Yöntem makalesi

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 Mayıs 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör microenvironment içinde ikamet veya işe Mezenkimal Kök hücre (MSCs) birden çok kanser türü Malign ilerlemesinde katkıda bulunur. Belirli çevre sinyalleri etkisi altında bu yetişkin kök hücreler lider hızlandırılmış tümör büyüme ve metastaz parakrin arabulucu serbest bırakabilirsiniz. Tümör ve MSCs arasında çapraz karışma tanımlama kanser ilerleme yatan mekanizmaları anlamak ve terapötik müdahale için yeni hedefler belirlemek için birincil önem taşımaktadır.

Kanser hücrelerinin derinden hedef hücreler tümör microenvironment veya uzak sitelerdeki davranışını etkileyebilir ekstraselüler veziküller (EVs), yüksek miktarlarda üretmek. Tümör EVs fonksiyonel biomolecules inflamatuar RNA'ların ve stromal hücreler kanser hücrelerinin metastatik davranış geliştirmek için veya önceden metastatik niş oluşumunda katılmak için eğitmek olabilir (onko) proteinler, dahil olmak üzere, alın. Bu makalede, belirli tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasındaki EV-aracılı crosstalk değerlendirilmesi sağlayan bir preklinik kanser fare modeli geliştirilmesi açıklar. İlk olarak, arıtma ve tümör salgılanan EVs karakterizasyonu ve EV içselleştirilmesi MSCs tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Biz o zaman yapmak MSC sitokin ifade profil İLETİMLERİNİZE değerlendirmek için çok katmanlı bir boncuk tabanlı immunoassay kullanımı kanseri EVs tarafından indüklenen. Son olarak, biz bir tümör-MSC etkileşim beyannamedir osteosarkom kollarındaki orthotopic xenograft fare modeli nesil göstermek ve EV eğitimli MSCs tümör büyüme ve metastaz oluşumu için katkı göstermek.

Bizim model nasıl kanser EVs tümör destekleyen bir ortam şekli tanımlamak ve abluka tümör ve MSCs arasındaki EV-aracılı iletişim kanser ilerleme engeller olup olmadığını değerlendirmek için fırsat sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör microenvironment metastaz oluşumu ve tedavi1direnç gelişimi de dahil olmak üzere tumorigenesis ve kanser progresyon çoğu, hepsi değilse de, özelliği aktif olarak katılmaktadır. Bu diseksiyon tümör niş içinde meydana gelen karmaşık tümör-stroma etkileşimlerin izin preklinik orthotopic kanser fare modelleri gerekliliğini vurguluyor.

Tümör microenvironment birçok hücresel bileşenleri arasında Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kuvvetle kanser meme kanseri, prostat kanseri, Beyin tümörleri, Multipl Miyelom ve osteosarkom2 gibi birden çok kanser türü ilerlemesinde katkıda ,3,4,5,6,7. MSCs kemik iliği, yağ dokusu, plasenta, göbek kordon kanı ve diğerleri de dahil olmak üzere çeşitli yetişkin ve fetal dokularda,8,9bulunan multipotent kök hücreler vardır. İnflamatuar sinyaller kanser üretilen cevaben, MSCs tümör siteleri doğru geçiş, tümör microenvironment dahil etmek ve sonuçta kanser destek hücreleri10ayırt etmek. Bu kanser ilişkili MSCs temel faktörler (Yani, büyüme faktörleri, kemokinler, sitokinler ve immünsupresif arabulucu) tümör hücreleri hem de çevresindeki stroma2, hareket tümör ilerleme sağlamak 3 , 11 , 12 , 13. kanser ilişkili MSCs tümör teşvik etkileri çok sayıda kanser modellerinde araştırdık iken, hangi tarafından tümör hücreleri yeniden programlamak kanser teşvik niş şekillendirmek için MSCs mekanizmalar kötü anlaşılır. Burada özellikle kemik kanseri hücreleri ve MSCs pro tumorigenic etkileşimini ekstraselüler veziküller (EVs) yolu ile çalışma sağlar orthotopic xenograft modelinin üretimi açıklayın.

EVs tümör ve stromal hücreler14arasındaki hücreler arası iletişim çok önemli arabulucu vardır. EVs kökenli proteinler, lipidler ve gen düzenlemesinde de dahil olmak üzere hücrenin fonksiyonel biomolecules taşırlar. Ekstrasellüler alanda serbest sonra bu veziküller çevreleyen hücreleri tarafından alınabilir veya kan veya lenf dolaşımını üzerinden uzak sitelere yapılan ve hedef hücre davranış derinden etkileyebilir. 15 , 16 , 17 Mesela kanser EVs stromal fibroblastlar tarafından alımını angiogenez destekleyen ve tümör büyüme vivo içinde18,19, endotel tarafından içselleştirilmesi hızlanan myofibroblast ayrımında neden olabilir hücreler tümör angiogenez teşvik etmek ve vasküler geçirgenliği16,20artırmak ve bağışıklık hücreleri ile etkileşim antitümör bağışıklık yanıtı21bastırılması için neden olabilir.

Son zamanlarda biz, osteosarkom, tümör hücreleri tumorigenic pro ve pro-metastatik fenotip elde etmek için MSCs sor EVs yüksek miktarda serbest bir kollarındaki orthotopic xenograft fare modeli kullanarak gösterilmiştir. Bu efekt ("Yüksek lisans eğitim" anılacaktır) MSC sitokin ifade profil dramatik bir değişim kaynaklanmaktadır ve bir terapötik İnterlökin-6 reseptörü (IL-6R) antikor7yönetimi tarafından engellenebilir. Çalışmalarımız kanser EVs MSC davranış, böylece microenvironment hedefli yaklaşımlar osteosarkom ilerleme durdurmak için bir gerekçe sağlayan çok önemli modülatörler olduğunu gösterdi. Burada, EV-aracılı tümör-MSC etkileşim içinde vivoaraştırmak için adım adım bir protokol açıklar. Bu model için tasarlanmıştır: 1) özellikle kanser EV kaynaklı değişikliklere MSC davranışının tümör microenvironment define, 2) nasıl bu etkileşim katkıda kemik tümörü büyümesi ve metastaz oluşumu ve 3) çalışma için engel olup olmadığını değerlendirmek EV-aracılı crosstalk vivo içinde kanser ilerleme engeller.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan yağ dokuları Mezenkimal Kök hücre izolasyon için kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylandıktan sonra (Hilversum, Hollanda) Tergooi Hastanesi plastik cerrahi bölümünden elde edilen ve aydınlatılmış onam yazılı. GFP pozitif adipose MSCs cerrahi Bilimler ve tıp bölümü çocuklar ve yetişkinler (üniversite, Modena ve Reggio Emilia) için elde edilmiştir.

Hayvan deneyleri hayvan deney üzerinde Hollanda kanunları uyarınca gerçekleştirilen ve protokol hayvan deney VU Üniversitesi Tıp Merkezi, Amsterdam, Hollanda Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hücre dışı veziküller tümör salgılanan yalıtım.

  1. 70.000 x g gecede, FBS (14 saat), fren yok, son derece hareketli bir kova rotor kullanarak 4 ° C'de centrifuging tarafından EV tükenmiş Fetal sığır Serum (FBS) hazırlamak (1 h yavaşlama için beklemek). Dikkatle süpernatant (EV tükenmiş FBS) Pelet bozmadan toplamak. EV tükenmiş FBS 0,22 µm filtre ile filtre.
  2. Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (IMDM) ile 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 2 mM glutamin ilave tarafından EV tükenmiş kültür ortamı hazırlamak (1 x P/S/G) ve % 5 FBS EV boşaldı.
  3. 3 x 106 143B hücreleri 175 cm2 şişeler içinde tohum ve onları EV tükenmiş kültür orta bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2kültür. Hücreleri (genellikle sonra 36 h 48 h) % 80-90 birleşmesi olduğunda süpernatant EV-yalıtım için 8 x 175 cm2 şişeler (28 mL/şişesi) toplamak.
  4. Hücreleri ve hücre artıkları (önceki spin her zaman süpernatant centrifuging) farklı aralıklarla aşağıdaki protokolüne göre kaldırmak için hücre süpernatant önceden temizleyin:
    1. Süpernatant iki kere vasıl 500 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
    2. İki kez 15 dakika 2000 x g de süpernatant santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant iki kez, 10.000 x g 30 dk santrifüj kapasitesi.
    4. Tüm centrifugations maksimum hızlanma ve yavaşlama hızı ayarları ile 4 ° C'de gerçekleştirin. Her adımdan sonra toplamak dikkatli bir şekilde geride bırakarak yaklaşık 1 mL EV içeren süpernatant. 1.5 veya mağaza adım önceden temizlenmiş orta-80 ° c kadar EV yalıtım şartına hemen devam edin.
  5. EVs önceden temizlenmiş şartına orta bir kez 70.000 x g 1 h için centrifuging tarafından izole, fren, son derece hareketli bir kova rotor kullanarak ultra santrifüj tüpleri (son hacim 38,5 mL/tüp) 4 ° C'de yavaş.
  6. Dikkatle yaklaşık 1 mL arkasında, resuspend EV içeren granül içinde kalan cilt bırakarak süpernatant, kaldırmak, onları bütün bir ultracentrifuge tüpte havuz ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) tam tüp dolum kadar eklemek (son hacim 38,5 mL).
  7. Bir kez daha, 70.000 x g santrifüj fren olmadan 4 ° C'de 1 h için (1 h yavaşlama için beklemek). Dikkatle süpernatant Pelet bozmadan kaldırmak ve 100-200 µL geride.
  8. EV-Pelet resuspend ve son 200 µL için PBS (tüm EV-izolasyonların için standart) ile ses seviyesini. EV hazırlık hemen kullanın veya-80 ° C'de kullanım22kadar saklayabilirsiniz.
    Not: EVs-80 ° C'de 6 ay saklanabilir

2. EV karakterizasyonu.

Arıtılmış EVs transmisyon elektron mikroskobu (TEM)23tarafından görüntülenmeyecektir.

  1. %4 paraformaldehyde fosfat tampon eşit bir birimdeki Mix EV preps.
  2. Kat 200 mesh Formvar karbon kaplı nikel TEM Izgaralar ile EV süspansiyon için oda sıcaklığında 20 min 5 µL.
  3. EV örnekleri üzerinde TEM Izgaralar % 1 oxazolidin 0.1 M fosfat tampon (pH 7,0), uranyl oksalat (pH 7,0) ile kontrast ile bağlamak ve % 4 uranyl asetat ve % 2 metil selüloz buz üzerinde 1:9 oranında bir karışımı embed.
  4. Paslanmaz çelik döngüler ile ızgaraları kaldırmak ve uygun bir metil selüloz film kalınlığı sağlamak için filtre kağıdı ile aşırı sıvı leke.
  5. Kurutma, Izgaralar transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin ve karşılık gelen görüntü yazılımı birleştiğinde bir dijital kamera ile çekim.

3. eğitim MSCs tümör kaynaklı EVs tarafından.

  1. Alfa-en az gerekli orta (alfa-MEM) % 4 EV tükenmiş insan trombosit Lysate (hPL)24, heparin (10 U/mL) ve 1 İlave tarafından MSC kültür ortamı hazırlamak x P/S/G.
    Not: EV tükenmiş hPL 1.1 bölümünde açıklanan yordamı uygulamadan elde edilir.
  2. Tohum 1.4 x 106 yağ MSCs 75 cm2 şişe elde edilen ve onları bir kuluçka 37 ° C ve %5 CO2 EV tükenmiş MSC-kültür ortamında kültür.
  3. Ne zaman hücre % 70 izdiham ulaşmak, 143B osteosarkom - eklemek veya insan fibroblast (hf) kontrol-EVs, 10 µL EV hazırlık/cm2 / kültür şişesi. 24 saat boyunca kuluçkaya ve ek 6 saat EVs aynı miktarda ekleyin. Not: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM içinde) insan fibroblast kültürlü %10 FBS ve EVs 1 bölümünde açıklandığı gibi izole.
  4. MSC süpernatant toplamak, 1 x 500 x g (ile maksimum hızlanma ve yavaşlama hızı ayarları) 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, yeni bir tüp aktarın ve temizlenen süpernatant gelecekteki sitokin analiz (Bölüm 5) etkinleştirmek için-80 ° C'de depolayın.
  5. İçin in vivo deneyler (Bölüm 6), 3.1-3.3 bölümlerinde açıklandığı gibi GFP pozitif MSCs25 eğitmek hücreleri toplamak ve onları tutmak hücrelere 100 µL. buz başına 106 hücre son bir konsantrasyon enjeksiyon kadar PBS içinde resuspend.

4. EV içselleştirilmesi tahlil.

EV alımı MSCs tarafından görselleştirmek için üreticinin protokol sonrası EVs bir yeşil-floresan bağlayıcı boya (GFLD) (ticari olarak mevcut) etiket:

  1. Kısaca, eritici 180 µL 200 µL EV Hazırlık'a ekleyin. GFLD seyreltik 1 µL seyreltici 50 µL içinde boya ve sulandırılmış boya 20 µL seyreltilmiş EV Hazırlık'a ekleyin.
  2. Yavaşça pipetting tarafından mix ve karanlık oda sıcaklığında 3 min için kuluçkaya.
  3. 5 mL %0,1 BSA PBS içinde ekleyin, ultra santrifüj tüpleri için aktarmak ve tüp PBS (son hacim 38,5 mL/tüp) ile doldurun.
  4. 1 x 1 h fren olmadan 4 ° C'de için 70.000 x g, santrifüj kapasitesi (1 h yavaşlama için beklemek). Dikkatle süpernatant kaldırmak ve etiketli EV Pelet 200 µL son bir hacim içinde resuspend (PBS ile ses seviyesini).
  5. MSC kültür etiketli EVs eklemek veya bunları-80 ° C'de saklamak Gecede kuluçka sonra vezikül içselleştirilmesi Floresans mikroskobu tarafından değerlendirmek ve Akış Sitometresi7.

5. MSC sitokin ifade profil değerlendirilmesi.

  1. İnterlökin-8 (Il-8) Çoklu miktar için İnterlökin-1β (IL-1β), İnterlökin-6 (Il-6), İnterlökin-10 (IL-10), tümör nekrozis faktör (TNF) ve İnterlökin - 12p 70 (IL - 12p 70) protein düzeyleri Master programı içinde orta şartına (bkz. Adım 3.4), kullanmak bir üreticinin yönergelerini izleyerek insan inflamatuar sitokinlerin için piyasada bulunan sitometrik boncuk dizisi (CBA).
  2. Kısaca, antikor Birleşik yakalama boncuk mix ve onları tüm tahlil tüpler için ekleyin. Sitokin standart dilutions ya da klimalı orta örnekleri tüpler için ekleyin.
  3. Algılama reaktif ekleyin ve RT. 3 saat kuluçkaya
  4. Boncuk sağlanan yıkama solüsyonu ile yıkayın. Akış Sitometresi kullanarak örnekleri ölçmek ve üreticinin yönergelerine göre verileri çözümleyebilirsiniz.

6. nesil osteosarkom bir Orthotopic Xenograft fare modeli.

  1. Deneysel yordamları başlatmadan önce en az bir hafta için parkenizin altı-hafta-yaşlı, kadın, korele çıplak-Foxn1nu fareler sağlar.
  2. Bir gün önce cerrahi işlem ve peri-operatif analjezi olarak Parasetamol içme suyu ekleyin. "Çocuklar için Parasetamol çözüm" seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek) 2 mg/mL nihai bir konsantrasyon almak için su ile. 150 mL/kg bir ortalama su alımı dayalı/gün, ve bir ortalama vücut ağırlığı 20 g, bu doz 6 mg doz ulaşmak/fare için yeterli/gün (300 mg/kg/gün).
  3. Analjezik tedavi operasyon sonrasında veya daha uzun hayvanlar göstermek işaret-in acı 24 saat kadar devam edin.
  4. Cerrahi işlem gününde, 300 x g 10 min için de centrifuging tarafından kültürlü luciferase pozitif (Fluc) 143B hücreleri (daha önce lentiviral iletim tarafından oluşturulan) toplamak ve 2 x 105 hücre/µL PBS içinde bir konsantrasyon hücreleri resuspend. Buz üzerinde hücre süspansiyon için 6 saat tutun.
  5. Otoklav cerrahî donanımlar. Hazırlamak ve çalışma alanı temiz ve steril makas ve cımbız steril sayfalarda yer. 20 dk önce cerrahi işlem (6,8. adım) enjekte hayvanlar subkutan buprenorfin (0,05 mg/kg, % 0,9 serum içinde seyreltilmiş) ile 0.5 mL insülin şırınga (29'lik iğne) kullanarak analjezik.
  6. Her hayvan anesthetizing önce 10 µL şırıngaya doldur konsantre (Fluc) 143B hücre süspansiyon en az 1 µL ile (bkz. Adım 6.4).
  7. Hayvan isoflurane inhalasyon anestezi (oksijen 2-%3) ile anestezi. Anestezi düzeyini hayvan ayak-pinching tarafından kontrol edin. Merhem gözlerde kuruluk anestezi sırasında önlemek için geçerli hayvan, derin anestezi, Yani, pinching için tepki vermez.
  8. Sırtında bir anestezi maskesi kafasından ve operatör doğru ayaklı hayvan getirin. Sol diz esnek. % 70 etanol ile cildinizi silin ve lidokain (% 2) ile pamuk bahşiş yerel analjezik olarak 3 kez uygulayın.
  9. Steril cerrahi bıçak tibia ortaya çıkarmak için sadece diz altında deri üzerinde küçük bir insizyon attım (yaklaşık 5 mm) yapmak için kullanın. Bir iğne deliği Tibia, 0.8 mm mikro bükülme matkap kullanarak diz altında yaklaşık 2 mm matkap. Her iki tibia cortices ayrıntısına değil dikkatli olun.
  10. 1 µL hücre süspansiyon (yaklaşık 2 x 105 hücreleri) yavaş yavaş (yaklaşık 5 saniye içinde) 26'lik iğne kullanarak delik enjekte. Bir damlacık doku yapıştırıcısı geri tepme süspansiyon önlemek için o deliği kapatın.
  11. Cilt monofilament dikişler ve doku tutkal bir damla ile kapatın. İyi ısıtmalı ortamında (kullanım a ısı lamba) hayvan kurtarmak izin. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine kadar hayvanları sahipsiz bırakmayın. Sadece hayvanlar tam anesteziden kurtarıldı sonra onları kendi kafesleri için dönün.
  12. İki gün sonra tümör aşılama, enjekte eğitimli EV veya saf GFP pozitif MSCs (100 µL PBS, 106 hücrelerde bkz: Adım 3.5) intravenöz 0.5 mL insülin şırınga fareler kuyruk ven ile.
  13. Tümör büyüme26 haftada iki kez Imaging bioluminescence tarafından takip. Bu amaçla, fareler ı.p. ile 150 µL enjekte D-biyoluminesans (30 mg/mL) bir insülin şırınga ile. On dakika sonra enjeksiyon, hayvanlar görüntüleme sistemi bioluminescence getirin ve tümör hücreleri tarafından oluşturulan foton-flux ölçmek.
  14. Buna ek olarak, birincil kemik tümörü bir kumpas ile çapını ölçün. Tümör hacminde (mm3) Genişlik uzunluğu2 x 0.5 x tarafından tahmin edilmektedir.
  15. Not: İnsancıl bitiş noktaları tümör çapı tanımlanan > 15 mm veya kilo kaybı > % 15.

7. akciğer nodül numarası değerlendirilmesi

  1. Hayvanlardan biri (yaklaşık 3-4 hafta içinde) 6,14. adımda tanımlanan insana ilişkin son nokta ulaştığında, deneme bitirmek ve toplamak ve tüm ilgili dokuları analiz.
  2. Euthanization önce 10 dk enjekte 150 µL D-biyoluminesans (30 mg/mL) 0.5 mL insülin şırınga ile.
  3. İsoflurane inhalasyon anestezi hayvanlarla anestezi (bkz. Adım 6,7). Anestezi derinliği tepkiler fare parmak pinching yokluğu ile onaylayın. Fareler servikal çıkığı27tarafından ötenazi.
  4. Akciğer, karaciğer, dalak ve böbreklerin sterilize makas ve cımbız kullanarak toplamak. Organları PBS kan izlerini kaldırmak ve bir petri koymak onları yıkayın.
  5. Petri kabına organları ile görüntüleme sistemi bioluminescence yerleştirin. Bioluminescence sinyal organların her iki tarafta ölçmek. Hemen ölçme sonra onları (24-72 saat, RT) bağlamak için % 4 formalin organlarda gelecekteki histolojik analiz için Dalma.
  6. Uygun görüntüleme yazılımı ile elde edilen resimler tarafından el ile eşik işlemek. Akciğer nodüller her resim üzerinde saymak. Her iki akciğer akciğer nodüller toplam sayısını saymak.

8. histolojik analizi

  1. Akciğer dokusu histolojik analizi için:
    1. Formalin sabit organları parafin içinde katıştırabilir ve 6 µm doku slayt hazırlamak.
    2. Deparaffinate Akciğer doku slaytlar ve 0.01 M sitrat arabelleği (pH 6) 15 dakika kaynatılarak antijen alma gerçekleştirmek.
    3. Yatay olarak, oda sıcaklığında Anti-insan vimentin seyreltilmiş antikor (200 µg/mL) 1:150 antikor-eritici (ticari) ve daha sonra ikincil, HRP etiketli antikor (0,5 mg/mL, seyreltme 1:500) ile slaytlar kuluçkaya. 3'-diaminobenzidine (DAB) ve Hematoksilen sayaç boyama kurcalayarak leke.
    4. Karşılık gelen kamera ve görüntü yazılımı birleştiğinde bir optik mikroskop kullanarak lekeli doku slaytlar gözlemlemek.
  2. Fare yırtılmalarıteşhis GFP pozitif MSCs varlığı değerlendirmek için:
    1. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 0,24 M, pH 7.2 7.4 yırtılmalarıteşhis decalcify. EDTA arabellek her geçen gün kemik (yaklaşık 1 hafta) esnek olmak kadar yenileyin.
    2. Yırtılmalarıteşhis kurutmak ve onları parafin ile sızmak. (Osteosarkom doku dahil) yırtılmalarıteşhis parafin blok gömün.
    3. 6 µm parafin kesitler hazırlamak için bir microtome kullanın. Parafin kesitler cam slaytlar üzerine yerleştirin. Kuruduktan sonra slaytlar gecede, oda sıcaklığında saklayın.
    4. Isı-aracılı antijen alma sitrat tampon kullanarak gerçekleştirmek (8.1.2 bakınız) ve 1:900 seyreltme antikor-eritici olarak anti-GFP antikor (bütün Anti-serum) kurcalayarak leke. Dokular ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain.
    5. Doku slaytlar ile ilgili görüntüleme yazılımı için birleştiğinde floresan mikroskop gözlemlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, osteosarkom salgılanan EVs MSCs pro tumorigenic ve pro-metastatik fenotip doğru eğitmek yeteneğini keşfettik. Biz osteosarkom hücreleri MSCs tarafından içselleştirilmiş eksozom benzeri EVs yayın gösterir. Biz kanser EVs tarafından indüklenen MSC sitokin ifade profil İLETİMLERİNİZE ölçülen ve EV eğitimli MSCs tümör büyüme ve metastaz oluşumu üzerinde etkisi değerlendirilir. Çalışma tasarım genel gösterimi şekil 1' de gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVs) tümör salgılanan tümör destekleyici bir ortam oluşturmak için yerel ve uzak Mezenkimal hücreler fizyolojisi değiştirebilirsiniz. Burada diseksiyon tümör hücreleri arasında EV-aracılı etkileşimlerin sağlar osteosarkom preklinik fare modeli nesil tanımlamak ve (MSCs) vivoMezenkimal Kök hücreler. Biz insan tümör EV eğitimli MSCs osteosarkom xenografts şiddetle taşıyan farelerde sistemik enjeksiyon IL-6/STAT3 sinyal yolu7aktive ederek kanser büyüme ve metastaz oluş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. Baglio Associazione Italiana tarafından burs Cancro (AIRC) Co finanse la Ricerca sul Avrupa Birliği tarafından başına tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 660200 (S.R. Baglio) fon aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman< / güçlü >
Ultra SantrifüjBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650El yazmasında ultra sallanan kova rotoru olarak anılacaktır
Transmisyon elektron mikroskobuZeissEM109Veya benzeri TEM
Dijital fotoğraf makinesiNikonDMX 1200FVeya benzer bir kamera
Görüntüleme yazılımı TEM NikonACT-1
Floresan mikroskobuZeissImager.D2Veya benzeri Floresan mikroskobu
Görüntüleme yazılımı FMZeissZEN Mavi
İnkübatörNuaire4750E
SantrifüjHettickROTANTA 460R-80
DondurucuTermo elektro şirketin.a.
FACSBDBD FACScaliburVeya benzeri akış sitometresi
MatkapFermFCT-3000,8 mm matkapla
HSS mikro bükümlü matkaplar, 0,8 mmProxxon28 8520,8 mm matkap
IVIS kameraXenogenIvis LuminaEl yazmasında biyolüminesans kamera olarak anılacaktır. Xenogen artık Perkin Elmer
Living görüntü yazılımının bir parçası2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen artık Perkin Elmer
10 µ'nun bir parçası; L ŞırıngaHamiltonNeuros Model 1701 RN
İğne: Şırınga için Hamilton RN İğnesi, 26 Gauge, Pointstyle AS, özel uzunluk 2 cmHamiltonn.a.Caliper
MitutoyoG08004463
OtoklavAstelln.a.Isı
LambasıPhilipsn.a.
Kültür ortamı
Fetal Sığır SerumuHiklonuRYG35912
Trombosit Lizatn.a.n.a.IMDM
ortamıLonzaBE12-722F
alfa-MEM ortamıLonzaBE02-002F
DMEM ortamıLonzaBE12-614F
kalem/strep/glutaminGIBCO10378-016
heparinLEO012866-08
Tripsin / EDTA (10x)GIBCO15400-054
Hücreler< / güçlü >
adipoz deriverd MSC'ler
MSC'lern.a.n.a.
143B hücreleriATCCCRL-8303
FLUC-143B hücreleriATCCCRL-8303Dönüştürülen
Tek Kullanımlık Malzemeler
Kültür şişeleri 175 cm2CELLSTAR660175
50 mL tüplerGreiner bio-one210261
Dondurma tüpleriTermobilimsel377224
Ultra Şeffaf tüplerBeckman344058El yazmasında ultra santrifüj tüpleri
0,22 ve mikro olarak anılacaktır; m filtreMillexSLGV033RS
200 gözlü Formvar-karbon kaplı nikel ızgaralarEMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri)
29G İğneli 0.5 mL insülin şırıngalarıTerumoU-100 
Petri kabıSigma - AldrichP7612
Filtre kağıdı Thermo fisher Scientific50363215
Reaktifler / kitler
paraformaldehitAlfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
glutaraldehitEMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri)16300
uranil oksalatEMS (Elektron Mikroskobu Fen Bilimleri)22510
urany asetatEMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri)22400
metil selülozEMS (Elektron Mikroskobu Bilimleri)1560
PKH67Sigmamini67-1ktMakalede GFLD
BSASigmaA8412
CBA - insan inflamatuar sitokin kitiBD551811
Formaldehit %37VWR104003100
Karbon Çelik cerrahi bıçaklarSwann-Morton206El yazmasında cerrahi bıçak
anti-insan vimentin antikoruSanta Cruzsc-6260Klon V9
Antikor seyrelticiDAKOS0809
HRP etiketli anti fare IgG antikoruYaşam Teknolojileri32230
DAB-kitDAKOK500711
hematoksillinSigmaGHS232
EDTA tamponu
tamponu
poliklonal anti-GFP antikoruAbcamn.a.Ab290
DAPI Yaşam TeknolojileriD1306
Parasetamol, 120 mg / 5 ml şurupBayern.a.Sinaspril, çocuklar için parasetamol çözeltisi
İzofluran 1000 mg / gVumc eczanen.a.buprenofine
hidroklorür, 0.3 mg/mlIndivior UK Limited
%2Vumc eczanen.a.70
etanolVWR93003.1006
Doku tutkalıDerma + Flex, formüle edilmiş tıbbi siyanoakrilatVygonLB604060
Göz Damlası: Vidisec Karbojel, 2 mg / mlBausch + Lomb
, potasyum tuzuAltın BiyoteknolojiLUCK-1
Cam kaydıraklarThermo scientific630-0954
Paslanmaz çelik halkalar n.a.n.a.
Fareler deneyleri
Fareler, Hsd:Atimik Çıplak-Foxn1nu,  dişi, varışta 6 hafta, bakteri durumu FELASAENVIGOn.a.Kağıt
hamuru akıllı ev (kafes zenginleştirme)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
yatak malzemesiShepperd Speciality Papersn.a.
Fare maması: Teklad global %18 proteinli kemirgen diyetiENVIGO2918-11416M
SütürlerEthiconV926H
MakasSigma-AldrichS3146-1EA(veya benzeri)
CımbızSigma-AldrichF4142-1EA(veya benzeri)
n.a.n.a.GFP-pozitif n.a.n.a.Sitrat n.a.n.a.tavşan n.a.lidokain-HCL % naPD-lusiferin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D Vezik l Salg lanmasT m r EV leriEV PurifikasyonuOrtotopik KsenogreftBiyol minesans G r nt lemeSitokin EkspresyonuMSC HomingAkci er MetastazEV Al m

İlgili makaleler