Yöntem makalesi

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

DOI:

10.3791/56936

⸱

21 Aralık 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Associazione Annastaccatolisa Onlus, 3Nuclear Medicine Unit, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör hücreleri ayırdetmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Biz DNA Floresan -in-situile ayirt kombine-functionalized tıbbi tel CTCs doğrudan hasta kandan zenginleştirici vivo içinde kabil tarafından yakalanan hücre değerlendirmek için hibridizasyon.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör hücreleri dolaşan (CTCs) metastatik Kanserinde zavallı hayatta kalma ile ilişkilidir. Kendi tanımlama, fenotipleme ve Genotipleme tümör heterojenite daha iyi bir anlayış neden olabilir ve böylece kişiselleştirilmiş tedavi için hasta seçimi kolaylaştırmak. Ancak, bu CTCs nadir nedeniyle engel oluyor. Biz hasta kan yüksek hacimli örnekleme ve CTCs varlığı, fenotip ve gen translocation hakkında bilgi edinme için yenilikçi bir yaklaşım sunuyoruz. Ayirt boyama ve DNA Floresan -in-situyöntem birleştirir-hibridizasyon (DNA Balık) ve functionalized bir tıbbi tel üzerinde temel alır. Bu tel CTCs vivo içinde yalıtım periferik kan büyük bir birimden izin veren yenilikçi bir cihazdır. Tel 30-dak yönetimi tarafından ekranlı kan hacmi yaklaşık 1.5-3 l. Bu yaklaşımın fizibilite göstermek için epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM) ifade ve ALK gen, kromozom translocation functionalized wire tarafından yakalanan sigara küçük hücreli akciğer kanseri (NSCLC) hücre hatlarında belirlenmiştir ve IMMUNO-DNA balık yaklaşımı ile lekeli. Tahlil bir 3D yapı functionalized tel üzerinde gerçekleştirmek için ve IMMUNO-fenotip belirlemek için bizim ana meydan oldu ve balık sinyalleri bu geleneksel floresan mikroskop kullanarak destekler. Elde edilen sonuçlar CTCs yakalamak ve onların fenotip ve kromozom yeniden analiz potansiyel yeni bir arkadaşı tanılama yaklaşım temsil ve yenilikçi bir sağlamak gerektiğini belirtmek strateji geliştirmek için kişiselleştirilmiş kanser tedavileri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTCs önemli bir adım kanser hücre yayma1temsil eder. Hastaların periferik kan onların huzurunda (metastatik) nüks hastalık ilerleme2,ve3ile ilişkilidir. CTC yalıtım ve kandan karakterizasyonu kanserli hastalarda non-invaziv sıvı biyopsi bir türüdür. Son yıllarda giderek belirgin ilerleme ve bu tür bir analiz kullanarak farklı tedaviler tümör yanıtı izleme önemli klinik bilgiler4,5sağlar haline gelmiştir. Sıvı biyopsi daha yararlı ne zaman cerrahi mümkün değildir ya da ne zaman birincil tümör doku mevcut değil Yani, Sigara biopsiable lezyonlar için. Bu nedenle, bu yaklaşım metastatik NSCLC, nerede CTCs varlığı bir negatif prognostik rol6için gösterildiği gibi belirli kanser ayarlarında umut verici. NSCLC hedefli tedavi yaklaşımları7,8,9 belirli molekülleri (moleküler hedef) büyüme, ilerleme, dahil olduğu bilinen herhangi bir işlem için tasarlanmış özellikle yararlanır bir tümör olduğunu ve hastalığın yayılmasını. Bu nedenle, belirli hedefleri algılama hastalık ilerlemesi sırasında gereklidir. CTC soruşturma algılamak ve birincil veya metastatik dokular için gerek kalmadan ilaç hedefleri izlemek için son derece ilginç bir tanı yaklaşımdır. Örneğin, ALK gen translokasyonlar NSCLC hücrelerdeki tespiti crizotinib, belirli hedefe yönelik tedavi10duyarlılık ile ilişkilidir. Ancak, şu anda, sadece ince iğne örnekleri veya küçük biyopsi ALK translokasyonlar tespiti yürütülür; Sonuç olarak, bir tümör doku ALK analizi mümkün değildir. CTCs bir potansiyel tümör doku tabanlı araştırmalar alternatiftir ve son derece gelecek vaat eden bir arkadaşı tanı yaklaşımı temsil eder.

Potansiyel önemine rağmen CTCs hala çoğunlukla nedeniyle onların nadir (1-10 periferik kan11hücre/mL) araştırma arasında büyük tartışma konusu vardır. Geçerli sıvı biyopsi yöntemleri kan (Yani, 1-30 mL)12,13, sınırlı bir miktarda kullanmak ama bu suboptimal hassasiyeti CTCs. dolayısıyla algılanması için bir durum oluşturur, araştırma bulmak için garanti yaklaşımlar ve periferik kan daha büyük bir hacim sıvı biyopsi CTC hedefli gerçekleştirmek için aygıtları geliştirme.

Başka bir aygıtı, functionalized tıbbi tel (bakınız Tablo malzemeler), kan örnekleme sınırlamalarının üstesinden gelir ve CTCs daha temsili bir analizini elde etmek için geliştirilmiştir. Bu functionalized tel CTCs doğrudan kanser hastaları1kan yakalar CE onaylı tıbbi cihaz var. Altın 0.2 µm kalınlığında tabaka ile kaplı bir 2 cm uzun functionalized ucu ile bir 16 cm uzunluğunda paslanmaz çelik tel (Şekil 1a) oluşmaktadır. Katmanın sırayla kovalent EpCAM, biri en yaygın ifade antijenleri CTCs14yüzeyi karşı antikorlar ile birleştiğinde bir 1-5 µm kalınlığında polycarboxylate hidrojel tabaka ile kaplıdır. Tel functionalized ucu hastanın kol bir damar içine tanıtıldı ve pozisyon için en az 30 dk içinde kalır. Bu yaklaşım doğrudan periferik kan ve ekrana yaklaşık 1,5-3,0 L kan (yaklaşık 300-fold daha fazla alternatif yaklaşımlar için kullanılan birim)1. CTCs içinde vivo izolasyonu sağlar

Pantel ve ark. CTCs doğrudan akciğer kanseri hastaları15kol damarlar izole bu yaklaşım etkinliğini göstermiştir. Onlar tel ayirt CTCs EpCAM ve pan-cytokeratin ve CD45 karşı leucocyte algılama için yönettiği Geleneksel antikorlar kullanarak tanımlamak için boyama yapılır. Tel altında bir optik floresan mikroskop15incelenmiştir. Yazarlar cihazın CTCs izole etmeyi başardı, ama onlar herhangi bir terapi ile ilgili hedefleri, ALK translokasyonlar gibi araştırmak değil gösterdi.

NSCLC hücre hatlarında phenotypical parametreleri, örneğin, EpCAM pozitifliği ve moleküler biyolojik, örneğin ALK durumu (Şekil 1b) varlığı temelinde sözde CTCs tanımlamak için sunulan yöntem amaçlamaktadır. Bu 3 gün boyu yordamı functionalized tel ve DNA Floresan -in-situile boyama ayirt birleştirir-hibridizasyon (DNA balık), adlı IMMUNO-DNA-balık. CTCs nadir varlıklar olduğunu göz önüne alındığında, bu protokol CTCs immunophenotypic özellikleri ve DNA düzenlemeler açısından aynı tel üzerinde karakterize edilebilir bir avantajdır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. IMMUNO-DNA balık 2D Coverslip üzerinde

  1. Coverslip hazırlık ve yapışık hücre tohumlama
    Not: steril koşullarda Laminer akış başlık altında tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Coverslip onları dezenfekte için % 100 etanol bırakın.
      Not: Biz (tüm reaktifler Malzemeler tablolistelenir) 12 mm x 12 mm silikon destekli kare coverslips kullanın.
    2. Coverslips bir petri (100 mm çap) yerleştirin. Kuru kullanarak hava akımı 5 min için zorladı.
    3. Yıkama 15 mL steril 1 × Dulbecco'nın fosfat ile Petri kabına arabelleğe alınmış serum (PBS).
    4. Petri kabına 10 mL tam orta ile yıkayın (bkz. Tablo 1).
    5. Tohum yapışık hücreleri (orta, 10 mL yaklaşık 1,650,000 hücrelerde sayılan göre FACS analiz) hücre süspansiyon üzerine tek tip hücre kaplama (yaklaşık 30.000 hücre/cm2) elde etmek için Petri kabına yavaşça bırakarak.
      : Adres defteri ~ % 70 izdiham, yapışık hücreleri üzerinde en az 48 saat için coverslips kültürlü.
  2. Fiksasyon ve permeabilization
    Dikkat: Aseton bir yanıcı ve Uçucu madde rahatsız edici olduğunu. Sadece aseton dayanıklı plastik ya da cam kaplar (PVC veya PVDF) kullanın.
    Not: bir kimyasal duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Kültür orta bir tek kullanımlık alıyorum damlalıklı kullanarak kaldırın.
    2. Petri kabına 1 × PBS ile yıkayın.
    3. Cımbız kullanarak, coverslips 5 mL 1 × PBS de içeren bir cam kabı daldırma tarafından yıkayın.
    4. Bloting kağıt üzerinde coverslips kuru.
    5. Hücreleri üzerinde coverslip (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için bir %100 aseton çözüm içine çeker tarafından tamir.
    6. Coverslip tarafından cımbız kaldırmak. Cebri hava akışı için 5 dk kullanarak coverslip kuru.
      Not: Protokol bu noktada duraklatılmış. Coverslip-20 ° C'de muhafaza edilmelidir
  3. Ayirt gün 1
    Not: Bu aşamada bir gecelik (O/N) kuluçka içerir (~ 16 h).
    1. Coverslips iki kez 1 × PBS yıkayın.
    2. 100 µL antikor seyreltme arabelleğinin damla (ayrıntılı bilgi için bkz: Tablo 1 ) üzerine coverslip ve RT, 30 dk için kuluçkaya
      Not: Tüm coverslip kapak ve taşması riskini önlemek amacıyla coverslip yüzey temelinde çözüm cilt ayarlanmalıdır.
    3. 1:20 antikor karışımının (Tablo 1) hazırlamak birincil Monoklonal antikor seyreltme Birleşik üreticisi tarafından sağlanan veri sayfasında belirtildiği gibi fluorochrome ve antikor seyreltme arabelleği ile.
      Not: Bu güçlü monoklonal antikorlar ile transfer fluorochrome Birleşik kullanmak için tavsiye edilir. Transfer fluorochrome kullandıysanız, protokol DNA-balık adımları sırasında kullanılan sıcaklık fluorochrome zarar ve floresan emisyon söndürmek. Bu protokol için biz bir EpCAM-FITC antikor için seçti (1:20 seyreltme), hangi değil çok kullanılan sıcaklık ile herhangi bir önemli sorun göstermek did.
    4. Coverslips iki kez 1 × PBS durulayın.
    5. Coverslips hücre tarafı yukarı coverslip üzerinde antikor karışımı nemli bir odası ve bırak 100 µL yerleştirin.
      Not: Tüm coverslip kapak ve taşma riski azaltmak için coverslip yüzeyi temelinde çözüm cilt ayarlanmalıdır.
    6. O/N kuluçkaya (~ 16 h) 4 ° C'de karanlıkta
  4. Ayirt gün 2
    1. Antikor kuluçka coverslips 1 × PBS iki kez yıkayarak engelleyin.
      Not: balık tahlil gerçekleştirilene kadar mağaza coverslips 1 × PBS 4 ° C'de bir odasında karanlıkta sürekli nemli ortamı ile 100 µL dalmış.
  5. 2D DNA-balık gün 2
    Dikkat: Özel ilgi aletleri ve nemli odası yüksek sıcaklığı ödenmesi gerekmektedir.
    1. Hibridizasyon fırın ve kuru ısı fırın ayarlayın (~ DNA-balık Protokolü başlamadan önce 3 h). Hibridizasyon fırın 75 ° C'de ayarla, Kuru sıcak fırın 37 ° C'de ayarla ve 0.4 × SSC çözüm serin (pH = 7.0 ± 0,1) (SSC tarifi için bkz: Tablo 1) ile 4 ° c
      Not: balık arabellekleri durumunu pH önemlidir: pH = 7.0 ± 0,1.
    2. Coverslip üç kez 0.4 Buz gibi × SSC çözümde yıkayın.
    3. Coverslip karanlıkta 10 min için bir kimyasal duman başlık altında kuru.
    4. 10 için girdap s ve sonda-tüp duvardan aşağı inceleyebilirsek hızlı bir tur (maksimum hızda) gerçekleştirin.
    5. Coverslip hücre tarafı 5 µL balık sondanın bir slayt ve mühür tüm kenarları kauçuk çimento ile coverslip bir damla üzerine yerleştirin.
      Uyarı: Yüksek sıcaklık sonraki iki adımı gerektirir. Koruyucu eldiven giymek.
    6. Slayt 8 dk. 75 ° c tam DNA denatürasyon için hibridizasyon fırında bir karanlık nemli odasına koy.
    7. Nemli odası 37 kuru sıcak fırına taşımak ° C O/n
  6. 2D DNA-balık gün 3
    1. Su banyosu 72 ° C'de ayarla ve (Tablo 1) 0.4 × SSC arabelleği ile bir slayt boyama kavanoz yerleştirin. 30 dakika sonra olmalıdır 72 ± 0.4 × SSC arabellek sıcaklığı kontrol 1 ° C.
    2. İki cam şişeler hazırlamak: bir 2 × SSC + % 0.05 arası arabellek ile (pH = 7.0 ± 0,1) (Tablo 1) ve ikinci bir distile su ile.
    3. Nemli odası Kaldır fırın, dikkatle kauçuk çimento slaytından kaldırmak ve coverslip cımbız ile bağlantısını kesin.
    4. Daldırma 0.4 × SSC 72 ° C'de 2 min için tarafından coverslip yıkama
    5. 2 × SSC + % 0.05 arası arabellek için 30 daldırma tarafından coverslip yıkama s.
    6. Coverslip distile suda yıkayın.
    7. Coverslips karanlıkta 10 min için bir kimyasal duman başlık altında kuru.
    8. Coverslip sıvı montaj orta 1,5 µg/mL 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI toplam DNA counterstain) ile bağlayın. Coverslip hücre tarafı 5 µL montaj orta bir slayttaki bir damla üzerine yerleştirin, cımbız hava dışarı almak ve oje ile mühür için coverslip basın.
      Not: Orta birim takma coverslip yüzeyi boyutu temelinde ayarlanmalıdır.
  7. 2D mikroskop gözlem ve analiz
    Not: Resimler farklı mikroskop sistemleri ile elde edilebilir.
Resim alma (Tablo reçetesi) için standart bir ticari yazılım ile donatılmış geleneksel floresan mikroskop kullandık.
  1. 12-bit dijital fotoğraf makinesi ve 20 × / 0,50 NA ve 40 × / 0,65 NA amaç bulunan kırmızı için uygun filtreler kullanılarak görüntüleri (uyarma: 599 nm, emisyon: 588 nm), yeşil (uyarma: 509, emisyon: 524) ve mavi (uyarma: 367 nm, emisyon: 452 nm) probları.
  2. Yazılım aracı olarak kullanarak görüntüleri analiz.
    Not: ayirt boyama ve ALK-sonda yerelleştirme değerlendirmek için biz ImageJ kullanılır. Slaytlar-20 ° c en fazla 2 hafta karanlıkta saklanır. Uzun süreli depolama için özel montaj orta uzun süreli depolama için kullanarak öneririz.

2. IMMUNO-DNA balık tel üzerinde

  1. Hücre spike giriş tel (3D desteği)
    Not: Ön kurulum doğru içerir yapışık yelpazesi hücre satırlarını EpCAM-pozitif göre. Böylece yalnızca EpCAM pozitif hücreleri lekeli tel anti-EpCAM antikorlar ile functionalized.
    Not: herhangi bir zarar görmemesi için tel functionalized parçası dokunmayın.
    Not: Tüm adımları steril koşullarda laminar akış başlık altında yapılmalıdır.
    1. Bir T75 şişesi (% 80 izdiham) tüm içeriğini kullanarak tam orta 4 mL 5 mL şişede resuspend; bir tek spike bileşeni için yaklaşık 2.000.000 hücreleri hücre adezyon tel en üst düzeye çıkarmak için tavsiye edilir.
    2. Tel, cam paketinden çıkarın.
    3. Tel tel-tıpa şişe için su geçirmez bir uyum sağlanması şişe içine functionalized altın parçası daldırma. Tutkal ile laboratuvar film.
      Not: Tel-tıpa ve şişe arasında doğru bir maç için izin vermek için 5 mL tüp kullanılması önerilir.
    4. RT, 30 dk içinde bir tüp rotator için kuluçkaya (0-120 açı).
    5. Tel 3 farklı temiz şişeleri kullanarak 1 × PBS solüsyonu içinde üç kez yıkayın.
  2. Fiksasyon ve permeabilization
    Dikkat: Aseton solunum yolu rahatsız edebilir yanıcı bir maddedir. Sadece aseton dayanıklı plastik ya da cam kaplar (PVC veya PVDF) kullanın.
    Not: bir kimyasal duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Tel kuruması.
    2. Hücreleri aseton % 100 çözüm RT. kullanımı, 10 min için tel daldırma tarafından 5 mL tüp düzeltmek.
      Not: Tel-tıpa ile temas sabitleştirici gelmek gerekir.
    3. RT, 5 min için tel kuruması
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Tel-20 ° C'de muhafaza edilmelidir Zaman uzun süreli depolama için tel ambalaj, tel-tıpa functionalized ucunu yanındaki ve dikkatle tel functionalized ucunu zarar vermemeye dikkat çekici depolama cam tüp yerleştirin. Depolama cam kapatın ve (dikey veya yatay olarak)-20 ° C'de depolayın
  3. Ayirt gün 1
    Not: Bu aşamada bir O/N kuluçka içerir (~ 16 h).
    1. 5 mL tüp kullanarak iki kez 1 × PBS çözümde yıkayın.
    2. RT 5 mL tüp kullanarak, 30 dk için antikor seyreltme arabellek tel kuluçkaya.
    3. Antikor karışımı 150 µL birincil Monoklonal antikor antikor seyreltme arabellek, veri sayfasında belirtildiği gibi fluorochrome ile Birleşik bir seyreltme ile hazırlayın. Örneğin, bir 1:20 EpCAM-FITC antikor kullanılan seyreltme.
    4. P200 ipucu kuluçka, aşağıdaki gibi gerçekleştirmek için kullanın: tel tel-tıpa ayıklamak ve yavaşça uç daha büyük delik tellerden eklemek. Unfunctionalized sonuna yerleştir ve altın parçasıdır sadece daha büyük delik kadar yavaş yavaş daha küçük delikten tel çekin.
    5. 150 µL antikor karışımı yavaşça bırakın (örneğin anti EpCAM_FITC antikor 1:20 seyreltilmiş) içine belgili tanımlık uç. Kabarcık oluşumu riskini önlemek için functionalized bölümü tamamen daldı kadar tel hafifçe vur.
    6. Ucu delik kapatın. Laboratuvar film delik kaydırma yardımcı olabilir.
    7. Kuluçkaya dikey olarak O/N (~ 16 h) 4 ° C'de karanlıkta
  4. Ayirt gün 2
    1. Tel 1 × PBS iki kez yıkama tarafından antikor kuluçka engelleyin.
    2. Onun tel-tıpa tel tekrar takın.
      Not: Mağaza 1 X PBS 4 ° c 5 ml şişe balık tahlil gerçekleştirilene kadar.
  5. 3D DNA-balık gün 2
    Dikkat: Yüksek sıcaklık aletleri ve nemli odası özel dikkat ödenmelidir.
    1. Hibridizasyon fırın ve kuru ısı fırın ayarlayın (~ DNA-balık Protokolü başlamadan önce 3 h). Hibridizasyon fırın 75 ° C'de, Kuru sıcak fırın 37 ° C'de ayarlanmasý ve 0.4 × SSC çözüm serin (pH = 7.0 ± 0,1) ile 4 ° c
      Not: Balık arabellekleri pH durumu kritik, 7.0 ± 0,1 olmalıdır.
    2. Tel 3 kez 0.4 Buz gibi × SSC çözümde yıkayın.
      Not: tel fluorochrome photobleaching aşağıdaki işlemler sırasında önlemek için karanlıkta tut.
    3. Kuru duman dolap altında karanlıkta 10 dk için.
    4. Girdap ve spin sonda 5 s.
    5. 10 µL sonda theglass mikrotüpler bırakın. Laboratuvar film ile kapak.
    6. Mikrotüpler aşağıdaki gibi spin: microtube kuru bir emici, kağıt yerine 50 mL tüp içine sarın ve kısa bir süre spin.
    7. Dikkatle microtube içine kurutulmuş tel ve tel-tıpa yerleştirin. Kauçuk çimento ile kapatın.
      Uyarı: Yüksek sıcaklık sonraki iki adımı gerektirir.
Koruyucu eldiven giymek.
  • Tel 8 dk. 75 ° C'de tam DNA denatürasyon elde etmek için hibridizasyon fırında bir karanlık nemli odasına koy.
  • Nemli odası 37 kuru sıcak fırına taşımak ° C O/n
  • 3D DNA-balık gün 3
    1. Bir su banyosu 0.4 × SSC çözüm ile kavanoz boyama bir slayt koymak ve 72 ° C'de
    2. Bu ulaşıncaya kadar 72 ± 0.4 × SSC çözüm sıcaklığını kontrol edin 1 ° C.
    3. İki cam şişeler, bir 2 × SSC + % 0.05 ile hazırlamak ara (pH = 7.0 ± 0,1) çözüm ve ikincisi ile distile su.
    4. Nemli odası kuru sıcak fırından çıkarın, kauçuk çimento tel-tıpa dikkatli bir şekilde çıkarın cımbız kullanarak ve almak.
      Not: İnç tıpa functionalized ucunu zarar vermemesi için dikkatli olmak, tellerden kaplamasız sonuna dikkatlice çekin.
    5. Tel 72 ° C'de 2 min için 0.4 × SSC çözüm içine daldırma
    6. 2 × SSC + % 0.05 ara çözüm için 30 tel yıkama RT. s
    7. RT tel distile suda yıkayın
    8. 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık duman başlık altında tel kuru.
    9. 2 ml 1 × PBS 1,43 µM DAPI stok çözeltisi hazırlamak.
    10. 2 mL flakon RT., karanlıkta 1 h için çözümde DAPI kabloyla functionalized ucu kuluçkaya
    11. Tel durulama iki kez 1 × PBS ve kuruması.
  • 3D mikroskop gözlem ve analiz
    1. Tel tel tutucu içinde konumlandırın. Bağlantı noktası ucu eşleşen kadar dikkatle özel sahibinin girdi noktası aracılığıyla functionalized ipucu ekleyin. Functionalized ucu (Şekil 1a) zarar vermemeye dikkat et.
    2. Mikroskop sahnede yer özel tutucu. 20 × lens ile mikroskop odak noktası ayarlayın. İlk kaba odak özel destek ve ince DAPI kanalda parlak görünür hücreleri üzerinde ayarlayın.
    3. Sadece hücreleri lens Merkezi odaklanacak.
      Not: Resimler farklı mikroskop sistemleri ile elde edilebilir. Bu ayar, resim alma için standart bir ticari yazılım ile donatılmış geleneksel floresan mikroskop kullanın.
    4. 12-bit dijital fotoğraf makinesi ve 20 × / 0,50 NA ve 40 × / 0,65 NA amaç bulunan kırmızı için uygun filtreler kullanılarak görüntüleri (uyarma: 599 nm, emisyon: 588 nm), yeşil (uyarma: 509, emisyon: 524) ve mavi (uyarma: 367 nm, emisyon: 452 nm) probları.
      Not: Resimler farklı araçları ve yazılım kullanarak görüntülenmeyecektir. ImageJ ayirt boyama ve ALK-sonda yerelleştirme değerlendirmek için kullanın.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Tel-20 ° C'de muhafaza edilmelidir Zaman uzun süreli depolama için tel ambalaj, tel-tıpa functionalized ucunu yanındaki ve dikkatle tel functionalized ucunu zarar vermemeye dikkat çekici depolama cam tüp yerleştirin. Depolama cam kapatın ve (dikey veya yatay olarak)-20 ° C'de depolayın

    • Sonuçlar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yukarıda açıklanan yordamı kullanarak CTCs (veya eşdeğer diğer hücreleri) functionalized telle zenginleştirilmiş bir IMMUNO-DNA balık tahlil gerçekleştirmek mümkündür. Bu iletişim kuralı ayarlamadan önce iki teknik uyumluluk kararlı (IMMUNO-floresan balık ile) standart 2D destekler olduğunu. EpCAM (EpCAM karşı antikor ile birleştiğinde tel uymaları gerekir) ifade iki farklı NSCLC hücre satır seçildi. Onlar farklı başlangıç koşullarda test etmek yararlı olan farklı bir ALK durumuna sahip. İlk, ncı-H1975, ikinci ncı-H3122, ALK translokasyonlar tarafından karakterize ederken vahşi türü (WT) ALK gen, si.

    Balık tahlil için bir ALK gen sonu-apart tespit sistemi kullanıldı. Sistem iki problar, bir (turuncu) 2 p 23 ve bir (yeşil) ALK için distal hybridizing ALK içinde bölgeye proksimal hybridizing oluşur. 2D destekler üzerinde IMMUNO-DNA balık iyi tanımlanmış sinyaller antikor ve prob (Şekil 2) için sağlanan. Özellikle, her ikisi de iyi tanımlanmış EpCAM membran yerelleştirme gösterdi satırları hücre. Ayrıca, sonda sinyalleri parlak ve keskin ortaya çıktı: ncı-H1975 hücreleri gösterdi turuncu ve yeşil probları, ALK gen (şekil 2a, b) wildtype durumunu doğrulayan örtüşen. Bunun tersi olarak, üst üste gelen sinyalleri ve ALK gen (Şekil 2 c, d) silinmesiyle yansıtan tek yeşil noktalar ncı-H3122 hücreleri gösterdi. IMMUNO-DNA balık tahlil gerçekleştirildiğinde functionalized tel üzerinde 3D desteği, antikor ve sonda sinyalleri 2D destek genellikle daha az tanımlanmış daha vardı. EpCAM boyama görünür oldu. ALK sonda sinyalleri daha az tanımlanmış ancak hala beklenen ALK durumu (şekil 3) yansıyan vardı. Sonuçlar ayirt boyama DNA balık sinyalleri ile karışmaması gösterdi. Sondalar özellikle hedefleri ile melezleşmiştir. NCI-H3122 hücre kültürünü bir anormal ALK gen durumu (şekil 3b), bir vahşi türü ALK gen (şekil 3a) ncı-H1975 aksine gösterdi.

    figure-results-1
    Resim 1 : Functionalized tel, ALK sonu-apart probları şematik düzenlenmesi, düzeni ALK düzenlenmesi ve özel tutucu beklenen kalıplarının. (bir) kırmızı kutuları vurgulamak üç ana bölümden Tel: functionalized ipucu, tel-tıpa ve un functionalized ipucu. Functionalized ipucu tel en hassas bir parçasıdır ve hücre dekolmanı veya hasarı önlemek üzere işleme sırasında dokundu olmamalıdır. (b) yeşil ve kırmızı probları sırasıyla serileri bağlamak akış yukarı ve aşağı loci ALK gen (solda). Sağ tarafta, ALK düzenlemelerin exemplificative desenleri gösterilir. Kırmızı ve yeşil co yerelleştirme sinyalleri normal hücreleri üzerinde; ayrılmış yeşil ve kırmızı sinyalleri bir ALK gen kromozom break (ALK gen translocation) ve bir yeşil-turuncu colocalization sinyal (anormal hücre-1) gösterir. Bir kırmızı sinyal ve iki yeşil sinyal düşündüren bir kromozom translocation ve silme (anormal hücre-2) bir kırmızı sinyal kaybı gösterir. (c) Tel tutucu; Kırmızı kutuları tel mikroskobu Çözümleme sırasında ele alırken bakım gerektiği yerde alanları vurgulamak. Tel rotator çevirerek bir 360 ° analizi uygulayabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    figure-results-2
    Resim 2 : IMMUNO-DNA balık tahlil 2D destek (coverslip). (bir, b) NCI-H1975 EpCAM için zayıf pozitif hücreleri. EpCAM FITC sinyalleri kayda değer. Turuncu ve yeşil probları ALK break Apart, ALK gen NCIH1975 hücre doğrultusunda WT durumunu doğrulayan üst üste. İkiden fazla eşleştirilmiş sinyalleri görüntüleme hücreleri nedeniyle onların anöploidi mevcuttu. (c, d) Yüksek EpCAM ifade NCIH3122 hücre hattında ayirt sinyalleri parlak, hangi hücre-hücre kavşak içinde vurgulandı. Balık analizleri teyit silme işlemleri ALK gen, bu hücre satırı tipik. Kırmızı oklar, ALK gen silme yansıtan tek yeşil problar (olmadan karşılık gelen turuncu probları), gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    figure-results-3
    Şekil 3: IMMUNO-DNA balık tahlil functionalized tel kullanarak 3D desteği. (bir) temsilcisi görüntüsünü ncı-H1975 hücreleri tel üzerinde. Tel hücrelerin 3D şekil yapmak her ne kadar tam olarak-odak fotoğraf elde etmek zor, EpCAM sinyal tüm hücrelerde de görülür. (b) temsilcisi görüntü ncı-H3122 hücre tel üzerinde. ALK probları gen silme (Kırmızı oklar), daha önce görmüş 2D destek gösterdi. Görünür arka plan sinyalleri polimer tabakanın varlığı nedeniyle büyük olasılıkla. Ancak, bu önemli ölçüde hücre kimliği veya floresan analiz etkilemedi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    ArabellekKompozisyonNotHisse senetleri
    Hücre tam kültür ortaRPMI 1640 + 2 mM glutamin + % 5-10 fetal sığır Serum (FBS).RPMI: 4 ° C; Glutamin, FBS:-20 ° C
    Antikor Diluition arabellek% 1 BSA, 1 x PBS içinde % 0,3 Triton X-100RT mühür ile laboratuvar film.
    20 x SSC çözüm3 M Sodyum Klorür, 300 mM TRISODYUM sitrat GKD2' 0 çözünmüşFiltre çözümü ve pH 7,0 0,1 HCl ile +/-=RT mühür ile laboratuvar film.
    SSC çözüm x 0,4Hisse senedi 20 seyreltik x SSC içinde distile H2OFiltre çözümü ve pH 7,0 0,1 HCl ile +/-=RT.
    Tutkal ile laboratuvar film. 2 x SSC + % 0.05 arası 20 çözüm Hisse senedi 20 x SSC distile H2O + % 0.05 seyreltik ara 20 Filtre çözümü ve pH 7,0 0,1 HCl ile +/-= RT mühür ile laboratuvar film. DAPI çözüm 30 nM 1 x PBS hisse senedi 1.43 µM sulandırmak -20 ° C karanlık durumda aliquote kullanıma hazır

    Tablo 1: Çözümleri tarifleri.

    Tartışma

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu yazıda, ilk kez, ayirt boyama ve DNA balık, birleştiren bir yöntem functionalized tel ile kullanmak için önerilmiş. IMMUNO-DNA balık yöntem çağrıldı. Bu teknik için EpCAM (olay 1), pozitifliği gibi phenotypical parametreleri temel alınarak 3D bir tel üzerinde sözde CTCs eşzamanlı tanımlanmasına izin için ve ALK gen durumu () gibi moleküler değişiklikler algılama kolaylaştırmak için geliştirilmiştir Olay 2). İki etkinlik eşzamanlı kimlik onların ortak yerelleştirme algılanmasını sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşım belirlemek ve kanserli hastalarda kan alındı CTCs karakterize için uygun olabilir. Haemo-bileşenleri ve lökosit potansiyel etkileri boyama yordam genellikle yordamı ile müdahale değil. Özellikle, literatürde bildirilen veri haemo-bileşenleri ve lökosit ayirt tel, gerçek CTCs1,15tanımlamak için kritik adım bağlı hücre boyama etkilemez olduğunu belirtti.

    IMMUNO-DNA balık Floresans parlaklığını daha geleneksel bir immunophototyping tahlil ve balık tayini için gerekli yüksek sıcaklık sonucu biraz daha az belirgin. Ancak, ayirt boyama hala kayda değer. Örneğin, zayıf bir sinyal hala düşük EpCAM ifade hücre hattında, NCIH1975 algılanabilir. Balık tayini için gerekli yüksek sıcaklık için antikor bağlı doğru fluorochrome seçiminde ana sınırlayıcı faktördür. Bu protokol için antikorlar, DNA denatürasyon sıcaklığı tahammül için bir transfer fluorochrome bağlanmalıdır. Örneğin, phycoerythrin, thermosensitive fluorochrome tarafından yüksek sıcaklık nedeniyle fluorochrome bozulması nedeniyle bu ayar önerilmez. Floresein isothiocyanate bir iyi bir seçim ve sık sık sık fluorochrome balık probları üzerinde istihdam olduğunu. IMMUNO-DNA balık autofluorescence sinyal üzerinde standart 2D destekler çok kötüdür. Tel desteğinde polimer tabaka bir hafif autofluorescence sinyal, özellikle kırmızı kanalı neden olabilir. 2D arka plan, aksine bir NativeError arka plan sinyal tel üzerinde fark edilebilir ancak önemli ölçüde çekirdek kimlik veya hücre karakterizasyonu etkilemez.

    Tel değerlendirilmesi mikroskop yüzey silindirik şekilli 3D yapısının okuma bir optik mikroskobu sınırları nedeniyle bir 2D destek çok daha fatiguing. Ancak, bu zorluk tel tutucu döndürme ve tel orta çizgi ağırlıklı olarak lokalize görüntüleri alma tarafından üstesinden gelebilir. 360 ° dönme tel tel tutucu izin verir. Çekirdeği üzerinde duruldu sonra Floresans kanal değiştirme mutlaka hedef alan odaklanmak tutmaz. Bu nedenle, iç-hücre hedef alan odaklanmak korumak için önemlidir.

    Bu teknik algılamak ve 3D destekler farklı hücrelerdeyse karakterize için uygun olabilir. Ayrıca farklı antikorlar kullanmak mümkün olabilir ve balık sondalar. Farklı antikorlar kullanmak seçerken, fluorochrome thermostability ve hücre zarının üzerinde hedef antijen ifade düzeyini dikkat edilmesi gereken önemli faktör vardır. İçi cytoplasmatic antijenleri aynı zamanda Boyanabilen. Farklı balık kullanarak probları denatürasyon yordam ve hücreler için Balık hazırlamak için veri sayfası özellikleri buna göre tahlil kontrol etmek önemlidir.

    Açıklamalar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    EtanolCarlo Erba# 414605
    Tween 20BIO RAD# 1706531
    PBS (Fosfat Tamponlu Salin) Medicago# 09-9400-100
    AsetonSigma Aldrich# 534064-500ML
    BSASigma Aldrich# A7906
    Triton X-100 DeterjanBIO RAD# 1610407
    RUBBERCEMENTRoyal Talens# 95306500
    Vysis 20X SSC (66g)Abbott Molecular Inc. # 30-804850tozu, önerildiği gibi damıtılmış H2O'da yeniden süspanse edilecek
    RPMI 1640Gibco# 31870-025
    FBS (Fetal Sığır Serumu)Gibco# 10270-098
    L-Glutamin (200mM)Gibco# 25030-024
    Penisilin-StreptomisinGibco# 15140-122
    H20MilliPore
    XT ALK BAMetaSystems Probları# D-6001-100-OG
    DAPI, FluoroPure sınıfıInvitrogen# D21490
    Life Technologiesile SlowFade Elmas Antifade Mountant# S36973
    EpCAM-FITC (klon: HEA-125)Mitenyi# 130-080-301
    Mikro tüpler M-Tube18Gilupi Nanomedizin
    Detektor CANCER01 EpCAMGilupi NanomedizinFonksiyonel tel
    STAR FROST Mikroskop SlaytlarıKnittel GL & Auml; SERVS1117# 076FKB
    SecureSlip Silikon Destekli Kapak CamıGRACE BIO-LABS#104112
    ZEISS Floresan Mikroskop Aksioskopu ZEISS
    Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit yazılımNikonBR 4.11.00
    Nikon DS-QiMc 12 bit dijital fotoğraf makinesiNikonDS-QiMc
    DAPI

    Kaynaklar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
    2. Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
    3. Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424(2017).
    4. Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
    5. Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108(2014).
    6. Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070(2013).
    7. Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
    8. Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
    9. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
    10. Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
    11. Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
    12. Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
    13. Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
    14. Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
    15. Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Circulating Tumor CellsImmunofluorescence StainingDNA FISHFunctionalized WireEpCAM ExpressionALK Gene TranslocationNon Small Cell Lung CancerWidefield Fluorescence Microscopy3D Support AnalysisCytogenetic Alterations

    İlgili makaleler