İntegrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) üretim stratejisinin CRISPR/Cas9 hücrelere teslim etmek için Araçlar açıklanmaktadır. Hücrelerde hızlı ve sağlam gen düzenleme arabuluculuk için bir yetenek ile IDLVs bir daha güvenli sunmak ve eşit derecede etkili vektör platformu'gen dır integrase yetkili vektörlerinin karşılaştırıldığında.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı
Bu makalede
Özet
Özet
Lentiviral vektörel çizimler stabil geniş bir hücre aralığı transducing ve gen ekspresyonu yüksek düzeyde arabuluculuk için kendi kapasitesi nedeniyle hücrelere gen düzenleme bileşenleri teslim etmek için ideal bir seçim vardır. Ancak, konak hücre genomu entegre yeteneğini insertional mutagenisitesinin riskini artırır ve böylece güvenlik endişeleri yükseltir ve bunların kullanım klinik ayarları sınırlar. Ayrıca, gen düzenleme bileşenleri kalıcı ifade bu entegrasyon yetkili lentiviral vektörler (ICLVs) artışlar tarafından promiscuous gen hedefleme olasılığı teslim. Alternatif olarak, integrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) yeni nesil birçok bu kaygıları gideren geliştirilmiştir. Burada CRISPR-aracılı gen düzenleme ve liste için yeni ve geliştirilmiş IDLV platform üretim protokolünden adımları arıtma yer ve konsantrasyon gibi vektörlerin anlatılan ve iletim ve gen Düzenleme verimliliği HEK-293T kullanarak hücreleri gösterdi. Bu iletişim kuralı kolayca ölçeklenebilir ve hücre içinde vitro ve içinde vivotransducing yeteneğine sahip yüksek titresi IDLVs oluşturmak için kullanılabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralını ICLVs üretimi için kolayca adapte edilebilir.
Giriş
Kesin gen düzenleme genetik hastalıklar mücadele için yeni strateji geliştirme dahil önemli Biyomedikal gelişmeler dönüm noktası oluşturur. At gen düzenleme teknolojileri ön planda olduğunu lustered c regularly -ınterspaced short palindromic repeats (CRISPR) kullanımı hakkında güvenerek yöntemi / başlangıçta tespit edildi Cas9 sistemi Bakteriyel bağışıklık (başvurular1,2' gözden) viral genetik materyal işgali karşı bir bileşeni olarak. Çinko-parmak enzimler (ZFNs) ve (başvuru3gözden geçirme), transkripsiyon harekete geçirmek gibi efe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kültür HEK-293T hücreleri ve hücre Transfection için tohum
Not: İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK-293T) hücreleri yetiştirilen DMEM, % 10 inek buzağı serum demir ve büyüme rehberleri ve 1 x antibiyotik antimycotic çözüm ile takıma ile desteklenmiş yüksek glikoz medya içinde (100 x çözüm içeren 10.000 adet penisilin 10 mg streptomisin ve 25 µg Amfoterisin B mL başına). Medya da 1 x sodyum pyruvate, 1 x esansiyel olmayan amino asit karışımı ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir (stok 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid içinde % 0,85 NaCl). Hücreleri (olan yaklaşık büyüme yüzey alanı 55 cm²) 100 mm doku kültürü levha kültürlü. Bir alt işleme....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
IDLV-CRISPR/Cas9 vektörler nakavt verimliliğini doğrulama
CRISPR/Cas9-aracılı gen nakavt etkinliğini doğrulamak için bir model olarak GFP ifade 293T hücreleri kullanılır. GFP + hücreleri iletim pLenti-GFP (vBK201a) adlı bir MOI 0,5 (şekil 3b, "Hayır-virüs" paneli) içeren hücrelerin HEK-293T tarafından oluşturulan. SgRNA-için-GFP/Cas9 tüm-içinde-bir vektör kaset IDLV veya ICLV parçacıklar halinde paketlenmiş ve üretim verimliliği p24
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IDLVs seçim aracı vivo içinde gen-düzenleme, özellikle içinde belgili tanımlık bağlam teslim platformlar22 tümleştirmek için karşılaştırıldığında bu vektörel çizimler ile ilişkili mutagenesis düşük riski büyük ölçüde nedeniyle, genetik hastalıkların ortaya çıkmaya başladı , 28. geçerli yazının son zamanlarda bizim laboratuvar28geliştirilmiştir geliştirilmiş tüm-içinde-bir IDLV-CRISPR/Cas9 sistem üretimi ile ilişkili Protokolü deta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Patent USC-499-P (1175) tarafından University of South Carolina bu el yazması açıklanan çalışma ile ilgili olarak Filed under.
Teşekkürler
Duke Üniversitesi Tıp Okulu ve Dekanlık temel bilim, Duke Üniversitesi Nörobiyoloji bölümü teşekkür etmek istiyorum. Biz Ayrıca el yazması üzerinde üye Duke Viral vektör çekirdek yorum için teşekkür ederiz. Plazmid pLenti CRISPRv2 Feng Zhang (Broad Enstitüsü) hediye etmişti. Plazmid psPAX2 de dahil olmak üzere LV-ambalaj, VSV-G, pMD2.G ve pRSV-Rev sistemiydi Didier Trono (EPFL, İsviçre) bir tür hediye. University Of South Carolina Tıp Fakültesi tarafından bu iş için mali destek sağlanan RDF18080-E202 (B.K) verin.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü > | |||
| Optima XPN-80 Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | A99839 | |
| Allegra 25R masa üstü santrifüj | Beckman Coulter | 369434 | |
| xMark Mikroplaka Absorbans plaka okuyucu | Bio-Rad | 1681150 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Ters floresan mikroskobu | Leica | DM IRB2 | |
| 0.45-μ m filtre ünitesi, 500 mL | Corning | 430773 | |
| Konik tabanlı ultrasantrifüj tüpleri | Seton Scientific | 5067 | |
| Konik boru adaptörleri | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti sallanan kovalı rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| 15 mL konik santrifüj tüpleri | Corning | 430791 | |
| 50mL konik santrifüj tüpleri | Corning | 430291 | |
| Yüksek bağlayıcı 96 oyuklu plakalar | Corning | 3366 | |
| 150 mm TC ile İşlem Görmüş Hücre Kültürü kapları 20 mm Izgara | Corning | 353025 | |
| 100mm TC ile İşlem Görmüş Kültür Kabı | Corning | 430167 | |
| 0.22 & mu; M filtre ünitesi, 1 L | Corning | 430513 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti (50) | Qiagen | 27104 | |
| Doku kültürü pipetleri, 5 mL | Corning | 4487 | |
| Doku kültürü pipetleri, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Doku kültürü pipetleri, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Hemasitometre, lam astarlı | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Name | Company | Katalog Numarası | Yorumlar |
| Hücre kültürü reaktifleri | |||
| İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK 293T) hücreleri | ATCC | CRL-3216 | |
| 293FT hücreleri | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| DMEM, yüksek glikozlu ortam | Gibco | 11965 | |
| Kozmik Buzağı Serumu | Hiklonu | SH30087.04 | |
| Antibiyotik-antimikotik solüsyon, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Sodyum piruvat | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA) | Hidroksiton | SH30087.04 | |
| RPMI 1640 medya | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Tripsin-EDTA %0.05 | Gibco | 25300054 | |
| BES (N, N-bis (2-hidroksietil)-2-amino-etansülfonik asit) | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Jelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| İsim | Company | Katalog Numarası | Comments |
| p24 ELISA reaktifleri | |||
| Monoklonal anti-p24< / sup> antikoru | NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı | 3537 | |
| HIV-1 standartları | NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı | SP968F | |
| Poliklonal tavşan anti-p24< / sup> antikoru | NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı | SP451T | |
| Keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Çalışma konsantrasyonu 1:1500 |
| Normal fare serumu, Steril, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Keçi serumu, Steril, 10mL | Sigma | G9023 | Çalışma konsantrasyonu 1:1000 |
| TMB peroksidaz substratı | KPL | 5120-0076 | Çalışma konsantrasyonu 1:10.000 |
| İsim | Company | Katalog Numarası< | strong>Comments |
| Plasmids | |||
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| Name | Company | Katalog Numarası | Comments |
| Kısıtlama enzimleri | |||
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Kaynaklar
- Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
