Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

CTCs önemli bir adım kanser hücre yayma¹temsil eder. Hastaların periferik kan onların huzurunda (metastatik) nüks hastalık ilerleme^2,ve³ile ilişkilidir. CTC yalıtım ve kandan karakterizasyonu kanserli hastalarda non-invaziv sıvı biyopsi bir türüdür. Son yıllarda giderek belirgin ilerleme ve bu tür bir analiz kullanarak farklı tedaviler tümör yanıtı izleme önemli klinik bilgiler^4,5sağlar haline gelmiştir. Sıvı biyopsi daha yararlı ne zaman cerrahi mümkün değildir ya da ne zaman birincil tümör doku mevcut değil Yani, Sigara biopsiable lezyonlar için. Bu nedenle, bu yaklaşım metastatik NSCLC, nerede CTCs varlığı bir negatif prognostik rol⁶için gösterildiği gibi belirli kanser ayarlarında umut verici. NSCLC hedefli tedavi yaklaşımları^7,8,9 belirli molekülleri (moleküler hedef) büyüme, ilerleme, dahil olduğu bilinen herhangi bir işlem için tasarlanmış özellikle yararlanır bir tümör olduğunu ve hastalığın yayılmasını. Bu nedenle, belirli hedefleri algılama hastalık ilerlemesi sırasında gereklidir. CTC soruşturma algılamak ve birincil veya metastatik dokular için gerek kalmadan ilaç hedefleri izlemek için son derece ilginç bir tanı yaklaşımdır. Örneğin, ALK gen translokasyonlar NSCLC hücrelerdeki tespiti crizotinib, belirli hedefe yönelik tedavi¹⁰duyarlılık ile ilişkilidir. Ancak, şu anda, sadece ince iğne örnekleri veya küçük biyopsi ALK translokasyonlar tespiti yürütülür; Sonuç olarak, bir tümör doku ALK analizi mümkün değildir. CTCs bir potansiyel tümör doku tabanlı araştırmalar alternatiftir ve son derece gelecek vaat eden bir arkadaşı tanı yaklaşımı temsil eder.

Potansiyel önemine rağmen CTCs hala çoğunlukla nedeniyle onların nadir (1-10 periferik kan¹¹hücre/mL) araştırma arasında büyük tartışma konusu vardır. Geçerli sıvı biyopsi yöntemleri kan (Yani, 1-30 mL)^12,13, sınırlı bir miktarda kullanmak ama bu suboptimal hassasiyeti CTCs. dolayısıyla algılanması için bir durum oluşturur, araştırma bulmak için garanti yaklaşımlar ve periferik kan daha büyük bir hacim sıvı biyopsi CTC hedefli gerçekleştirmek için aygıtları geliştirme.

Başka bir aygıtı, functionalized tıbbi tel (bakınız Tablo malzemeler), kan örnekleme sınırlamalarının üstesinden gelir ve CTCs daha temsili bir analizini elde etmek için geliştirilmiştir. Bu functionalized tel CTCs doğrudan kanser hastaları¹kan yakalar CE onaylı tıbbi cihaz var. Altın 0.2 µm kalınlığında tabaka ile kaplı bir 2 cm uzun functionalized ucu ile bir 16 cm uzunluğunda paslanmaz çelik tel (Şekil 1a) oluşmaktadır. Katmanın sırayla kovalent EpCAM, biri en yaygın ifade antijenleri CTCs¹⁴yüzeyi karşı antikorlar ile birleştiğinde bir 1-5 µm kalınlığında polycarboxylate hidrojel tabaka ile kaplıdır. Tel functionalized ucu hastanın kol bir damar içine tanıtıldı ve pozisyon için en az 30 dk içinde kalır. Bu yaklaşım doğrudan periferik kan ve ekrana yaklaşık 1,5-3,0 L kan (yaklaşık 300-fold daha fazla alternatif yaklaşımlar için kullanılan birim)¹. CTCs içinde vivo izolasyonu sağlar

Pantel ve ark. CTCs doğrudan akciğer kanseri hastaları¹⁵kol damarlar izole bu yaklaşım etkinliğini göstermiştir. Onlar tel ayirt CTCs EpCAM ve pan-cytokeratin ve CD45 karşı leucocyte algılama için yönettiği Geleneksel antikorlar kullanarak tanımlamak için boyama yapılır. Tel altında bir optik floresan mikroskop¹⁵incelenmiştir. Yazarlar cihazın CTCs izole etmeyi başardı, ama onlar herhangi bir terapi ile ilgili hedefleri, ALK translokasyonlar gibi araştırmak değil gösterdi.

NSCLC hücre hatlarında phenotypical parametreleri, örneğin, EpCAM pozitifliği ve moleküler biyolojik, örneğin ALK durumu (Şekil 1b) varlığı temelinde sözde CTCs tanımlamak için sunulan yöntem amaçlamaktadır. Bu 3 gün boyu yordamı functionalized tel ve DNA Floresan -in-situile boyama ayirt birleştirir-hibridizasyon (DNA balık), adlı IMMUNO-DNA-balık. CTCs nadir varlıklar olduğunu göz önüne alındığında, bu protokol CTCs immunophenotypic özellikleri ve DNA düzenlemeler açısından aynı tel üzerinde karakterize edilebilir bir avantajdır.

1. IMMUNO-DNA balık 2D Coverslip üzerinde

1. Coverslip hazırlık ve yapışık hücre tohumlama
   Not: steril koşullarda Laminer akış başlık altında tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Coverslip onları dezenfekte için % 100 etanol bırakın.
      Not: Biz (tüm reaktifler Malzemeler tablolistelenir) 12 mm x 12 mm silikon destekli kare coverslips kullanın.
   2. Coverslips bir petri (100 mm çap) yerleştirin. Kuru kullanarak hava akımı 5 min için zorladı.
   3. Yıkama 15 mL steril 1 × Dulbecco'nın fosfat ile Petri kabına arabelleğe alınmış serum (PBS).
   4. Petri kabına 10 mL tam orta ile yıkayın (bkz. Tablo 1).
   5. Tohum yapışık hücreleri (orta, 10 mL yaklaşık 1,650,000 hücrelerde sayılan göre FACS analiz) hücre süspansiyon üzerine tek tip hücre kaplama (yaklaşık 30.000 hücre/cm²) elde etmek için Petri kabına yavaşça bırakarak.
      : Adres defteri ~ % 70 izdiham, yapışık hücreleri üzerinde en az 48 saat için coverslips kültürlü.
2. Fiksasyon ve permeabilization
   Dikkat: Aseton bir yanıcı ve Uçucu madde rahatsız edici olduğunu. Sadece aseton dayanıklı plastik ya da cam kaplar (PVC veya PVDF) kullanın.
   Not: bir kimyasal duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Kültür orta bir tek kullanımlık alıyorum damlalıklı kullanarak kaldırın.
   2. Petri kabına 1 × PBS ile yıkayın.
   3. Cımbız kullanarak, coverslips 5 mL 1 × PBS de içeren bir cam kabı daldırma tarafından yıkayın.
   4. Bloting kağıt üzerinde coverslips kuru.
   5. Hücreleri üzerinde coverslip (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için bir %100 aseton çözüm içine çeker tarafından tamir.
   6. Coverslip tarafından cımbız kaldırmak. Cebri hava akışı için 5 dk kullanarak coverslip kuru.
      Not: Protokol bu noktada duraklatılmış. Coverslip-20 ° C'de muhafaza edilmelidir
3. Ayirt gün 1
   Not: Bu aşamada bir gecelik (O/N) kuluçka içerir (~ 16 h).
   1. Coverslips iki kez 1 × PBS yıkayın.
   2. 100 µL antikor seyreltme arabelleğinin damla (ayrıntılı bilgi için bkz: Tablo 1 ) üzerine coverslip ve RT, 30 dk için kuluçkaya
      Not: Tüm coverslip kapak ve taşması riskini önlemek amacıyla coverslip yüzey temelinde çözüm cilt ayarlanmalıdır.
   3. 1:20 antikor karışımının (Tablo 1) hazırlamak birincil Monoklonal antikor seyreltme Birleşik üreticisi tarafından sağlanan veri sayfasında belirtildiği gibi fluorochrome ve antikor seyreltme arabelleği ile.
      Not: Bu güçlü monoklonal antikorlar ile transfer fluorochrome Birleşik kullanmak için tavsiye edilir. Transfer fluorochrome kullandıysanız, protokol DNA-balık adımları sırasında kullanılan sıcaklık fluorochrome zarar ve floresan emisyon söndürmek. Bu protokol için biz bir EpCAM-FITC antikor için seçti (1:20 seyreltme), hangi değil çok kullanılan sıcaklık ile herhangi bir önemli sorun göstermek did.
   4. Coverslips iki kez 1 × PBS durulayın.
   5. Coverslips hücre tarafı yukarı coverslip üzerinde antikor karışımı nemli bir odası ve bırak 100 µL yerleştirin.
      Not: Tüm coverslip kapak ve taşma riski azaltmak için coverslip yüzeyi temelinde çözüm cilt ayarlanmalıdır.
   6. O/N kuluçkaya (~ 16 h) 4 ° C'de karanlıkta
4. Ayirt gün 2
   1. Antikor kuluçka coverslips 1 × PBS iki kez yıkayarak engelleyin.
      Not: balık tahlil gerçekleştirilene kadar mağaza coverslips 1 × PBS 4 ° C'de bir odasında karanlıkta sürekli nemli ortamı ile 100 µL dalmış.
5. 2D DNA-balık gün 2
   Dikkat: Özel ilgi aletleri ve nemli odası yüksek sıcaklığı ödenmesi gerekmektedir.
   1. Hibridizasyon fırın ve kuru ısı fırın ayarlayın (~ DNA-balık Protokolü başlamadan önce 3 h). Hibridizasyon fırın 75 ° C'de ayarla, Kuru sıcak fırın 37 ° C'de ayarla ve 0.4 × SSC çözüm serin (pH = 7.0 ± 0,1) (SSC tarifi için bkz: Tablo 1) ile 4 ° c
      Not: balık arabellekleri durumunu pH önemlidir: pH = 7.0 ± 0,1.
   2. Coverslip üç kez 0.4 Buz gibi × SSC çözümde yıkayın.
   3. Coverslip karanlıkta 10 min için bir kimyasal duman başlık altında kuru.
   4. 10 için girdap s ve sonda-tüp duvardan aşağı inceleyebilirsek hızlı bir tur (maksimum hızda) gerçekleştirin.
   5. Coverslip hücre tarafı 5 µL balık sondanın bir slayt ve mühür tüm kenarları kauçuk çimento ile coverslip bir damla üzerine yerleştirin.
      Uyarı: Yüksek sıcaklık sonraki iki adımı gerektirir. Koruyucu eldiven giymek.
   6. Slayt 8 dk. 75 ° c tam DNA denatürasyon için hibridizasyon fırında bir karanlık nemli odasına koy.
   7. Nemli odası 37 kuru sıcak fırına taşımak ° C O/n
6. 2D DNA-balık gün 3
   1. Su banyosu 72 ° C'de ayarla ve (Tablo 1) 0.4 × SSC arabelleği ile bir slayt boyama kavanoz yerleştirin. 30 dakika sonra olmalıdır 72 ± 0.4 × SSC arabellek sıcaklığı kontrol 1 ° C.
   2. İki cam şişeler hazırlamak: bir 2 × SSC + % 0.05 arası arabellek ile (pH = 7.0 ± 0,1) (Tablo 1) ve ikinci bir distile su ile.
   3. Nemli odası Kaldır fırın, dikkatle kauçuk çimento slaytından kaldırmak ve coverslip cımbız ile bağlantısını kesin.
   4. Daldırma 0.4 × SSC 72 ° C'de 2 min için tarafından coverslip yıkama
   5. 2 × SSC + % 0.05 arası arabellek için 30 daldırma tarafından coverslip yıkama s.
   6. Coverslip distile suda yıkayın.
   7. Coverslips karanlıkta 10 min için bir kimyasal duman başlık altında kuru.
   8. Coverslip sıvı montaj orta 1,5 µg/mL 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI toplam DNA counterstain) ile bağlayın. Coverslip hücre tarafı 5 µL montaj orta bir slayttaki bir damla üzerine yerleştirin, cımbız hava dışarı almak ve oje ile mühür için coverslip basın.
      Not: Orta birim takma coverslip yüzeyi boyutu temelinde ayarlanmalıdır.
7. 2D mikroskop gözlem ve analiz
   Not: Resimler farklı mikroskop sistemleri ile elde edilebilir.

1. 12-bit dijital fotoğraf makinesi ve 20 × / 0,50 NA ve 40 × / 0,65 NA amaç bulunan kırmızı için uygun filtreler kullanılarak görüntüleri (uyarma: 599 nm, emisyon: 588 nm), yeşil (uyarma: 509, emisyon: 524) ve mavi (uyarma: 367 nm, emisyon: 452 nm) probları.
2. Yazılım aracı olarak kullanarak görüntüleri analiz.
   Not: ayirt boyama ve ALK-sonda yerelleştirme değerlendirmek için biz ImageJ kullanılır. Slaytlar-20 ° c en fazla 2 hafta karanlıkta saklanır. Uzun süreli depolama için özel montaj orta uzun süreli depolama için kullanarak öneririz.

2. IMMUNO-DNA balık tel üzerinde

1. Hücre spike giriş tel (3D desteği)
   Not: Ön kurulum doğru içerir yapışık yelpazesi hücre satırlarını EpCAM-pozitif göre. Böylece yalnızca EpCAM pozitif hücreleri lekeli tel anti-EpCAM antikorlar ile functionalized.
   Not: herhangi bir zarar görmemesi için tel functionalized parçası dokunmayın.
   Not: Tüm adımları steril koşullarda laminar akış başlık altında yapılmalıdır.
   1. Bir T75 şişesi (% 80 izdiham) tüm içeriğini kullanarak tam orta 4 mL 5 mL şişede resuspend; bir tek spike bileşeni için yaklaşık 2.000.000 hücreleri hücre adezyon tel en üst düzeye çıkarmak için tavsiye edilir.
   2. Tel, cam paketinden çıkarın.
   3. Tel tel-tıpa şişe için su geçirmez bir uyum sağlanması şişe içine functionalized altın parçası daldırma. Tutkal ile laboratuvar film.
      Not: Tel-tıpa ve şişe arasında doğru bir maç için izin vermek için 5 mL tüp kullanılması önerilir.
   4. RT, 30 dk içinde bir tüp rotator için kuluçkaya (0-120 açı).
   5. Tel 3 farklı temiz şişeleri kullanarak 1 × PBS solüsyonu içinde üç kez yıkayın.
2. Fiksasyon ve permeabilization
   Dikkat: Aseton solunum yolu rahatsız edebilir yanıcı bir maddedir. Sadece aseton dayanıklı plastik ya da cam kaplar (PVC veya PVDF) kullanın.
   Not: bir kimyasal duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Tel kuruması.
   2. Hücreleri aseton % 100 çözüm RT. kullanımı, 10 min için tel daldırma tarafından 5 mL tüp düzeltmek.
      Not: Tel-tıpa ile temas sabitleştirici gelmek gerekir.
   3. RT, 5 min için tel kuruması
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Tel-20 ° C'de muhafaza edilmelidir Zaman uzun süreli depolama için tel ambalaj, tel-tıpa functionalized ucunu yanındaki ve dikkatle tel functionalized ucunu zarar vermemeye dikkat çekici depolama cam tüp yerleştirin. Depolama cam kapatın ve (dikey veya yatay olarak)-20 ° C'de depolayın
3. Ayirt gün 1
   Not: Bu aşamada bir O/N kuluçka içerir (~ 16 h).
   1. 5 mL tüp kullanarak iki kez 1 × PBS çözümde yıkayın.
   2. RT 5 mL tüp kullanarak, 30 dk için antikor seyreltme arabellek tel kuluçkaya.
   3. Antikor karışımı 150 µL birincil Monoklonal antikor antikor seyreltme arabellek, veri sayfasında belirtildiği gibi fluorochrome ile Birleşik bir seyreltme ile hazırlayın. Örneğin, bir 1:20 EpCAM-FITC antikor kullanılan seyreltme.
   4. P200 ipucu kuluçka, aşağıdaki gibi gerçekleştirmek için kullanın: tel tel-tıpa ayıklamak ve yavaşça uç daha büyük delik tellerden eklemek. Unfunctionalized sonuna yerleştir ve altın parçasıdır sadece daha büyük delik kadar yavaş yavaş daha küçük delikten tel çekin.
   5. 150 µL antikor karışımı yavaşça bırakın (örneğin anti EpCAM_FITC antikor 1:20 seyreltilmiş) içine belgili tanımlık uç. Kabarcık oluşumu riskini önlemek için functionalized bölümü tamamen daldı kadar tel hafifçe vur.
   6. Ucu delik kapatın. Laboratuvar film delik kaydırma yardımcı olabilir.
   7. Kuluçkaya dikey olarak O/N (~ 16 h) 4 ° C'de karanlıkta
4. Ayirt gün 2
   1. Tel 1 × PBS iki kez yıkama tarafından antikor kuluçka engelleyin.
   2. Onun tel-tıpa tel tekrar takın.
      Not: Mağaza 1 X PBS 4 ° c 5 ml şişe balık tahlil gerçekleştirilene kadar.
5. 3D DNA-balık gün 2
   Dikkat: Yüksek sıcaklık aletleri ve nemli odası özel dikkat ödenmelidir.
   1. Hibridizasyon fırın ve kuru ısı fırın ayarlayın (~ DNA-balık Protokolü başlamadan önce 3 h). Hibridizasyon fırın 75 ° C'de, Kuru sıcak fırın 37 ° C'de ayarlanmasý ve 0.4 × SSC çözüm serin (pH = 7.0 ± 0,1) ile 4 ° c
      Not: Balık arabellekleri pH durumu kritik, 7.0 ± 0,1 olmalıdır.
   2. Tel 3 kez 0.4 Buz gibi × SSC çözümde yıkayın.
      Not: tel fluorochrome photobleaching aşağıdaki işlemler sırasında önlemek için karanlıkta tut.
   3. Kuru duman dolap altında karanlıkta 10 dk için.
   4. Girdap ve spin sonda 5 s.
   5. 10 µL sonda theglass mikrotüpler bırakın. Laboratuvar film ile kapak.
   6. Mikrotüpler aşağıdaki gibi spin: microtube kuru bir emici, kağıt yerine 50 mL tüp içine sarın ve kısa bir süre spin.
   7. Dikkatle microtube içine kurutulmuş tel ve tel-tıpa yerleştirin. Kauçuk çimento ile kapatın.
      Uyarı: Yüksek sıcaklık sonraki iki adımı gerektirir.

Yukarıda açıklanan yordamı kullanarak CTCs (veya eşdeğer diğer hücreleri) functionalized telle zenginleştirilmiş bir IMMUNO-DNA balık tahlil gerçekleştirmek mümkündür. Bu iletişim kuralı ayarlamadan önce iki teknik uyumluluk kararlı (IMMUNO-floresan balık ile) standart 2D destekler olduğunu. EpCAM (EpCAM karşı antikor ile birleştiğinde tel uymaları gerekir) ifade iki farklı NSCLC hücre satır seçildi. Onlar farklı başlangıç koşullarda test etmek yararlı olan farklı bir ALK durumuna sahip. İlk, ncı-H1975, ikinci ncı-H3122, ALK translokasyonlar tarafından karakterize ederken vahşi türü (WT) ALK gen, si.

Balık tahlil için bir ALK gen sonu-apart tespit sistemi kullanıldı. Sistem iki problar, bir (turuncu) 2 p 23 ve bir (yeşil) ALK için distal hybridizing ALK içinde bölgeye proksimal hybridizing oluşur. 2D destekler üzerinde IMMUNO-DNA balık iyi tanımlanmış sinyaller antikor ve prob (Şekil 2) için sağlanan. Özellikle, her ikisi de iyi tanımlanmış EpCAM membran yerelleştirme gösterdi satırları hücre. Ayrıca, sonda sinyalleri parlak ve keskin ortaya çıktı: ncı-H1975 hücreleri gösterdi turuncu ve yeşil probları, ALK gen (şekil 2a, b) wildtype durumunu doğrulayan örtüşen. Bunun tersi olarak, üst üste gelen sinyalleri ve ALK gen (Şekil 2 c, d) silinmesiyle yansıtan tek yeşil noktalar ncı-H3122 hücreleri gösterdi. IMMUNO-DNA balık tahlil gerçekleştirildiğinde functionalized tel üzerinde 3D desteği, antikor ve sonda sinyalleri 2D destek genellikle daha az tanımlanmış daha vardı. EpCAM boyama görünür oldu. ALK sonda sinyalleri daha az tanımlanmış ancak hala beklenen ALK durumu (şekil 3) yansıyan vardı. Sonuçlar ayirt boyama DNA balık sinyalleri ile karışmaması gösterdi. Sondalar özellikle hedefleri ile melezleşmiştir. NCI-H3122 hücre kültürünü bir anormal ALK gen durumu (şekil 3b), bir vahşi türü ALK gen (şekil 3a) ncı-H1975 aksine gösterdi.

Resim 1 : Functionalized tel, ALK sonu-apart probları şematik düzenlenmesi, düzeni ALK düzenlenmesi ve özel tutucu beklenen kalıplarının. (bir) kırmızı kutuları vurgulamak üç ana bölümden Tel: functionalized ipucu, tel-tıpa ve un functionalized ipucu. Functionalized ipucu tel en hassas bir parçasıdır ve hücre dekolmanı veya hasarı önlemek üzere işleme sırasında dokundu olmamalıdır. (b) yeşil ve kırmızı probları sırasıyla serileri bağlamak akış yukarı ve aşağı loci ALK gen (solda). Sağ tarafta, ALK düzenlemelerin exemplificative desenleri gösterilir. Kırmızı ve yeşil co yerelleştirme sinyalleri normal hücreleri üzerinde; ayrılmış yeşil ve kırmızı sinyalleri bir ALK gen kromozom break (ALK gen translocation) ve bir yeşil-turuncu colocalization sinyal (anormal hücre-1) gösterir. Bir kırmızı sinyal ve iki yeşil sinyal düşündüren bir kromozom translocation ve silme (anormal hücre-2) bir kırmızı sinyal kaybı gösterir. (c) Tel tutucu; Kırmızı kutuları tel mikroskobu Çözümleme sırasında ele alırken bakım gerektiği yerde alanları vurgulamak. Tel rotator çevirerek bir 360 ° analizi uygulayabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : IMMUNO-DNA balık tahlil 2D destek (coverslip). (bir, b) NCI-H1975 EpCAM için zayıf pozitif hücreleri. EpCAM FITC sinyalleri kayda değer. Turuncu ve yeşil probları ALK break Apart, ALK gen NCIH1975 hücre doğrultusunda WT durumunu doğrulayan üst üste. İkiden fazla eşleştirilmiş sinyalleri görüntüleme hücreleri nedeniyle onların anöploidi mevcuttu. (c, d) Yüksek EpCAM ifade NCIH3122 hücre hattında ayirt sinyalleri parlak, hangi hücre-hücre kavşak içinde vurgulandı. Balık analizleri teyit silme işlemleri ALK gen, bu hücre satırı tipik. Kırmızı oklar, ALK gen silme yansıtan tek yeşil problar (olmadan karşılık gelen turuncu probları), gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: IMMUNO-DNA balık tahlil functionalized tel kullanarak 3D desteği. (bir) temsilcisi görüntüsünü ncı-H1975 hücreleri tel üzerinde. Tel hücrelerin 3D şekil yapmak her ne kadar tam olarak-odak fotoğraf elde etmek zor, EpCAM sinyal tüm hücrelerde de görülür. (b) temsilcisi görüntü ncı-H3122 hücre tel üzerinde. ALK probları gen silme (Kırmızı oklar), daha önce görmüş 2D destek gösterdi. Görünür arka plan sinyalleri polimer tabakanın varlığı nedeniyle büyük olasılıkla. Ancak, bu önemli ölçüde hücre kimliği veya floresan analiz etkilemedi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Çözümleri tarifleri.

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.