Method Article

Kısmi safra kanalı ligasyonu fare: kontrollü manken yerelleştirilmiş obstrüktif Histiositoz olgusu

DOI:

10.3791/56930

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, karaciğer hasarı ve rejenerasyon Rodents cerrahi bir model olarak kısmi safra kanalı ligasyonu mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemirgen, obstrüktif Histiositoz ve safra kanalını yayılması için kurulan bir cerrahi yüntem tam safra kanalı ligasyonu (cBDL) ortak safra kanalını var. Ancak, uzun süreli deneyler artan morbidite ve mortalite için yol açabilir. Temel alınan karaciğer hastalığı olan seçin fare suşları içinde anlamlı karşılaştırmalar bile tek bir LOB hayvan kayıp ve giderleri azaltabilir karaciğer ligasyonu ile yapılabilir. Burada, biz kısmi safra kanalı ligasyonu (pBDL) içinde sadece sol hepatik safra kanalını bakmaksızın, Mouse sol lob ama kalan loblar safra tıkanıklığı neden açıklar. Unligated LOB ve birleştirilmiş loblar için dahili bir denetim ne zaman aynı hayvan aynı koşullarda tabi görür çünkü dikkatli mikrocerrahi teknik ile pBDL deneyler düşük maliyetli, olabilir. CBDL farklı olarak, bir ayrı sahte işletilen kontrol grubu gerekli değildir. pBDL doğrudan karşı Histiositoz ve diğer muhafaza safra bileşenlerinin sistemik etkileri lokalize karşılaştırmak için son derece yararlıdır. pBDL da ilaçlar ve hücre göç ile ilgili mekanizmalar araştırmak için yeni bir yöntem olarak güvenilemez.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut karaciğer hasarı ve tamir, kısmi hepatectomy veya ortak safra kanalını ligasyonu (cBDL), gibi cerrahi modelleri Rodents yıllardır karaciğer rejenerasyonu ve pathobiology1,2eğitim için kullanılmıştır. CBDL içinde (da boşalmasına neden olur tüm safra karaciğerde üretilen) ortak safra kanalını bakmaksızın siroz3nihai ilerleme ile ameliyatı takiben ilk 2-3 hafta içinde obstrüktif Histiositoz, inflamasyon ve fibrozis ile sonuçlanan. Ayrıca, safra kanalını yayılması, transdifferentiation ve indüksiyon ikamet karaciğer progenitör hücre cBDL4,5özellikleridir. Her ne kadar cBDL iyi vahşi tipi fareler ve bu suşlar normal karaciğerleri6,7,8ile tekrarlanabilir sonuçlar ile karakterize olan belirli obstrüktif cholangiopathy, mekanizmalarının elucidates yordam teknik olarak karaciğer hastalıkları, Yüksek morbidite ve mortalite zaman içinde safra tıkanıklığı nedeniyle beklenenden daha fazla hayvan gerektiren bazı transgenik fare modellerinde rağbet görebilir. Bu teknik aynı zamanda aksi değil tahammül stres uzun süreli saat ders deneyler cBDL takip altında yatan ile transgenik farelerde karaciğer hastalığı, eğitim için faydalıdır.

pBDL bazı bu sorunları sorunu gidermek üzere makul bir alternatif sağlar. Farelerde vahşi-tip çalışmalarda ilk pBDL yerel olarak oyunculuk ve sistemik inflamasyon9arabulucu ayırt etmek amaçlanmıştır. PBDL, sağ ve sol hepatik safra kanalları ortak safra kanalını yukarıda ana safra izdiham dikkatle hilus görüntülenir ve yalnızca sol hepatik safra kanalını yerelleştirilmiş obstrüktif Histiositoz oluşturmak için bakmaksızın. pBDL cBDL için birçok avantaj sunar. PBDL, unligated sağ LOB aynı sistemik etkileri, beslenme durumu veya faktörler dolaşan gibi tabi ve birleştirilmiş sol lob için aynı şekilde eşleşen bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. Sistemik pro-inflamatuar aracılar mevcut olmasına rağmen Osawa vd. daha az fibrozis ve nekroz unligated loblar içinde gözlenen ancak inflamatuar hücreler ve dönüştürme büyüme faktörü β ifade ve birleştirilmiş LOB9arttı.

Daha yakın zamanlarda, pBDL tutulan safra10karaciğer parenkima etkilerini incelemek için yeniden. Aynı hayvan iç kontrol (unligated "sham") ve deneysel grupları için kullanarak, pBDL etkin bir şekilde sırayla daha düşük maliyetli olan deney gerekli hayvan sayısı halves. Böylece ders deneme ideal zaman (≥2 hafta) ve birleştirilmiş lobunda elde edilebilir fareler pBDL çok daha iyi, etkilerini tolere. En önemlisi, pBDL doğrudan intrahepatic etkileri obstrüktif Histiositoz olgusu ayırt edebilir ve safra bileşenleri ve birleştirilmiş LOB unligated denetim LOB karşılaştırıldığında, korunur. Genel olarak, pBDL LOB özel efektler karaciğerde yerelleştirilmiş Histiositoz olgusu çalışmaya çekici bir yöntemdir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi Pittsburgh Üniversitesi etik kurallarına uygun olarak yapılmıştır.

1. temel teknikleri ve ortak yordamlar

  1. Otoklav kullanmadan önce tüm mikrocerrahi ekipman.
  2. Fare anestezi tarafından öldürülmesi önlemek için onun nefes desen dikkatlice kontrol edin.
  3. Organları ve bağırsak organlara zarar verme ve kanama neden önlemek mümkün olduğu kadar az dokunmak. Islak pamuk temizleme bezi veya gazlı bez sünger ile kanama Puan tuşuna basın.
  4. Islak pamuk temizleme bezi organları nazik manipülasyon için kullanın. Islak, dokuma olmayan gazlı bez sünger iki farklı boyutta kullanıldığından, 3,5 × 3,5 cm ve 6.0 × 6,0 cm. daha küçük olan bütün karaciğer geri çekmek için kullanın. Büyük bir küçük ve büyük bağırsak sarmak için kullanın.

2. presurgical hazırlık

  1. Erkek c57/b6 fareler, 8-12 hafta-in yaş (vücut ağırlığı yaklaşık 20-35 g ne zaman) kısmi safra kanalı ligasyonu için kullanın.
  2. Fareler anestezi indüksiyon kadar su ve yiyecek ücretsiz erişmesine izin vermek.

3. kısmi safra kanalını ligasyon işlemi

  1. Fareyi bir indüksiyon Odası 1.5-%2.0 isoflurane ve 1 L/dak oksijen karışımı ile hayvan koyarak anestezi. Hayvan solunum oranı gözlemleyerek dikkatle izleyin. Hayvan solunum hızı saniyede bir nefes olduğunda, fare iyi imzalat. Beri açık bacak çekilmesi refleks daha hızlı kaybolur, hind bacak ayak de para çekme refleks olmaması onaylamak için çimdik. Gözleri Korneal ülser önlemek için bir oftalmik yağlama ajan ile yağlanması. Not Bu ilk doz analjezik, pre-operatively ağrı reseptörlerinin uyarımı önlemek için verilebilir.
  2. Karın duvarının saç makasları ile tıraş ve cerrahi mikroskop altında cerrahi masanın üzerine fareyi getirin. Tablo için tüm uzuvların bant ile düzeltmek. İsoflurane inhalasyon genel anestezi altında fare korumak için kullanın.
    1. İsoflurane Buharlaştırıcı ayarlamak ve 2.0-%3.0 isoflurane indüksiyon için kullanın.
  3. Steril temizleme bezi kullanarak, karın duvarının dezenfekte ilk 0,3-0,5 ile % 70 etanol tarafından takip mL povidone-iyot topikal, uygulanan. Hayvan steril örtü ile örtülmelidir.
  4. Bir uzun karın Ensizyon xiphoid üzerinden makas ve Adson forseps kullanarak pubis için yapmak. İsoflurane 0.8-1.0 için azaltmak belgili tanımlık karın kesme yaptıktan sonra % bakım için.
  5. Karın boşluğu bir mikro-Retraktörü kullanarak açarsınız. Xiphoid sivrisinek Forseps ile basılı tutarak fareyi başkanı doğru geri çek. Sivrisinek forseps yumuşak kil kullanarak yerde düzeltmek.
  6. 1-2 mL ılık (37 ° c) aşılamak sterilize edilmiş fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) karın organları zarar önlemek için karın boşluğu içine. Küçük bağırsak ıslak pamuk temizleme bezi ile tutun ve yavaşça fare başkanı doğru onları geri çek. Küçük bağırsak ve küçük bağırsak (şekil 1A) ağır yaralı önlemek için retroperitoneum arasında bağ kesilmiş.
  7. Bir ıslak, dokuma olmayan gazlı bez sünger ile küçük ve büyük bağırsak sarın. Onları karın boşluğu Kaudal yanına koyun. Bağırsak içinde steril gazlı bez sarılmış kirlenmesini önlemek için steril bol dökümlü sahada yerleştirilebilir.
  8. Yavaşça xiphoid doğru bütün Karaciğer karaciğer hilus ve hepato-duodenal bağ (şekil 1B) ortaya çıkarmak için bir küçük ıslak dokuma olmayan gazlı bez sünger kullanarak geri çek.
  9. Karaciğer hilus anatomisi onaylamak için kontrol edin. Ortak safra kanalını portal ven ventral tarafta yer alır. Ana safra kesiştiği yerde, karaciğer hilus içine drenaj sağ ve sol hepatik safra kanalını Mekanlar onaylayın.
  10. Sol hepatik safra kanalını da boşalmasına neden olur sol lob tanımlamak ve 10-0 naylon Dikiş dikiş iğne (şekil 2A) kör tarafı kullanarak bir çembere. Portal ven, hepatik arter ve karaciğer yüzey yaralanmasına kaçının.
  11. 10-0 naylon ile sol safra kanalını ligate. (Şekil 2B).
  12. Küçük ve büyük bağırsak operasyon öncesi aynı konumda ıslak pamuk temizleme bezi kullanarak yerleştirebilirsiniz.
  13. Hiçbir bağırsak burulma ve intra abdominal kanama onaylamak sonra kas ve 4-0 vicryl ile iki kat deride kapatın. Örgülü dikiş (Vicryl) Cilt kapatılması için kullanılan, ancak monofilament enfeksiyon olasılığını azaltmak için tercih edilir.
    Not: fasya tarafından sürekli xiphoid pubis için dikiş ve deri xiphoid için apış arasından sürekli dikiş tarafından kapatın.
  14. Anestezi belgili tanımlık kesme kapattıktan sonra kes.

4. Postoperatif tedavi ve takibi

  1. Sadece ameliyattan sonra fare dorsal cilt pinch ve Buprenex (0.1 mg/kg) ve sülfadiyazin (100 mg/kg) subkutan, Buprenex enjeksiyon her 12 h için 3 gün ve sülfadiyazin her 24 h 3 gün sırasıyla ardından enjekte11,12 ,13. Not Bu ilk doz analjezik, pre-operatively ağrı reseptörlerinin uyarımı önlemek için verilebilir. Sülfadiyazin ve diğer peri-operatif antibiyotikler yalnızca nakli çalışmalarda kullanılanlar gibi bağışıklık bastırılmış hayvanlar için gereklidir.
    Not: ameliyat başarıyla gerçekleştirilirse, fare genellikle 30 dk. içinde kurtarır etkinlik farelerin Preoperatif koşulu olarak hemen hemen aynı olacak.
  2. Fareler tehlike belirtisi için her gün kontrol edin.
    1. Farelerin karaciğer ve diğer doku örneği tanımlanan zaman noktaları (Yani, 7, 14, 21 gün) sonra pBDL temin etmek için genel anestezi altında servikal çıkığı tarafından kurban.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tipik deneme için pBDL (A1AT) Alfa-1 antitripsin eksikliği bulunan insan karaciğer hastalığı özetlemek onaylatılacak PiZ transgenik fareler içinde gerçekleştirildi. PiZ fare mutant insan A1AT gen ve organizatörü, intron ve akış yukarı ve aşağı akım bölgeler14kanat ~ 2 kilobases ile birlikte Kodlayıcı bölgeler içeren birden çok genomik DNA parçaları oluşan bir transgene overexpresses, 15. Normal A1AT karaciğerde üretilen bir sa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CBDL obstrüktif Histiositoz için en yaygın deneysel teknik olmakla birlikte, kemirgen birden çok sorunlar mevcut. Bir bitiş noktası elde etmek için gereken ameliyat sonrası gün sayısına bağlı olarak, hayvanların önemli morbidite ve mortalite zaman ilerledikçe yaşayabilirsiniz. Doku hasarı ve safra nekroz derecesini anormal karaciğer parankimi ve fonksiyon için taban çizgisi göstermek bazı karaciğer hastalığı, transgenik fare modelleri ile çalışırken daha da şiddetlenir. CBDL için karşılaştırıldığında, pBDL olarak bildiri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Khan hibe desteğinden NIH/NICHD K12HD052892, Alfa-1 Vakfı, Hillman Vakfı ve Pittsburgh karaciğer Araştırma Merkezi kabul eder. Dr. Michalopoulos hibe desteğinden NIH/NIDDK P01DK096990 eder. Anne Orr mükemmel ve cömert teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz de Dr David A. Geller için minnettar nakli/kemirgen mikrocerrahi laboratuvar erişim sağlamak için vardır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop-Leica Vahşi M650, 6– 40 kez; büyütmeLeica Microsystemsn/a
Tec 3 izofluran huni doldurma buharlaştırıcıGenel Anestezik Hizmetlern/a
Stevens Tenotomi MakasıDoğru Cerrahi ve Scientific Instruments CorporationASSI.9193
Adson ForsepsGüzel bilim araçları11006-12
Sivrisinek klasik hassas hemostatik forsepsCodman30-4472
Mikro ekartörMurdock; Roboz Cerrahi AletRS-6550
Nonwoven gazlı bez süngerlerFisherband870-PC-DBL
Püriten 6 " Ahşap Saplı Küçük Pamuklu ÇubukPüriten Tıbbi Ürünler Şirketi868-WCS
Dumont SS Forseps - Standart Uçlar/Düz/Inox/13.5cmGüzel bilim araçları11203-23
Dumont SS Forseps - Standart Uçlar / Açılı 45 derece / Inox / 13.5cmGüzel bilim araçları11203-25
Vannas Yaylı Makas - 3mm Kesme Kenarıİnce bilim aletleri15000-00
Mikroiğne tutucuAesculap Cerrahi AletlerFD231R
Mikro AROSuture, steril 10-0 naylon sütür, 70 & m, TAP noktalarıAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
5 ml ŞırıngaBD309646
Falcon doku kültürü kabı, 60 > 15 mmCorning353002
Isoflurane, Amerika Birleşik Devletleri İnhalasyon için Farmakope (USP) sıvısı, 250 mlPiramal Sağlık NDC66794-017-25
Buprenex enjekte edilebilir (buprenorfin hidroklorür)Reckitt Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-0757-1
Enjeksiyon için Sefazolin, USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
PVP ovma çözeltisi (povidon ve ndash; İyot %7,5)MedlineNDC 12496-0757-1
%70 EtanolDecon Labs2716
Kalsiyum veya Magnezyum İçermeyen Fosfat Tamponlu SalinLONZA17-516F
Sirius KırmızıSigma365548
HematolksilinFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
FormalinFisherSF100-20

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver - Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
  2. Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
  3. Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
  4. Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
  5. Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  6. Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
  7. Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
  8. Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438(2015).
  9. Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
  10. Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
  11. Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378(1973).
  12. Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
  13. Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
  14. Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
  15. Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
  16. Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
  17. Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
  18. Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
  19. Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
  20. Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. Madame Curie Bioscience Database. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2013).
  21. Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
  22. Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874(2017).
  23. Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
  24. Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
  25. Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Partial Bile Duct LigationBile Duct LigationObstructive CholestasisHepatic Bile DuctLiver RegenerationSurgical TechniqueMouse ModelLiver InjuryBile Duct ProliferationLocalized Obstruction

Related Articles