: heparin-PEG kaplı ve noncoated adacıkları glikoz uyarılmış insülin salgılanmasını nanocoating fare adacıkları fonksiyonu etkileyeceğini değerlendirmek için değerlendirildi.
   1. 30 heparin-PEG boyalı adacıklar veya noncoated denetim adacıkları bir 1,5 mL tüp içine futbolla. Toplam 10 tüpler için boyalı adacıklar ve noncoated adacıkları hazırlamak.
   2. 1 mL 2 mmol/L glikoz²⁰ ile desteklenmiş fizyolojik tuz çözeltisi ekleyin ve 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: fizyolojik tuz solüsyonu tarifi için lütfen Tablo 1' e bakın. Tüpler kap Kuluçka kuluçka sırasında serbest bırak.
   3. Mümkün olduğu kadar çözüm kaldırın.
   4. Adacıkları 600 µL fizyolojik tuzlu çözüm için 30 dk 37 ° C'de 20 mmol/L glikoz ile takıma ekleyerek teşvik.
   5. 200 µL süpernatant, her tüpün ticari insülin ELISA kullanarak ELISA miktar kit insülin için toplamak.

Heparin-PEG nanocoating starPEG-(NH2)8 ve EDC ve NHS ajanlar (Şekil 1) kaplin olarak kullanarak heparin konjugasyon tarafından sentezlenen. Heparin-PEG nanocoating kimyasal yapısı FT-IR tarafından incelenmiş ve Şekil 2' de gösterildiği gibi 3300-3600 cm-1heparin (Şekil 2 hidroksil grupları karşılık gelen, heparin karakteristik doruklarına gözlenen Kırmızı). 3300-3600 cm-1 (Şekil 2 mavi) zirve genliğini azalma starPEG (NH2)8 Amid grupları ve heparin karbonil grubu arasındaki konjügasyon temsil eder. Tepe 1.650 cm-1 genliği karşılık gelen Amid için titreşim germe karbonil da düşürüldü, heparin ile succinimidyl süksinat karboksilat grupları ve Amin, starPEG-(NH2) arasında yeterli tepki gösteren 8. heparin-PEG nanocoating yüzey yapısını atomik kuvvet mikroskobu tarafından muayene ve Lou ve ark.gösterilir, nanocoating yaklaşık 30 nm yüksekliği ve genişliği arasında değişen küçük gözenekli özellikleri (siyah noktaları) ile 2 µm 100 ile 200 arasında çapı10nm. Taranan elektronik mikroskobu elde edilen veri de içinde vivo teslimat sırasında hücre hayatta kalmak için uygun olabileceğini düşündüren çok birbirine bağlı gözenekli yapısı heparin-PEG (Şekil 3), onaylamak.

Yüzey kaplama izole fare adacıklar incelenmiş ve Şekil 4' de gibi yeşil floresans tarafından gösterilen nanocoating, ince tabaka eşit olarak boyalı adacıklar yüzeyi boyunca adacık birim/boyutu üzerinde belirgin değişiklikler neden olmadan yatırılır. Kaplama sırasında bu adacıkları canlılığı korumak için buz üzerinde tutmak için tavsiye edilir. Benzer şekilde, kaplama dönemi 10 dk bu durumda, aynı zamanda bakım adacıkları canlılık sağlamak için optimize edildi. Bu veriler oluşturulur, ancak nanocoating daha iyi gözlem için elektron mikroskopi kesit boyalı adacıklar daha önce raporlanmış9,16 olarak inceleyen daha uygun olacağını dikkati çekiyor kültürde yaşayan adacıkları yerine sabit ve katıştırılmış adacıkları.

İle ilgili olarak hayatta kalma ve boyalı adacıklar, adacık revaskülarizasyon ve fonksiyonları değerlendirildi içinde vitroolmuştur. Heparin yararlı özellikleri göz önüne alındığında, heparin functionalization adacık yüzeyine adacık revaskülarizasyon kültür ve sonuç olarak onun hayatta kalma kolaylaştırabilir. Heparin-PEG kaplı fare adacıkları sağlam adacık canlılığı Kültür (Şekil 5) sergilenen gözlemledim. Önemli ölçüde daha gelişmiş damar oluşumu da heparin-PEG ile birlikte kültürlü adacık endotel hücreleri (MS1) belirgin uzamış microvessel benzeri yapıları ve ağ benzeri vasküler yapılar (Şekil 6 tarafından belirtilen adacıkları, kaplanmış ).

Nanocoating işlemi sonucunda oluşan heparin-PEG boyalı adacıklar hiçbir etkisi glikoz uyarılmış insülin salgı yeteneği. Ne zaman adacıkları glikoz (2 mmol/L; sub-stimulatory düzeyiyle desteklenen fizyolojik tuz solüsyonu ile derin insülin salgılanması düşük düzeyde tüm tedavi gruplarında gözlenmiştir Şekil 7). Glikoz (20 mmol/L glikoz) supra fizyolojik bir düzeyiyle adacıkları uyardığında, insülin salgılanması artış tüm tedavi gruplarında gözlendi.

Şekil 1: Kimyasal yapısı pankreas adacık yüzey Mühendisliği için Hep PEG nanocoating. Adacık kaplama hücre zarı ve yıldız - PEG-(NH2)8içinde birincil aminler ve heparin-NHS arasında kovalent çapraz sağlanır. Her heparin molekül bir NHS her grubunuz için değiştirildi birden çok karboksil grubuna sahiptir. NHS aktif karboksil grupları formu Amid bağlantılar, hangi yolu ile nanocoating Hep PEG ve adacıkları stabil için protein Birincil aminler ile tepki olacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Yıldız - PEG-(NH2)8, heparin ve Hep PEG nanocoating Kızılötesi spektrum kurutulmuş devlet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Hep-PEG kurutulmuş durumda elektronik mikroskobu görüntülerini taranan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Heparin-PEG temsilcisi görüntülerini boyalı adacıklar floresan mikroskop altında.
Heparin (yeşil renkle gösterilmiştir) FAM ile önceden etiketli. 100 adacıkları temsilcisi görüntülerdir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Heparin-PEG boyalı adacıklar sergilenen güçlü adacık canlılığı. (A) anlamına gelir, n mean± standart hata sunulan veri grubu başına 50 adacıkları =. (B) canlı hücreler kırmızı yeşil ve ölü hücreleri içinde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 µm. temsilcisi 50 adacıklar görüntülerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: Heparin-PEG nanocoating kolaylaştırır Intra-adacık revascularisation. Matrigel tüp heparin-PEG kaplı adacıkları ve noncoated kontrol adacıkları ile birlikte kültürlü MS1 hücre oluşumu. Görüntüleri 4 ile 24 h. ölçek çubuğu alınmıştır 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: Heparin-PEG nanocoating maruz kalırsa herhangi bir değişiklik adacık insülin salgısı fonksiyonları üzerine. Heparin-boyalı adacıklar PEG ve noncoated kontrol adacıkları (her 30) 2 mmol/L (beyaz çubuğu) maruz ya da 30 dk yanıt olarak 20 mmol/L glikoz insülin salgılanması için 20 mmol/L (siyah bar) glikoz kaplı arasında karşılaştırılabilir ve kontrol adacıkları. Veri anlamına gelir, n ortalama ± standart hata gösterilir = 10. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.