Yöntem makalesi

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

DOI:

10.3791/56889

⸱

1 Ocak 2018

 ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı, hücresel Caenorhabditis elegans içinde vivohücre kaderi dönüşüm sırasında çalışma açıklar. Transjenik hayvanlar, ısı-şok organizatörü tahrik overexpression nöron kader-inducing transkripsiyon faktörü CHE-1 ve Kromatin düzenleyen faktör LIN-53 mikrop nöron yeniden programlama için hücre RNAi aracılı tükenmesi izin kullanarak gözlenen vivo.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre biyolojik süreçlerin belirli hücre tiplerinin kimlikleri dönüştürme sırasında eğitim korumak ve hücresel kimlikleri korumak önemli anlayışlar içine mekanizması sağlar. Germ hücreleri dönüştürme nematodunun Caenorhabditis elegans (C. elegans) belirli nöronların içine kurulan hücre kimlikleri korumak yasal yolları incelemek için genetik ekranlar gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. ASE olarak adlandırdığı nöronların belli bir türe germ hücrelerinin yeniden programlama (TF) CHE-1 Zn-parmak transkripsiyon geniş aşırı ifade izin Transjenik hayvanlar faktör gerektirir. Endojen CHE-1 sadece iki baş nöronlarda ifade edilir ve kolayca gcy-5prom::gfp muhabiri tarafından görüntülendi glutamatergic ASE nöronlar kaderini belirlemek için gereklidir. Isı şok organizatörü tahrik che-1 gen ifade yapısı içeren bir trans gen ısı şok tedavisi üzerine tüm hayvan CHE-1'in geniş yanlış ifade sağlar. RNAi kombinasyonu faktör LIN-53 Kromatin düzenleyen ve che-1 ısı şok bağlı aşırı ifade karşı ASE nöron benzeri hücrelere germ hücre yeniden programlama için yol açar. Biz burada Transjenik hayvanlar ısı şok tedavisi için uygun koşul ve belirli RNAi yordamı başarıyla germ hücreli nöron dönüşüm için ikna etmek için açıklamak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kader gibi myogenic TF Tanrım, Ektopik TF ifade tarafından yeniden programlama hücre hangi overexpressed zaman dönüştürür fibroblastlar kas benzeri hücreler1, içine doğrudan olmuştur bir araştırma odak yıllardır. Ancak, farklı hücre hücresel kimliklerini korumak mekanizmaları nedeniyle bu işlem için ateşe dayanıklı çoğu kez. Germ hücreleri koruma benzer derecede gösterir ve genellikle diğer hücre tipleri kader-inducing TF aşırı ifadesi üzerine içine germ hücreli dönüşüm önlemek için bir engel olarak hareket temel mekanizmaları vardır. Genellikle, epigenetik yönetmelik Histon modifikasyonları ve Kromatin yapısı gibi bir engel hücre kaderi2,3dönüşüm için uygular. Biz daha önce ters genetik RNAi knock-çıkışlar C. elegans içinde kullanarak uygulanan ve hücresel kimlikleri korumak ve böylece germ hücrelerinin nöron4yeniden şekillendirmek için karşı koymak faktörler tespit. Özellikle, polycomb baskıcı karmaşık 2 (PRC2) ve son derece korunmuş Histon refakatçi LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 insanlarda) önlemek germ hücreleri doğrudan dönüşüm içine glutamatergic tat nöronlarda C. elegans gibi belirli somatik hücre türleri 4 , 5. ısı şok indüklenebilir Zn-parmak TF CHE-1 taşıyan Transjenik hayvanlar kullandığımız bariyer faktörler yeniden programlama bu germ hücre tanımlamak için. CHE-1 normalde iki baş C. elegansburada glutamatergic tat nöronlar kaderi ASE6olarak adlandırdığı belirtir, nöronlarda ifade edilir. ASE nöron kader ASE özgü floresan muhabir gcy-5prom::gfpifade tarafından görüntülenmeyecektir. GCY-5 ASE doğru nöron7' ifade bir chemoreceptor var. Lin-53 tükenmesi RNAi tarafından ve indüksiyon ısı şok tarafından CHE-1'in geniş Ektopik ifade üzerine, germ hücreleri nöronlar vivo içinde4,5dönüştürülebilir. Önemlisi, zaman RNAi tedavi gibi sadece yetişkin solucanlar (P0 üretimi) lin-53 için RNAi maruz F1 döl hayvanlarla nöronlar4yeniden programlama için izin veren bir germline çıkmasına çok önemlidir.

C. elegans nöron dönüştürme yordamına yukarıda açıklanan germ hücre hücre kaderi yeniden programlama içinde yollar sinyal dolaylı gibi biyolojik soruları çeşitli eğitim için kullanılabilir. Örneğin, biz CHE 1 bağlı germ hücreli lin-53 karşı RNAi üzerine ASE nöronların içine yolu germ hücreli8yeniden programlama sürecinde sinyal çentik dolaylı çalışma için yeniden şekillendirmek için kullanılır. Lin-53 ve Histon demethylase kodlama co tüketmek için çift RNAi gerçekleştirerek bu yolu zıt PRC2-aracılı gen UTX-1'in ifadesinde germline8 etkinleştirerek susturmak sinyal çentik gösterdik gen utx-1 . Bu bulgu germ hücreli dönüşüm Bu protokol için açıklanan nöronlar için sağlam bir canlı ve bağlamında farklı gelişim ve çevresel hücresel yeniden programlama gibi karmaşık bir biyolojik süreç çalışma için kullanılan olabilir gösterir koşullar. Ayrıca, germ hücreleri aşırı farklı kader-inducing TFs sınırlama-in hücresel plastisite9içindeki rolü çalışma veya germ hücre için yeniden programlama inducing için potansiyellerini değerlendirmek için ifade ederek meydan okumak için bakış açısı sağlar diğer hücre içinde vivotürleri.

Memeli doku kültürleri de hücre kaderi yeniden şekillendirmek için farklı yönlerini eğitim izin verirken, hücre kültüründe yetiştirilen için sağlam bir organizma karşılaştırıldığında sinyal yol koşulları taklit kapasitesi sınırlıdır. Bu nedenle, C. elegans çentik vivo içindeyeniden programlama sırasında sinyal verme gibi çeşitli biyolojik süreçlerin rolleri incelenmesi için çok yönlü bir model. Ayrıca, o korumak ve genetik olarak değiştirmek için düşük maliyetleri nispeten kolay bir güçlü genetik ekranlar için modeldir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakımı açısından LaGeSo Berlin, Almanya tarafından onaylanmış olan

1. çözüm hazırlık

  1. NGM-Ağar kaplamalar (1 L)
    1. 3 g-in NaCl, pepton medya (örneğin, Bacto-pepton) 2.5 g ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 1 mL ekleyin M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL ve 1 mL amfoterisin b (2.5 mg/mL stok).
  2. NGM Agar RNAi tabak (1 L)
    1. 3 g-in NaCl, 2.5 g pepton medya ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra eklemek, kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL, amfoterisin b (2.5 mg/mL stok) 1 mL, 1 mL 1 m IPTG ve 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).
  3. LB-Agar (1 L)
    1. 10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g agar, 1 M Tris pH 8,0 10 mL 20 g. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ve 5 mg/mL tetrasiklin 2.5 mL ekleyin.
  4. LB orta (1 L)
    1. 10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g ve 1 M Tris pH 8,0 10 mL. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ekleyin.
  5. M9-tampon (1 L)
    1. Na2HPO46.0 g, 3 g KH2PO4, 5 gr NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Önce kullanımı, 1 M MgSO41 mL ekleyin.
  6. Beyazlatma çözüm (10 mL)
    1. 1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O için 10 mL ekleyin.

2. RNAi plakaları hazırlanması

Not: C. elegans genellikle Yuvarlak solucanlar büyüme orta Agar (NGM-Agar)10,117.5 mL içeren 6 cm Petri plakalar üzerinde laboratuvarda kültürlü. Bu iletişim kuralı 15 ° C'de muhafaza solucanlar için optimize edilmiştir NGM tabak hazırlamak için mantar ve bakteri kontaminasyonu önlemek için standart steril tekniklerini kullanın. RNAi için ayıraçlar ile desteklenmiş NGM tabak hazırlamak için iletişim kuralı şudur.

  1. 1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 50 µg/mL carbenicillin içeren 6 cm NGM Agar RNAi tabak hazırlamak. Koyup karanlık12oda sıcaklığında 24-48 h için kuruyuncaya kadar bırakın.
    1. Karanlıkta 4 ° C'de RNAi plakalar tutmak. 14 gün daha büyük ise kullanmayın.
  2. Lin-53 gen DNA dizisi kullanılabilir RNAi Kütüphane13 50 µg/mL içeren LB-agar plakaları donmuş gliserol stoktan ile L4440 plazmid içeren RNAi bakteri (Escherichia coli HT115) klon seçin carbenicillin ve üç fazlı streaking desen kullanarak 12.5 µg/mL tetrasiklin. 37 ° C gece12bakteri büyümek. Bu klon Candidatus lin-53 dsRNA IPTG-bağımlı üretimini sağlar.
    1. Ayrıca, herhangi bir Gen dizisi boş vektör kontrol14olarak olmadan L4440 plazmid içeren RNAi bakteri büyümek.
  3. Ertesi gün, bir koloni lin-53 üzerinden almak veya 200 µL pipet kullanarak boş vektör LB-Ağar kaplamalar ipucu ve her biri 50 µg/mL carbenicillin ile desteklenmiş sıvı LB orta14 2 mL içeren bir ayrı kültür tüp içine aşılamak. Onlar bir optik yoğunluk (OD) ulaşana kadar 600 kültürler 37 ° C'de gecede büyümek nm 0,6-0,8. Spektrofotometre15kullanarak OD ölçmek.
    Dikkat: Tetrasiklin bakteri gliserol stoktan bir azalma RNAi verimliliği 12 ' ye müşteri adayları besleme sırasında tetrasiklin dahil beri çizgiler için kullanılan LB-agar plaka aksine sıvı LB medya içermemeli
  4. Her bakteri kültürü (lin-53 veya boş vektör) 500 µL 6 cm NGM Agar RNAi tabakaları bana bir multipipette kullanarak ekleyin. Tabak kuru karanlık oda sıcaklığında gecede kapalı bir kapak ile kuluçkaya. Bu süre boyunca, NGM tabak içinde IPTG dsRNA içinde bakteri üretimi teşvik.
    1. Bakteriyel kültür deneme başına başına en az 3 tabak kullanın. Bu 3 teknik her deneme için çoğaltır sağlayacaktır.
  5. 4 ° C'de bakteri kurutulmuş NGM agar RNAi pilakalar karanlıkta iki haftaya kadar saklayın.

3. C. elegans zorlanma BAT28 hazırlanması

  1. Solucan zorlanma BAT288 transgenes otIs305 içeren korumak [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 15 ° C'de standart NGM-Ağar kaplamalar kullanarak OP50 bakteri
    Not:10nematodunun kültür için detaylı iletişim kuralı için bakın. Rol-6(su1006) dominant bir gen olduğunu ve sık kullanılan tipik yuvarlanma hareketi neden olur fenotipik enjeksiyon işaretçisi16 . Bu otIs305 transgene izlemek için kullanılan hsp-16.2prom::che-1.
    1. Her zaman 15 ° c BAT28 gerilme precautious aktivasyonu önlemek için tutmak hsp-16.2prom::che-1 transgene. 15 ° C yüksek sıcaklıklarda mümkün olduğu kadar yük taşıma sırasında azaltmak.
  2. Yaş-solucanlar eşitlemek için beyazlatma tekniği17kullanın.
    1. Yetişkin ve 900 µL M9 tampon kullanarak yumurta BAT28 içeren 6 cm NGM-Ağar kaplamalar yıkayın. Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını.
    2. 0.5-1 mL çözüm ağartma ekleyin ve yetişkin solucanlar patlak açık başlayana kadar yaklaşık 1 dk için tüp sallamak. Standart bir stereomicroscope kullanarak izleyin.
    3. Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını.
    4. Solucan Pelet 800 µL M9 arabelleği ekleyerek ve de 900 x g centrifuging 3 kez yıkayın.
    5. Temizlenmiş yumurta taze NGM-tabaklar OP50 bakteri ile seribaşı yerleştirin. L4 sahne (yaklaşık 4 gün) ulaşana kadar ağartılmış Vaha'da OP50 bakteri 15 ° c üzerinde büyür. L4 larvaları beyaz bir yama bir standart stereomicroscope kullanarak solucan18 ventral kenarı boyunca yaklaşık yarım tarafından tanınacak.
      Not: nöron dönüşüm fenotip lin-53tükenmesi üzerine mikrop hücresine elde etmek için bu ebeveyn üretimi (P0) tüketilmiş gerekir.
Dönüşüm fenotip için puanlama aşağıdaki üretimi (anne babaya üretimi F1) üstlenilmiştir. Şimdiden P0 Rutherford lin-53 elde etmek için L4 hayvanlar için RNAi tabi tutulmaktadır.
  • Elle herhangi bir bakteri içeren ve transfer edilen OP50 bakterileri uzak hareket solucanlar izin bir NGM plaka bir platin tel kullanarak çoğaltma başına 50 L4 sahne solucanlar aktarın. Yaklaşık 5 dakika için plaka üzerinde hareket solucanlar izin. NGM Agar RNAi plakaları bakterilerden kullanımı daha önce ilgili RNAi plakayı aktarmak için lin-53 RNAi bakteri (veya boş vektör kontrolü) numaralı seribaşı.
    1. Gerçek RNAi plakayı OP50 bakteri aktarılmasını önlemek. Hızlı baskı 15 ° C'nin daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için çalışır
  • Solucanlar NGM Agar RNAi plakaları 15 ° C'de F1 döl solucanların L3-L4 sahne ulaşana kadar yaklaşık 7 gün kuluçkaya. Onlar büyük ve F1 döl daha kalın olduğundan P0 hayvanlardan açıkça ayrılabilir.
    1. Görsel olarak bir standart stereomicroscope altında F1 döl solucanlar şekil 1' de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotip gösterir olup olmadığını kontrol edin. RNAi lin-53 karşı pleiotropic etkileri vardır ve RNAi lin-53 karşı başarılı olmuştur değerlendirmek için kullanılan pvul fenotip neden olur.
      Not: RNAi lin-53 karşı da ölümcül F1 embriyoların neden olabilir. Önce hayvanlar L3-L4 aşamaya plakaları 15 ° C daha yüksek derece maruz kalır bu etkisi artar. Ölü embriyo tutuklandı gelişim ve çıkım eksikliği tarafından kabul edilebilir.
    2. IPTG ışığa duyarlı olduğundan plakaları karanlıkta kuluçkaya.

    • 4. indüksiyon Germ hücre yeniden programlama

    1. Lin-53 içeren muayene RNAi plakaları kuluçkaya ve vektör RNAi tedavi F1 döl CHE-1 etkinleştirmek için karanlıkta 37 ° C'de 30 dk için boş. İçin daha verimli bir ısı şok sağlar beri Bacalı kuluçka makinesi kullanın.
    2. Isı şok hayvanların yeniden elde etmek için 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında ve plakaları gecede karanlıkta 25 ° C'de kuluçkaya izin.
    3. Bir çift stereomicroscope Floresan ışık kaynağı için birleştiğinde kullanarak incelemek gcy-5prom::gfpiçin GFP filtre altındaki hayvanlar- Şekil 2' de gösterildiği gibi sinyalleri orta gövde alanında solucanların türetilmiş. GFP sinyalleri için set mikroskop: 488 maksimum uyarma nm ile emisyon 509 maksimum nm.
    4. Montaj hayvanların agar pedi içeren mikroskobu slaytlar19orta gövde alanında GFP sinyallerle germ hücreli nöron dönüşüm derecesini değerlendirmek.
      1. Germ hücreli nöron dönüşüm fenotip alellerle değerlendirmek için karanlık hayvanlar vs gösterilen hayvanları saymak. Hayvanlar değil fazla % 5 boş vektör RNAi üzerine germline diffüz GFP sinyalleri gösterir, ancak genellikle, yaklaşık hayvanların % 30 ayrı GFP sinyalleri germline lin-53 tükenmesi, üzerine gösterir.

    Sonuçlar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Şekil 1' de gösterildiği gibi pvul fenotip sergi F1 hayvanlar lin-53 RNAi başarılı uygulama gösterilmektedir. Bu hayvanlar onların germ hücreleri dönüştürme ısı şok indüksiyon che-1 aşırı ifade üzerine ASE nöron benzeri hücreye Şekil 2' de gösterildiği gibi izin yatkındır. Denetimde boş büyüdü solucan aksine RNAi lin-53 tedavi Ektopik GFP-sinyalleri ısı-şok ve 25 ° C kuluçka açıklanan önceki4, gece sonra orta gövde alanında görüntülemek hayvanlar verecek RNAi vektör 8. bu solucanları bir epifluorescence mikroskop altında daha yakından incelendiğinde ortaya koymaktadır GFP sinyalleri de gösteren hücreler nöronal hücre için tipik olan nöron benzeri projeksiyonlar (2B şekil, beyaz ok) görüntüler. Eğer RNAi lin-53 karşı başarısız oldu veya ısı şok koşulları uygunsuz GFP sinyalleri bu denetim RNAi tedavi hayvanlar (Şekil 2) benzer. Önemlisi, hayvanlar orta L3 sahne ulaşmadan önce ısı indüksiyon tarafından che-1 ' in aşırı ifade inducing kaçının. Che-1 overexpression indüksiyon anda çok gençtin hayvanlar Ektopik gcy-5prom::gfp ifade gelişmekte olan vulva gibi vücudun diğer bölgelerinde şekil 313' te gösterildii gibi görüntülenir.

    figure-results-1
    Şekil 1: Pvul fenotip RNAi tarafından lin-53 karşı neden. (Üst) L4/genç yetişkin sahne F1 döl Worms DIC resim denetimi veya lin-53 tedavi RNAi anne türetilmiş. Ölçek çubukları- lin-53 RNAi ekran çıkıntılı vulva (pvul) fenotip (siyah ok-uçları) tedavi 20 µm. (alt) hayvanlar =. Pvul fenotip RNAi lin-53 karşı başarılı olduğunu doğruluyor. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    figure-results-2
    Resim 2: Başarılı bir şekilde programlanmış germ hücreli Kurtlarla nöronların içine. (A)BAT28 zorlanma hayvanlar üzerinde boş vektör yetiştirilen gösterme GFP sinyalleri germline che-1 overexpression ısı-şok indüksiyon sonra. Kesikli beyaz çizgi solucan özetliyor. Ölçek çubukları = 20 µm. (B) BAT28 zorlanma hayvanlar üzerinde boş vektör kontrolü RNAi ekran gcy 5prom::gfp sinyalleri orta gövde alanında lin-53 üzerinde yetiştirilen RNAi hayvan yetiştirilen aksine. Orta gövde bölümü 63 X büyütme oranında alınan GFP sinyallerle resimlerini çıkıntılar (beyaz ok-uçları) gösterilen GFP pozitif hücreler ortaya koyuyor. Morfolojik bu özellik germ hücreleri dönüştürme ASE nöron benzeri hücrelere uygulanan gösterir. Beyaz Yıldız bağırsak kaynaklı auto-floresan işaretleyin. Tüm resimleri 20 X büyütme ve 63 X büyütme ile bir epifluorescence mikroskop kullanarak elde. Kesikli beyaz çizgi solucanlar özetliyor. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    figure-results-3
    Şekil 3: Erken sahne solucanı Ektopik GFP. Isı şok L2 gibi erken larva aşamalarında che-1 overexpression için indüklenen vardı boş vektör RNAi bakteri yetiştirilen BAT28 zorlanma hayvanlar GFP sinyalleri orta gövde alanında (beyaz yıldızlar) göster. Bu sinyaller germ hücre yeniden programlama nedeniyle değildir. Kesikli beyaz çizgi solucan özetliyor. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Tartışma

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Transgenik C. elegans açıklanan iletişim kuralı'nı BAT28 strain ve RNAi lin-53 karşı birkaç adım sırayla kritik germ hücreli nöron yeniden programlama için beklenen sonuç sağlamak için basittir. Bu zorlanma BAT28 deneyler önce her zaman 15 ° C'de tutulur önemlidir. Kullanım ve bakım baskı sırasında olmak en aza indirgemek zaman 15 ° C üzerindeki sıcaklıklarda, mümkün olduğu kadar ihtiyacı var. Che-1 overexpression yetersiz indüksiyon germ hücre ASE nöron dönüşüm için neden değil bu yana doğru ısı-şok önemli koşullardır. Bu iletişim kuralında tanımlandığı gibi fenotip alellerle ölçerek tespit edilebilir. Geniş ısı-şok için hayvanların ölümcül yol açabilir. Örneğin, iç duvarları yakınında veya statik hava kuluçka makinesi alt yere genellikle yerleştirildi plakaları kapsamlı ısıl işlem deneyim. Bu nedenle, bu Bacalı ısı kuluçka makinesi kullanmak için tavsiye edilir. O zaman L3 Ektopik gcy-5prom::gfp indüksiyon vulva (şekil 3) gibi farklı vücut bölgelerde neden olabilir Ayrıca, zamanlama ısı şok indüksiyon che-1 aşırı ifade daha önce larva aşamalarında beri önemlidir 9. Ayrıca, geniş ısı-şok fenotip alellerle % 5 ve diğer dokuların, yani bağırsak artan otomatik Floresans genişletmeniz değil boş vektör RNAi hayvanlar tarafından tespit edilebilir.

    Düzensiz, RNAi bakteri verimli bir şekilde hedef gen dsRNA üretmek için faaliyetlerini kaybedebilir. Ne yazık ki, bu algılanan önceden RNAi deney için mümkün değildir. Bu gibi durumlarda gliserol gelen taze bir çizgi Bölüm 2'de iletişim kuralının açıklandığı gibi yetişkin olmak. Eğer hala yok RNAi neden pleiotropic fenotip pvul fenotip lin-53, sonra bir plazmid karşı başarılı RNAi ilgili bakteri DNA izolasyonu neden olduğu gibi görünür yapılmalıdır ve taze HT115 bakteri olması gerekir lin-53 sıra içeren L4400 plazmid ile dönüştürülmüş.

    Önemlisi, BAT28 zorlanma olan bir transgenesis ile hayvanların sırasında kullanılan iğne işaretçisi pRF4 nedeniyle silindir fenotip hsp-16.2prom::che-1 DNA yapısı. Zaman zaman, hayvanlar, susturmak belirtebilirsiniz haddeleme fenotip kaybetmek hsp-16.2prom::che-1 transgene. Düzgün BAT28 zorlanma korumak için taze bir tabak için 10 silindir hayvan almak ve hayvanlar haddeleme için seçme aktarabilirsiniz.

    Uygulama Protokolü'nün (P0 üretimi) ailesi lin-53 için RNAi maruz kalmış değil hayvanlar germ hücreli nöron dönüşüm nedeniyle anne kurtarma4göstermez anlamına gelir F1 RNAi yordam sınırlıdır. Germ hücreleri nöronlar için dönüştürmek için alternatif bir yordam RNAi knock-down gld-1 ve mex-3 aşırı ifade bir transkripsiyon faktörü olmadan kullanarak Ciosk ve meslektaşları15 tarafından tarif edilmiştir. Ancak, elde edilen nöronlar nöronlar belirli bir türüne ait olmayan ve germ hücreleri de kas benzeri hücreler gld-1 ve mex-315RNAi aracılı tükenmesi üzerine dönüştürmek. Daha önce kanıtlanmıştır lin-53 karşı RNAi germ hücreli dönüşüm GABAergic nöron benzeri hücrelere Pitx tipi homoedomain transkripsiyon faktörü UNC-3016 CHE-14 yerine aşırı ifadesi üzerine izin . Gelecekteki tarifin için farklı kader-inducing transkripsiyon faktörleri lin-53 germ hücreleri tükenmiş olup olmadığını test edilecek diğer hücre tipleri belirli nöronlar daha dönüştürülebilir. Bu bağlamda, overexpression myogenic bHLH transkripsiyon faktörü HLH-1, homolog memeli Tanrım17, germ hücreli dönüşüm lin-53 RNAi5 üzerine kaslara neden olmaktadır. Kurulan özel somatik hücre tipi lin-53 RNAi üzerine ve uygun bir kader-inducing transkripsiyon faktörü aşırı ifade germ hücrelerinin yeniden şekillendirmek için birkaç farklı genetik ekranlar için kullanılabilir. Böyle bastırıcı veya artırıcı ekranlar hücre kader dönüştürme sırasında bir rol oynamak yasal yolları dissekan yardımcı olabilir.

    Açıklamalar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarlar hiçbir rakip çıkarları var olduğunu ilan etti.

    Teşekkürler

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Alina El-Halili ve Martina Hajduskova teknik yardım için teşekkür ederiz. El yazması üzerinde yorum Tursun grubunun üyeleri, teşekkür ederim. Bu eser ERC-StG-2014-637530 ve ERC çiğ PCIG12-GA-2012-333922 tarafından sponsor oldu ve Max Delbrueck Merkezi tarafından Helmholtz Association moleküler tıp için desteklenir.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Kimyasallar 
    Agar-Agar, Kobe IRoth5210.1
    Bactopeptone A. Hartenstein GmbH211 677Peptone Media 
    Maya özü AppliChemA1552,0100
    Amfoterisin BUSBiolojikA2220
    CaCl2Merck Biosciences208290
    KolesterolRoth8866.2
    JelatinRoth4275.3
    IPTGSigma15502-10G
    K2PO4RothT875.2
    KH2PO4Roth 3904.2
    MgSO4VWR25,163,364
    Na2HPO4RothP030.1
    NaClRoth9265.1
    NaClORoth9062.3
    NaOH (5 N)Roth KK71.1
    TrisRothAE15.2
    KarbenisilinRoth634412
    TetrasiklinRoth2371.2
    < güçlü > inkübatörler < / güçlü >
    inkübatör Isı şokuNew Brunswick ScientificC24 M1247-0052
     Sanyo MIR-5553421015 ° C'de solucan suşlarının bakımı için; C veya 25 & derece; C
    Mikroskoplar
    Floresan mikroskobuM205 FALeica
    Mikroskop (Görsel düzenleme) + kameraAxio Imager 2Zeiss
    Mikroskop (Görsel düzenleme) + kameraSensicamPCO
    StereomikroskopSMZ745Nikon
    Bakteriyel suşlar
    Escherichia coli HT115< / em >F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lizojen: lavUV5
    promotörü -T7 polimeraz) (IPTG ile indüklenebilir T7 polimeraz) (RNAse
    III eksi).
    Escherichia coli OP50  Urasil oksotrof E. coli suşu
    Solucan suşları
    BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::
    3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.    		OH9846'dan N2
    RNAi Klonları
    lin-53KaynakBioscienceID I-4D14Ahringer kütüphanesi 16B07 ChromI, K07A1.12
    boş vetor: L4440Addgene #1654
    Misc.
    Solucan toplama bir pastör pipeti ve bir platin tel kullanarak kendi kendine yapılır
    İnkübatörü için ile 4 kat daha fazla geri çaprazlama ile türetilmiştir

    Kaynaklar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), (1987).
    2. Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. , 1-12 (2015).
    3. Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).
    4. Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331 (6015), 304-308 (2011).
    5. Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. , 1-9 (2012).
    6. Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).
    7. Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).
    8. Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
    9. Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100(2017).
    10. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
    11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
    12. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
    13. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
    14. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).
    15. Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311 (5762), 851-853 (2006).
    16. Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).
    17. Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).
    18. Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).
    19. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , 1-75 (2006).

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Germ H cresi Yeniden ProgramlanmasC elegans N ronlarRNAi LIN 53Is oku CHE 1ASE N ron D n mFloresan MikroskobuSolucan Ya SenkronizasyonuA artma Tekni iTransgen EkspresyonuGenetik Tarama

    İlgili makaleler