Yöntem makalesi

Ipecac düğümler arası kültür sırasında endojen Auxin ve Cytokinin miktar

DOI:

10.3791/56902

⸱

15 Mart 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adventif sürgünler Ipecac phytohormone tedavi olmadan internodal kesimlerindeki bağlı olmak. Phytohormone dynamics adventif ateş oluşumu sırasında değerlendirmek için endojen auxin ve cytokinin LC-MS/MS tarafından internodal kesimleri içinde ölçülür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adventif ateş oluşumu, transgenik bitkiler yenilenme ve ekonomik açıdan önemli bitkileri yayılması için önemli bir tekniktir. Phytohormone tedavi çoğu türler adventif sürgünler indüksiyon için gereklidir. Olup olmadığı sürgünler adventif bağlı olmak auxin ve cytokinin (CK) arasındaki dengeyi belirlenir düzeyleri. Çok çaba optimum konsantrasyonları ve etki explants kullanılan her doku ve her bitki türü birleşimlerini belirlenmesinde gider. Ipecac içinde ancak, adventif sürgünler kültür orta phytohormone tedavi olmadan internodal kesimlerindeki indüklenen. Bu Ipecac değerlendirilmek üzere hücre farklılaşması için doğal plastisite sağlar. Ipecac adventif sürgünler ikna etmek için phytohormone ücretsiz B5 Orta % 0,2 gellan sakız ile 5 hafta boyunca katılaşmış bir 14-h ışık/10-h karanlık döngüsü 15 µmol m−2 s– 1 ışık altında 24 ° C'de internodal kesimleri kültürlü. Phytohormone dynamics adventif ateş oluşumu sırasında araştırmak için endojen indol-3-Asetik asit ve CKs segmentlerinde sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi tarafından LC-MS/MS şiddetindeydi. Bu yöntem basit bir şekilde analiz endojen indol-3-Asetik asit ve CKs düzeyleri sağlar. Organogenesis diğer bitki türleri içinde sırasında endojen auxin ve CK dinamiklerini araştırmak için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) kavramı, "totipotency" hangi bitki tarafından hücreleri bölmek, ayırmak ve düz-den sonra onların önceki farklılaşma belirli hücre tipleri olgun bitkiler1içine tüm bitkiler yeniden, evlenme teklif etti. Doku kültürü içinde olup bitki rejenerasyonu veya değil bağlı olmak kombinasyonu ve exogenously uygulanan etki büyüme orta yoğunlukta tarafından belirlenir. Skoog ve Miller adventif kökleri bir düşük oran2içeren ortamda indüklenen Oysa adventif sürgünler tütün Kallus kültürü CKs yüksek bir oranı için auxins, içeren ortamda gelen indüklenen bulundu. Bu bulgu beri doku kültürü yaygın transgenik bitkiler3yenilenme ve ekonomik açıdan önemli bitkileri yayılması için kullanılmıştır. Adventif çekimleri dışında yapraklar, kökler ve internodes gibi sürgün apikal meristem doku üzerinden bağlı olmak. Phytohormone tedavi indüksiyon adventif sürgünlerin birçok bitki türü için gereklidir. Ancak, optimum konsantrasyonları ve kombinasyonları türler tarafından ve explants kullanılan dokular arasında farklı. Böylece, çok çaba optimum konsantrasyonları ve deneyler için etki kombinasyonları belirlenmesinde gider.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecac) emetine ve cephaeline, başta olmak üzere4kökleri gibi alkaloidler içeren tıbbi bir bitkidir. Kök özleri bir balgam söktürücü, kusturucu ve bir amoebicide5kullanılır. Ipecac doğal olarak Brezilya tropikal yağmur ormanları içinde büyür rağmen tohum kültüründe ayarlamak isteksiz ve Japonya, onun soğuk iklim6ile tohum depolama sırasında çimlenme oranı azalır. Bunun yerine, doku kültürü tarafından yayılır, hangi adventif ateş internodes oluşumu en verimli yöntem7,8. İlginçtir, adventif çekimleri bu tür phytohormone tedavi8olmadan bağlı olmak.

Epidermis callusing olmadan internodal ventrikül apikal bölgede, ancak Bazal Bölge9üzerinde adventif sürgünler oluşur. Bu fark, muhtemelen phytohormonal yönetmelik altında doku polarite internodal segmentleri, ın gösterir. Ipecac kültür sistemi değişiklikleri endojen phytohormone düzeylerinde adventif ateş oluşumu sırasında analiz etmek eşsiz bir fırsat sağlar. Burada bizim yöntem ve endojen düzeyde bir auxin (indol-3-Asetik asit (IAA)) ve dört CKs analizi için tanıtmak (isopentenyl adenin (IP), isopentenyl adenin riboside (IPR), trans-zeatin (tZ) ve trans-zeatin riboside (tZR)) LC-MS/MS kullanımı ile internodal segmentlerinde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Bu, endojen etki analizi kolaylaştırır çünkü ipeka (C. ipecacuanha) Bu çalışmada kullanılmıştır.

1. büyüme koşulları adventif Ipecac Shoots ikna etmek için

  1. Phytohormone-Alerjik B5 orta pH 5,710' a ayarlanmış hazırlamak ve % 0.2 gellan sakız ekleyin. Tarafından ısıyla sterilize.
  2. Autoclaved Orta 25 mL steril Petri kabına (90 mm × 20 mm) dökün.
  3. Ipecac Bitkicik steril bir akrilik plaka üzerinde bir bıçak No. 22 ile cerrahi neşter kullanarak 8 mm internodal parçalarını keser ve orta (şekil 1) yerleştirir.
  4. Kültür phytohormone ücretsiz B5 orta 24 ° c 15 µmol m−2 s– 1 14-h ışık/10-h karanlık döngüsü 5 hafta için ışığın altında.
  5. Bölgeleri tanımlamak (apikal) IV (her segmentte (şekil 1B) Bazal) ben. Adventif sürgünler > 0.3 mm uzunluğu bir mikroskop altında her bölgedeki haftada bir kez saymak.

2. çıkarma ve arıtma etki

  1. 5 mm Zirkon boncuk her dört 2 mL örnek tüplerinin koymak.
  2. Segmentleri bölgelere kesmek ben cerrahi neşter steril akrilik tabağa kullanarak IV (her 2 mm içinde süre).
  3. Sekiz ayrı örnek tüpler (10-30 mg taze ağırlık) her bölgede parçalarını toplamak.
  4. Tartmak ve sıvı azot örnekleri dondurma.
  5. Donmuş numuneler boncuk tabanlı homogenizer kullanarak ezmek.
  6. Auxin iç her standart 500 pg ve CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- IP, d6- IPR) içeren 1 mL Asetonitril içinde ezilmiş örnekleri askıya bir girdap Mikser kullanarak.
  7. 1s için 4 ° C'de basılı tutun, sonra 3500 × g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
  8. Pelet %80 (v/v) Asetonitril (v/v) % 1 Asetik asit içeren yıkayın. Santrifüj tekrar 3500 × g de oda sıcaklığında 5 min için. (Kimden adım 2.7 ve 2.8) supernatants tek kullanımlık cam tüp içinde birleştirir.
  9. 600 eklemek µL içeren %1 (v/v) Asetik asit her kombine süpernatant için su ve vakum yoğunlaştırıcı kullanarak Asetonitril buharlaşır.
  10. Hidrofilik lipofilik-dengeli (HLB) sütun kartuşları Asetonitril, metanol ve su (v/v) % 1 Asetik asit içeren her 1 mL uygulayarak equilibrate.
  11. Dengelenmiş HLB kartuş başına bir örnek çözümü uygulayın.
  12. Kartuşları (v/v) % 1 Asetik asit içeren 1 mL su ile yıkayın.
  13. 2 mL % 80'i (v/v) Asetonitril (v/v) % 1 Asetik asit bir cam tüp içeren ile tüm hormon elute.
  14. Asetonitril özü (v/v) % 1 Asetik asit vakum yoğunlaştırıcı kullanarak içeren su elde etmek için eluate içinde buharlaşır.
    Not: Bu tamamen kuru değil.
  15. Karma mod, güçlü katyon değişim (MCX) sütun kartuşları 1 mL Asetonitril, 1 mL metanol, 0.5 mL uygulayarak equilibrate 0.1 M HCl ve 1 mL su %1 (v/v) Asetik asit içeren.
  16. Dengelenmiş MCX kartuş başına bir örnek çözümü uygulayın.
  17. Kartuşları (v/v) % 1 Asetik asit içeren 1 mL su ile yıkayın.
  18. IAA 2 mL % 30 (v/v) Asetonitril (v/v) % 1 Asetik asit bir cam tüp içeren ile elute.
  19. Kartuşları (v/v) % 1 Asetik asit içeren 2 mL % 80'i (v/v) Asetonitril ile yıkayın.
  20. Kartuşları 2 mL su ve %5 sulu amonyak içeren 1 mL su ile yıkayın.
  21. Bir cam tüp %5 sulu amonyak içeren 2 mL % 60'ı (v/v) Asetonitril ile CKs elute.
  22. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak her hormon kesir solvent buharlaşır ve −30 ° C LC-MS/MS analizi kadar saklayın.

3. IAA ve CKs LC-MS/MS analizi

  1. Her hormon hulâsa bir tüp ile 600 µL metanol içinde dağıtılması ve çözüm için bir vida boyun toplam kurtarma şişe aktarmak. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak solvent buharlaşır.
  2. 20 µL % 30 (v/v) Asetonitril IAA kesir ve CK kesirler vida boyun toplam kurtarma şişeleri %1 (v/v) Asetik asit içeren 20 µL suda çözülür.
  3. Pozitif iyon modunda bir HPLC sistemi ile donatılmış bir triple quadrupole MS sistemde örnekleri analiz.
    Not: Tablo 1' de listelenen gibi HPLC koşulları ayarlayın.
    1. IAA elüsyon %5 - %50 çözelti B üzerinde 7 dk, ikili bir degrade kullanmak sonra % 98 çözücü B tarafından artırmak ve 1 dk. için tutun ve sonra % 5 çözücü B, 2 min için yuva iğne ile equilibrate.
    2. CK elüsyon için % 2-% 40 çözücü B üzerinde 5 dk, % 40-% 70 çözücü B 7 min, ikili bir degrade kullanmak sonra % 95 çözücü B tarafından artırmak ve 1 dk. için tutun ve sonra 2 dk az %2 çözücü B tarafından için equilibrate enjeksiyon iç içe.
    3. Electrospray iyonlaşma (ESI) ayarla-MS parametreleri Tablo 2' de listelenen İyon kaynağı.
  4. (MRM) geçiş Tablo 3' te listelenen her analit miktar için izleme birden çok tepki kullanın.
  5. Döteryum etiketli standartlarına etiketlenmemiş oranı standart bir eğri karşı endojen IAA ve CK seviyeleri ölçmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1st hafta hiçbir adventif sürgünler oluşmuş. 2nd hafta küçük sürgünler ortaya çıktı. 3rd ve 4th hafta, sayısı çoğunlukla apikal bölgede (ı ve II) artan vurur (Şekil 2A). 5inci hafta, sayı sürgünler yapıldı yaklaşık 7 içinde bölge ı ve II (Şekil 2B) bölgesinde 5. Buna ek olarak, sadece birkaç sürgünler bölgelerde III ve IV kuruldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etki dağıtım tanımlamak için fiş boşaltmaya karışan organogenesis, bu ne zaman etki exogenously explants inducing için uygulanan organogenesis phytohormone ücretsiz ortamda, gözlenen bitki malzemeler kullanmak önemlidir sürgünler veya kökleri, onlar hücre farklılaşma ve organogenesis fabrikaları doğasında plastisite değerlendirmek üzere bütün explant etkiler. Kültür medyada phytohormone ücretsiz Dianthus caryophyllus L.11, Aegle marmelos (L.) Corrêa12,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onların teknik destek için uygulanan Biosciences, Toyo Üniversitesi ve Bay Koudai Taniguchi Gunma tarım teknoloji merkezinin Anabilim Dalı için Bay Akira Murakami minnettarız. Ayrıca onların önerilerini Profesör Shosaku Kashiwada ve Dr Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo üniversite için sana şükrediyoruz. Bu çalışmada kısmen Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir yaşam ve Çevre Bilimleri, Toyo üniversite için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[2H5] indol-3-asetik asitOlchemlm Ltd031 1531LC-MS/MS [
2H5] trans-zeatinOlchemlm Ltd030 0301LC-MS/MS [
2H5] trans-zeatin ribozitOlchemlm Ltd030 0311LC-MS/MS için dahili standart
[2H6] N6-izopentenil adeninOlchemlm Ltd030 0161için iç standart LC-MS/MS
[2H6]N6-izopentenil adenozinOlchemlm Ltd030 0171LC-MS/MS
indol-3-asetik asitWako098 00181LC-MS/MS
trans-zeatiniçin standart SIGMA-ALDRICHZ0876 5MGLC-MS/MS
trans-zeatin ribozitWako262 01081LC-MS/MS
N6-izopentenil için standart LC-MS/MSSIGMA-ALDRICHD7674
standardı
LC-MS/MS için LiChrosolvMERCK1.00029.1000çözücü LC-MS/MS için
su Kromatografi için LiChrosolvMERCK1.15333.1000çözücü LC-MS/MS
HPLCiçinSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccSularWAT094225kartuş sütunu
Oasis MCX 30 mg/1 ccWaters186000252kartuş sütunu
vida boyunlu toplam geri kazanım şişesiSular186002805
mavi, 12 x 32 mm vidalı boyunlu kapak ve PTFE/silikon septumSuları
Beraat UPLC BEH C18, 2.1x100 mmSular186002350UPLC sütunu
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mmAgilent699775-902UPLC sütunu
Dijital mikroskopLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Cerrahi bıçakTüyNo. 22
Neşter sapıTüyNo. 4
Savant SpeedVac/Refregerated buhar kapanıThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104vakum konsantratörü
Tek kullanımlık cam askı (13x100 mm)IWAKI9832-1310
Steril petri kabıINA OPTICAI-90-20
için dahili standart için dahili standart için dahili standart N6-izopentenil adenosin ACROS ORGANICS 22648 1000 LC-MS/MS asetonitril hipergrade için adenin 186000274

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sitokinin AnaliziLC MS MS Y ntemiAdventif S rg n Olu umuIpecac Bo um Aras K lt rFitohormon DinamikleriBitki Doku K lt rHormon KantifikasyonuGellan Gam BesiyeriVakum Konsantrat r

İlgili makaleler