Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Tümör microenvironment içinde ikamet veya işe Mezenkimal Kök hücre (MSCs) birden çok kanser türü Malign ilerlemesinde katkıda bulunur. Belirli çevre sinyalleri etkisi altında bu yetişkin kök hücreler lider hızlandırılmış tümör büyüme ve metastaz parakrin arabulucu serbest bırakabilirsiniz. Tümör ve MSCs arasında çapraz karışma tanımlama kanser ilerleme yatan mekanizmaları anlamak ve terapötik müdahale için yeni hedefler belirlemek için birincil önem taşımaktadır.
Kanser hücrelerinin derinden hedef hücreler tümör microenvironment veya uzak sitelerdeki davranışını etkileyebilir ekstraselüler veziküller (EVs), yüksek miktarlarda üretmek. Tümör EVs fonksiyonel biomolecules inflamatuar RNA'ların ve stromal hücreler kanser hücrelerinin metastatik davranış geliştirmek için veya önceden metastatik niş oluşumunda katılmak için eğitmek olabilir (onko) proteinler, dahil olmak üzere, alın. Bu makalede, belirli tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasındaki EV-aracılı crosstalk değerlendirilmesi sağlayan bir preklinik kanser fare modeli geliştirilmesi açıklar. İlk olarak, arıtma ve tümör salgılanan EVs karakterizasyonu ve EV içselleştirilmesi MSCs tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Biz o zaman yapmak MSC sitokin ifade profil İLETİMLERİNİZE değerlendirmek için çok katmanlı bir boncuk tabanlı immunoassay kullanımı kanseri EVs tarafından indüklenen. Son olarak, biz bir tümör-MSC etkileşim beyannamedir osteosarkom kollarındaki orthotopic xenograft fare modeli nesil göstermek ve EV eğitimli MSCs tümör büyüme ve metastaz oluşumu için katkı göstermek.
Bizim model nasıl kanser EVs tümör destekleyen bir ortam şekli tanımlamak ve abluka tümör ve MSCs arasındaki EV-aracılı iletişim kanser ilerleme engeller olup olmadığını değerlendirmek için fırsat sağlar.
Giriş
Tümör microenvironment metastaz oluşumu ve tedavi1direnç gelişimi de dahil olmak üzere tumorigenesis ve kanser progresyon çoğu, hepsi değilse de, özelliği aktif olarak katılmaktadır. Bu diseksiyon tümör niş içinde meydana gelen karmaşık tümör-stroma etkileşimlerin izin preklinik orthotopic kanser fare modelleri gerekliliğini vurguluyor.
Tümör microenvironment birçok hücresel bileşenleri arasında Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kuvvetle kanser meme kanseri, prostat kanseri, Beyin tümörleri, Multipl Miyelom ve osteosarkom2 gibi birden çok kanser türü ilerlemesinde katkıda ,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan yağ dokuları Mezenkimal Kök hücre izolasyon için kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylandıktan sonra (Hilversum, Hollanda) Tergooi Hastanesi plastik cerrahi bölümünden elde edilen ve aydınlatılmış onam yazılı. GFP pozitif adipose MSCs cerrahi Bilimler ve tıp bölümü çocuklar ve yetişkinler (üniversite, Modena ve Reggio Emilia) için elde edilmiştir.
Hayvan deneyleri hayvan deney üzerinde Hollanda kanunları uyarınca gerçekleştirilen ve protokol hayvan deney VU Üniversitesi Tıp Merkezi, Amsterdam, Hollanda Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hücre dışı veziküller tümör salgılanan yalıtım.
- 70.000 x ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada, osteosarkom salgılanan EVs MSCs pro tumorigenic ve pro-metastatik fenotip doğru eğitmek yeteneğini keşfettik. Biz osteosarkom hücreleri MSCs tarafından içselleştirilmiş eksozom benzeri EVs yayın gösterir. Biz kanser EVs tarafından indüklenen MSC sitokin ifade profil İLETİMLERİNİZE ölçülen ve EV eğitimli MSCs tümör büyüme ve metastaz oluşumu üzerinde etkisi değerlendirilir. Çalışma tasarım genel gösterimi şekil 1' de gösterilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre dışı veziküller (EVs) tümör salgılanan tümör destekleyici bir ortam oluşturmak için yerel ve uzak Mezenkimal hücreler fizyolojisi değiştirebilirsiniz. Burada diseksiyon tümör hücreleri arasında EV-aracılı etkileşimlerin sağlar osteosarkom preklinik fare modeli nesil tanımlamak ve (MSCs) vivoMezenkimal Kök hücreler. Biz insan tümör EV eğitimli MSCs osteosarkom xenografts şiddetle taşıyan farelerde sistemik enjeksiyon IL-6/STAT3 sinyal yolu7aktive ederek kanser büyüme ve metastaz oluş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
S.R. Baglio Associazione Italiana tarafından burs Cancro (AIRC) Co finanse la Ricerca sul Avrupa Birliği tarafından başına tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 660200 (S.R. Baglio) fon aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü > | |||
| Ultra Santrifüj | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | El yazmasında ultra sallanan kova rotoru olarak anılacaktır |
| Transmisyon elektron mikroskobu | Zeiss | EM109 | Veya benzeri TEM |
| Dijital fotoğraf makinesi | Nikon | DMX 1200F | Veya benzer bir kamera |
| Görüntüleme yazılımı TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Floresan mikroskobu | Zeiss | Imager.D2 | Veya benzeri Floresan mikroskobu |
| Görüntüleme yazılımı FM | Zeiss | ZEN Mavi | |
| İnkübatör | Nuaire | 4750E | |
| Santrifüj | Hettick | ROTANTA 460R-80 | |
| Dondurucu | Termo elektro şirketi | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Veya benzeri akış sitometresi |
| Matkap | Ferm | FCT-300 | 0,8 mm matkapla |
| HSS mikro bükümlü matkaplar, 0,8 mm | Proxxon | 28 852 | 0,8 mm matkap |
| IVIS kamera | Xenogen | Ivis Lumina | El yazmasında biyolüminesans kamera olarak anılacaktır. Xenogen artık Perkin Elmer |
| Living görüntü yazılımının bir parçası2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen artık Perkin Elmer |
| 10 µ'nun bir parçası; L Şırınga | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| İğne: Şırınga için Hamilton RN İğnesi, 26 Gauge, Pointstyle AS, özel uzunluk 2 cm | Hamilton | n.a.Caliper | |
| Mitutoyo | G08004463 | ||
| Otoklav | Astell | n.a.Isı | |
| Lambası | Philips | n.a. | |
| Kültür ortamı | |||
| Fetal Sığır Serumu | Hiklonu | RYG35912 | |
| Trombosit Lizat | n.a.n.a.IMDM | ||
| ortamı | Lonza | BE12-722F | |
| alfa-MEM ortamı | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM ortamı | Lonza | BE12-614F | |
| kalem/strep/glutamin | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Tripsin / EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Hücreler< / güçlü > | |||
| adipoz deriverd MSC'ler | |||
| MSC'ler | n.a.n.a | . | |
| 143B hücreleri | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B hücreleri | ATCC | CRL-8303 | Dönüştürülen |
| Tek Kullanımlık Malzemeler | |||
| Kültür şişeleri 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tüpler | Greiner bio-one | 210261 | |
| Dondurma tüpleri | Termobilimsel | 377224 | |
| Ultra Şeffaf tüpler | Beckman | 344058 | El yazmasında ultra santrifüj tüpleri |
| 0,22 ve mikro olarak anılacaktır; m filtre | Millex | SLGV033RS | |
| 200 gözlü Formvar-karbon kaplı nikel ızgaralar | EMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri) | ||
| 29G İğneli 0.5 mL insülin şırıngaları | Terumo | U-100 | |
| Petri kabı | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filtre kağıdı | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reaktifler / kitler | |||
| paraformaldehit | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehit | EMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri) | 16300 | |
| uranil oksalat | EMS (Elektron Mikroskobu Fen Bilimleri) | 22510 | |
| urany asetat | EMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri) | 22400 | |
| metil selüloz | EMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Makalede GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - insan inflamatuar sitokin kiti | BD | 551811 | |
| Formaldehit %37 | VWR | 104003100 | |
| Karbon Çelik cerrahi bıçaklar | Swann-Morton | 206 | El yazmasında cerrahi bıçak |
| anti-insan vimentin antikoru | Santa Cruz | sc-6260 | Klon V9 |
| Antikor seyreltici | DAKO | S0809 | |
| HRP etiketli anti fare IgG antikoru | Yaşam Teknolojileri | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoksillin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA tamponu | |||
| tamponu | |||
| poliklonal anti-GFP antikoru | Abcam | n.a.Ab290 | |
| DAPI | Yaşam Teknolojileri | D1306 | |
| Parasetamol, 120 mg / 5 ml şurup | Bayer | n.a.Sinaspril | , çocuklar için parasetamol çözeltisi |
| İzofluran 1000 mg / g | Vumc eczane | n.a.buprenofine | |
| hidroklorür, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | ||
| %2 | Vumc eczane | n.a.70 | |
| etanol | VWR | 93003.1006 | |
| Doku tutkalı | Derma + Flex, formüle edilmiş tıbbi siyanoakrilat | Vygon | LB604060 |
| Göz Damlası: Vidisec Karbojel, 2 mg / ml | Bausch + Lomb | ||
| , potasyum tuzu | Altın Biyoteknoloji | LUCK-1 | |
| Cam kaydıraklar | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Paslanmaz çelik halkalar | n.a.n.a | . | |
| Fareler deneyleri | |||
| Fareler, Hsd:Atimik Çıplak-Foxn1nu, dişi, varışta 6 hafta, bakteri durumu FELASA | ENVIGO | n.a.Kağıt | |
| hamuru akıllı ev (kafes zenginleştirme) | Bio Services | n.a.Alpha-dri | |
| yatak malzemesi | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Fare maması: Teklad global %18 proteinli kemirgen diyeti | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sütürler | Ethicon | V926H | |
| Makas | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (veya benzeri) |
| Cımbız | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (veya benzeri) |
Kaynaklar
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
