Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

10.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

21 Mart 2018

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

Bu makalede

Özet

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Özet

Yönetim ve belirli moleküler hedefli uyuşturucu tedavisi kanser hastaları için önce kanser mutational durumunu belirlemek için önemlidir. Klinik ortamda parafin gömülü (FFPE) doku formalin sabit genetik test etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, FFPE DNA genellikle zarar görmüş ve formalin ile fiksasyon işlemi sırasında parçalanmış. Bu nedenle, FFPE DNA bazen düşük kalite ve DNA miktarı nedeniyle genetik test için yeterli değildir. Burada mikroskop altında gözlenen dokunmatik Künye Sitoloji (TIC) genomik DNA kanser hücrelerinden elde etmek için bir yöntem mevcut. Hücre morfolojisi ve kanser hücre sayıları TIC numuneler kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, genomik DNA ekstraksiyon TIC örneklerinden iki gün içinde tamamlanabilir. Toplam miktar ve kalite TIC bu yöntemi kullanarak elde edilen DNA FFPE DNA daha yüksek. Araştırmacılar yüksek kaliteli DNA (örneğin, sonraki nesil sıralama analizi, dijital PCR ve nicel gerçek zamanlı PCR) genetik test için elde etmek için ve sonuçları raporlama için dönüş süresini kısaltmak için bu hızlı ve basit bir yöntem sağlar.

Giriş

Yeni nesil sıralama teknolojisi araştırmacılar genetik varyasyonları, Mendel hastalığı, kalıtsal yatkınlık ve kanser 1,2,3 genom bilgileri analiz önemli gelişmeler sağlamıştır . Kanser genom Atlas (TCGA) ve uluslararası kanser genom Konsorsiyumu (ICGC) genetik değişiklikler çeşitli yaygın kanserlerin4tanımlaması yakalamışlardır. Temel kanser sürücü genler yüzlerce başarıyla tespit edilmiştir ve bu moleküllerin bazıları ilaç geliştirme1,5,6için hedef alınmaktadır.

Klinik ortamda FFPE numuneler Patolojik tanı ve moleküler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için test için yaygın olarak kullanılır. Ancak, formalin ile fiksasyon sürecinde DNA-protein veya DNA-DNA cross-linking oluşur ve DNA fragmantasyonu indüklenen. Böylece, FFPE DNA örnekleri her zaman düşük kalite ve miktar DNA7,8,9nedeniyle genetik analiz için uygun değildir. Ayrıca, o FFPE numuneler hazırlamak için birkaç gün sürer ve teknik beceri doğru bölümleri hazırlamak gereklidir. Bu nedenle, bu yüksek kaliteli bozulmamış DNA elde etmek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirmek için arzu edilir.

Sitoloji Patolojik tanı için alternatif bir yöntemdir. Daha basit, daha az pahalı ve daha hızlı yaklaşım FFPE hazırlık10ile karşılaştırıldığında saytolojik örnek hazırlıktır. TIC tekniği sentinel lenf düğümleri ve meme kanserli hastalarda bir yıl11,12için intraoperatif hızlı tanı için marjinal dokulardan yapıldı. Ancak, yüksek kaliteli genomik DNA-ebilmek var olmak hulâsa TIC örnekler incelenmiştir ve sonraki genetik analiz için kullanılan birkaç raporları vardır. Saytolojik örnekler yaygın özelikle (Pap) veya Giemsa boyama ile lekeli ve biz daha önce miktarı ve kalitesi TIC örnekler (özellikle Giemsa lekeli örnekleri) çıkarılan DNA'ın FFPE elde edilen örnekler daha üstün olduğunu bildirdi doku13. PAP boyama ile karşılaştırıldığında, Giemsa boyama boyama daha az prosedürleri gerektiren bir avantaja sahiptir. Sonra örnekleri sabit ve lekeli, Pap boyama, onlar orta (örneğin, Malinol) tümör hücreleri, normal hücreleri ve inflamatuar hücrelerin mikroskop altında gibi örnek içeriği ayırt için montaj ile monte edilmesi gerekir. Pap numune montaj adım hazırlanan örnek kurutulur çünkü hücrelerin mikroskop altında gözlemlemek neredeyse imkansız. İçinde karşılaştırma, Giemsa boyama kurutulmuş durumda görülebilir, bu nedenle, montaj adım hızlı hücresel değerlendirme için gerekli değildir. Kuru numune gerektirdiğinden mikrodiseksiyon için Giemsa boyama daha uygundur.

Bu raporda, biz Giemsa boyama ile TIC numunelerin hazırlanması için basit ve hızlı bir yöntem tanıtmak ve TIC FFPE numuneler ile karşılaştırıldığında DNA için daha iyi bir kaynak olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. TIC hazırlık Normal cam kullanarak hızlı mikroskopik değerlendirmesi için slaytlar

  1. Klinik Patolojik doku malzemelerin mevcut olacağı sonra en kısa zamanda TIC hazırlık gerçekleştirin. TIC numuneler hemen hazır değil, serum ıslatılmış kaplı doku malzemeler steril gazlı bez tutmak ve dokuları kurutma önlemek için buzdolabında saklamak.
  2. Klinik olarak cerrahi veya endoskopi tarafından elde edilen 5 mm3 doku malzeme solid tümör (örneğin, karaciğer, akciğer ve meme dokuları) gibi hazırlayın.
    1. Yavaşça doku fizyolojik serum kaplı steril gazlı bezle silin ve kan, doku yüzeyi çok kan varsa kaldırın.
    2. Biyopsi malzeme gibi mikroskobik örnekleri için fizyolojik serum içinde batırılmış steril gazlı bezle nemlendirilmiş örnek tutmak.
  3. Kesmek ve normal doku düzeltme bıçakla trim ve tümör kitleleri fena halde görünür değilse tümör lezyon yüzeyine karşı karşıya.
  4. Eldivenli ellerle birkaç kez normal cam slayda rezeke örneklerin tümör yüzeye dokunun. Görsel olarak dokundu alan üzerinde normal cam slayt % 80'i olduğunu doğrulayın.
  5. Hafifçe karşı bir polietilen Naftalin (PEN) membran slayda normal cam slayt tuşuna basın ve 2 - 3 kez eldivenli elleriyle hafifçe ovalayın. Görsel olarak hücreleri kalem membran slayda normal cam slayttan aktarılır onaylayın.
  6. Cam ve kalem membran slaytlar oda sıcaklığında 5 min için kuruması.
  7. Doğrudan saytolojik muayene için normal cam slayt leke. 5 s için sabitleştirici çözüm ile cam slaytlar ve çözüm 15 boyama Giemsa ile sonra leke daldırma s.
  8. Değerlendirmek ve tamamen hızlı değerlendirme için mikroskop ile tümör içeriği ve cellularity normal cam slayt üzerinde ekran. Tümör hücreleri çeşitli ölçütlere göre değerlendirmek; Nükleer genişleme, anormal karyotip, bol Kromatin, hücre eşitsiz dağılımı, nükleer bileşen/sitoplazmik bileşeni, hücre boyutunu ve hücre polarite oranı.

2. genetik test için hazırlık kalem membran Slayt Film

  1. Örnek tümör cellularity gösteriyorsa hızlı mikroskopik değerlendirme (1.8. adım) üzerinden % 60 oranında tümör dokundu filmin DNA ekstraksiyon kalem membran slaytların bir bıçak ile kesmek ve eldivenli elleri. Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.
  2. Tümör cellularity düşük (az %60 tümör içindekiler) hızlı mikroskopik değerlendirme (Adım 1.8) tarafından tespit edildi, lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanın ve tümör örneklerini almak.
    1. Standart protokolleri kullanarak tümör hücreleri değerlendirmek için boyama Giemsa gerçekleştirin.
    2. PEM membran slayt uygun lazer yakalama mikrodiseksiyon tarafından film kesti.
    3. Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.
    4. Film içeren microcentrifuge tüp 4 ° C'de (protokol burada duraklatılmış) DNA ekstraksiyon kadar saklayın.

3. DNA ekstraksiyon

  1. DNA çekme--dan küçük değişiklikler ile FFPE DNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak TIC veya FFPE doku örnekleri gerçekleştirin. FFPE DNA ekstraksiyon adım için eşdeğer bir takımdır.
  2. Doku lizis arabelleği 180 µL eklemek (pH = 8,3) el ile 200-µL pipet ile film içeren microcentrifuge Tube. 5 için maksimum hızda (yaklaşık 2500 rpm) bir girdap karıştırıcılı vortexing tarafından İndinavir K bir el ile 20 µL pipet ve karıştırmak ile 20 µL eklemek s.
  3. 56 ° C'de örnekleri gecede bir hava kuluçka ile kuluçkaya.
  4. 90 ° c ısı blok için 1 saat 10 dk, FFPE ve TIC örnekleri sırasıyla kuluçkaya. Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.
  5. 200 µL lizis arabelleği için örnek bir 200-µL pipet ve karıştırmak ile iyice vortexing 5 için maksimum hızda tarafından ekleyin s.
  6. Etanol (96-%100) 200-µL pipet ile 200 µL ekleyip iyice karıştırın kısaca 5 için maksimum hızda vortexing tarafından s. spin microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.
  7. Dikkatle 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun için tüm lysate aktarma
  8. Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.
  9. Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin
  10. Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.
  11. Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin
  12. Akış-aracılığıyla bir plastik atık kutusuna içeren koleksiyon tüp atmak. Spin sütun eldivenli ellerle temiz 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 20.000 x g 3 dk membran kuruması için 25 ° c de santrifüj kapasitesi.
  13. Spin sütun bir DNA-düşük bağlama tüp eldivenli ellerle yerleştirin.
    1. 40-50 µL elüsyon arabelleği membran 100 µL pipet ile Merkezi ekler.
    2. 5 min ve 25 ° C'de 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj için oda sıcaklığında kuluçkaya
    3. DNA örnekleri-20 ° c (protokol burada duraklatılmış) sonraki adım kadar saklayın.

4. nicel gerçek zamanlı PCR ile DNA kalitesinin tahmini

  1. Aşağıdaki gibi bir pipet ile steril microcentrifuge tüp ana karışımda hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon boyutu: 87 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.
  2. Bir steril microcentrifuge tüp ikinci ana karışımda gibi hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon Boyut: 268 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.
  3. Seri dilutions (kit ile sağlanan) insan kontrolü genomik DNA'ın beş maddelik standart eğri için 4 kez gerçekleştirmek ve mutlak DNA konsantrasyonları13belirlemek.
  4. 19 µL iki hazır ana karışımları (4.1 ve 4.2 adımda hazırlanan) bir optik 96-iyi tepki plaka 20 µL pipet ile ayrı kuyu içine ekleyin.
  5. FFPE DNA veya TIC DNA 2-µL pipet ile reaksiyon karışımı içeren wells ayırmak için 1 µL ekleyin. Hiçbir şablon kontrolü için tepki karışımı içeren ayrı bir kuyuya 1 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
  6. Optik bir yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma. Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.
  7. 96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s 2000 devirde oda sıcaklığında. Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  8. Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip s,
  9. DNA (göreli miktar; oranıyla DNA fragmantasyonu değerlendirmek RQ) elde edilen uzun amplicon için (268 bp) kısa amplicon için (87 bp). RQ kısa amplicon13uzun amplicon / ortalama değeri ortalama değeridir.

5. bir sonraki nesil sıralama kitaplığı hazırlanması

  1. Sıralama kitaplığı üreticinin yönergeleri doğrultusunda sonraki nesil sıralama için hazır olun.
  2. Steril microcentrifuge tüp örnek başına çoklu PCR ana karışımda gibi hazırlamak: 4 µL Multiplex PCR reaksiyon çözüm, 4 µL astar Havuzu, ≤6 µL TIC veya FFPE DNA (1-100 ng), x 5 x 5 ve 20 µL kadar nükleaz ücretsiz su ekleyin.
    1. Çoklu PCR ana karışımı bir PCR tüp için hafifçe tüp dokunarak ekleyip karıştırın.
    2. Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.
  3. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 99 ° C için 2 dk, 99 ° C 20 döngüsü tarafından takip için 15 s ve 60 ° C 4 dk ve holding için adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
    Not: astar çiftleri sayısına göre devir sayısını belirleyin.
  4. PCR tüp kapağını açın ve restriksiyon enzimi 2-µL pipet ile 2 µL ekleyin. Kapağı PCR tüp ve karışımı yavaşça PCR tüp dokunarak Giriş Paneli'ni kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
  5. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 10 min, 55 ° C 10 min, 60 ° C 20 dk için için için 50 ° C ve holding adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
  6. Her şey bir pipet ile sindirilir PCR amplicons aşağıdaki gibi içeren içine adaptörü ligasyonu ana karışımı ekleyin: 4 µL adaptör ligasyonu çözüm, barkod 0.5 µL, 0.5 µL bağdaştırıcısının, nükleaz ücretsiz su 2 µL ve DNA ligaz 2 µL. PCR tüp ve mix kapağı hafifçe dokunarak kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
  7. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 30 dk, 5 dk, 5 dk, 72 ° C için 68 ° C için 22 ° C ve holding adım 10 ° c
  8. Sıralama kitaplığı üreticinin talimatlarına göre manyetik boncuklar ile arındırmak.
  9. Adaptör bakmaksızın kitaplığı Çözüm 1.5 mL DNA düşük-bağlama tüp içine aktarın. Manyetik boncuklar 45 µL 1st arıtma için DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  10. Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA-düşük bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  11. 200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  12. 5.11 ikinci bir yıkama için yineleyin.
  13. Kısaca 5 için 1.500 x g de mini santrifüj ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.
  14. Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  15. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  16. 50 µL süpernatant, yeni DNA düşük-bağlama tüp içine aktarmak ve manyetik boncuklar 2nd arıtma 100 µL pipet ile 75 µL ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  17. Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  18. 200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  19. 5,18 için ikinci bir yıkama arasındaki adımları yineleyin.
  20. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.
  21. Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  22. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  23. Yeni DNA düşük-bağlama tüp 100 µL pipet ile içine arıtılmış kitaplığı içeren süpernatant ile 45 µL aktarın.

6. Kütüphane konsantrasyon nicel gerçek zamanlı PCR tarafından ölçmek

  1. Her kitaplık üreticisinin yönergeleri13göre konsantrasyonu belirlemek.
    1. Aşağıdaki gibi bir 20-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 2 µL arıtılmış Kütüphanesi ve nükleaz ücretsiz su bir DNA düşük-bağlama tüp 38 µL 2-µL ve 100 µL pipet ile karıştırın.
    2. -20 ° c su katılmamış kitaplıkları adım 7,3 kadar saklayın.
  2. Aşağıdaki gibi bir 200-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 20-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.1 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.
  3. Aşağıdaki gibi bir 2,000-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 200-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.2 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.
  4. Aşağıdaki gibi tepki ana karışım hazırlamak: 2 ana mix çözüm x 10 µL ve astar-sonda tahlil çözüm steril microcentrifuge tüp x 20 1 µL bir pipet ile karıştırın, sonra karışımı tüp dokunarak. 11 µL optik bir 96-şey reaksiyon kuyu içine tepki ana karışımı ekleyin.
  5. Her şey 10 µL pipet ile 9 µL 2,000-fold seyreltilmiş Kütüphanesi, standart her denetimin 9 µL veya 9 nükleaz ücretsiz su µL ekleyin.
  6. Optik yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma.
    1. Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.
    2. 96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s, oda sıcaklığında.
    3. Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  7. Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 50 ° C için 2 dk, 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip s,
  8. Su katılmamış Kütüphane konsantrasyon qPCR ile 2.000 tarafından belirlenen konsantrasyon çarparak hesaplar.

7. sonraki üretimi sıralaması

  1. Çalışma durum planı ve yazılım içinde çalışma parametresini ayarlayın.
    1. [Planı sekmesini] ve [] şablon ve uygun çalışma yöntemini seçin.
    2. Uygulama ve teknik türü seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    3. Enstrüman, örnek hazırlama takımı (isteğe bağlı), kitaplığı seti türü, şablon seti, sıralama seti seçin, kalibrasyon modu temel, türü chip, sıra (isteğe bağlı) ve barkod kümesi kontrol ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    4. Eklentileri seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    5. Projeyi seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    6. Varsayılan başvuru ve hedef bölgenin yatak dosyaları seçin.
    7. Örnek adı yazın, barkod seçin ve [planı Run]'ı tıklatın.
  2. Şablon hazırlama gerçekleştirmek ve üreticinin yönergelerine göre otomatik bir araç yükleme çip. Reaktif kartuşu kullanmadan önce 45 dk için oda sıcaklığında erimek.
  3. Su katılmamış kütüphanede 6,8 adımda hesaplanan Kütüphane konsantrasyon göre nükleaz ücretsiz suyla seyreltik ve 20 pM kitaplıkları olun.
    1. Havuza alınan bir kütüphane sıralama ve buz üzerinde mağaza hazırlayın.
    2. 100 µL pipet ile havuza alınan Kütüphanesi 25 µL örnek tüp altýna ekleyin. 48 saat içinde havuzlu kitaplığı kullanın.
  4. Güç ve otomatik araç kapağını açın.
    1. Sıralama çip, fiş adaptörü, zenginleştirme kartuş, ipucu kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu otomatik araç uygun konuma yerleştirin.
    2. Dokunmatik çalışma [Kurulum] ve [adım adım] üstünde belgili tanımlık perde.
    3. Kapağı kapatın ve [Başlat onay] dokunmatik ekran üzerinde.
    4. Sonra güverte tarama işlemini, [ileri] dokunmatik ekran üzerinde.
    5. (Kit, yonga türü, çip ID, örnek kimliği, planları) ekran içeriğini denetleyin, saati ayarlamak ve [OK] dokunmatik ekran üzerinde.
  5. Çip yükleme bittikten sonra:
    1. [İleri] dokunmatik ekran üzerinde ve kapağını açın.
    2. Sıralama küçük parça--dan fiş adaptörü eldivenli ellerle kaldırıldı.
    3. Çip çip kapsayıcıya yerleştirmek rap parafilm ve sıralama tepki kadar 4 ° C'de mağaza ile.
    4. Zenginleştirme kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu eldivenli ellerle otomatik enstrümanın uygun konumdan kaldırıldı.
    5. Bir boş-ipucu kartuş otomatik araç eldivenli elleri ile atık ipucu konumunu aktarın.
    6. [İleri] dokun ve kapağı kapatın.
    7. [Başlat] dokunma ve 4 dk için ultraviyole ışınları tarafından otomatik araç temiz.
  6. Ultrasaf su ve filtre çözüm 0,22-µm filtre akış filtresi birimi olan 1000 ml sodyum klorit tablet geçiyoruz.
    1. Sıralama araç gücüyle.
    2. Dokunma [temiz] ve [ileri] sıralama enstrümanın ekranda.
    3. Sıralama araç 250 mL filtre sterilize sodyum klorit çözüm ve daha sonra 250 mL ultrasaf su ile temizleyin.
  7. [Başlat] dokunun ve ekrandaki uygun sıralama seti seçin.
    1. Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.
    2. (Kit ile sağlanan) yıkama çözüm, (100 mM sodyum hidroksit 350 µL içeren) pH ayarlama çözüm ve (kit ile sağlanan) pH standart çözüm ile sıralama aracı başlatın.
  8. (Kit ile sağlanan) dATP, dGTP, dCTP ve dTTP nükleotit (Seti'nde sağlanan) 50 mL tüpler 20 µL 100 µL pipet ile ekleyin.
    1. Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.
    2. 50 mL tüp ve vida sıralama araç üzerine yükleyin.
    3. [İleri] dokunmatik ekran üzerinde yaklaşık 25 dakika sürer başlatma adım başlamak için.
  9. Başlatma adımı tamamladıktan sonra:
    1. [Run] dokunmatik ekran üzerinde ve uygun Kütüphane hazırlık aracı seçin.
    2. Çipin iki boyutlu barkod tarama.
    3. Uygun konumu sıralama çipte yerleştirin.
    4. Çip kelepçe ve enstrüman kapıyı kapat.
    5. [Çip onay] [ileri], dokunma ve [sıralama çalışma başlatmak için ekrandaki OK].
  10. Sıralama reaksiyon sonra veri aktarımı ve veri analiz boru hattı üzerinde sıralama sunucu13,17gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 TIC numuneler DNA ekstraksiyon için hazırlanıyor üzerinden tüm süreci gösterir. Özellikle, yordamı genomik DNA TIC örneklerinden elde etmek için sadece iki gün alır. Biz herhangi bir etkisi tümör depolama slayt işlemeden önce değerlendirildi. Tümör hücreleri doku örnekleri hemen slayt dokundu vardı ve dokular serum fizyolojik nemli steril-gazlı bez için 1 h (Şekil 2) tutuldu cam slayt bağlı olduğunu bulduk. Dokulara oda s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, tümör DNA TIC kullanarak klinik patolojik numunelerin elde etmek için alternatif bir yöntem mevcuttur. TIC hazırlık çok basittir ve FFPE yöntemleri, özel aletleri10zorunluluğu olmadan ile karşılaştırıldığında daha az zaman ihtiyacı var. TIC hazırlık DNA ekstraksiyon için yordamlar (şekil 1) iki gün içinde tamamlanabilir. Bu yöntem böylece genetik test gerçekleştirmek için geri dönüş süresini kısaltır. Özellikle, bu moleküler analiz için gereken gün sayıs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Hastane ve hastaların tüm tıbbi ve yardımcı personel katılmayı kabul etmiş için teşekkür ediyoruz. Gabrielle White Wolf, doktora, Edanz bu raporu taslağını düzenlemek için Grup (www.edanzediting.com/ac) teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada genom araştırma projesinden Yamanashi İli (YH ve tarzı) ve bir hibe üzerinden YASUDA tıbbi Vakfı (YH) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
FINE FROST white20 mikro sürgülü camMatsunami Glass ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN Membran Cam SlaytlarThermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Hızlı A çözümüMuto Saf Kimyasallar20571
Cyto Hızlı B çözümüMuto Saf Kimyasallar20581
Mayıs-Grunwald ÇözümüMuto Saf Kimyasallar15053
Giemsa çözümüMuto Saf Kimyasallar15002
QIAamp DNA FFPE doku kitiQiagen56404
TaqMan Hızlı Gelişmiş Master MixThermo Fisher Bilimsel4444557
TaqMan RNase P Algılama Reaktifleri KitiThermo Fisher Bilimsel4316831
FFPE DNA QC Testi v2'denTaqMan TestiThermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası Thermo Fisher Scientific4346907
MicroAmp optik Yapışkan FilmThermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
İyon Kütüphanesi TaqMan Kantitasyon KitiThermo Fisher Scientific4468802
İyon AmpliSeq Kanser Sıcak Nokta Paneli v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq Kütüphane Kiti 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress Barkod Adaptörleri 1-16 TakımıThermo Fisher Scientific4471250
İyon PGM Hi-Q View Sıralama Kiti (200 taban)Thermo Fisher ScientificA30044
İyon Şef SistemiThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96 kuyulu Termal DöngüleyiciThermo Fisher ScientificVeriti200
İyon 318 Çip Kiti v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
İyon PGM SistemiThermo Fisher ScientificPGM11-001
İyon PGM Yıkama 2 Şişe kitiThermo Fisher ScientificA25591
Agencourt ve ticaret; AMPür ve ticaret; XP KitiBeckman CoulterA63881
16 konumlu Manyetik StandThermo Fisher Scientific4457858
Yapışmaz, RNaz içermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL (Düşük bağlayıcı tüp)Thermo Fisher ScientificAM12450
Nükleaz içermeyen suThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp ve ticaret; Optik 96 kuyulu Reaksiyon PlakalarıThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp & trade; Şeffaf Yapışkan FilmThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt & trade; AMPür ve ticaret; XP KitiBeckman CoulterA63881
Etanol (99.5)Nacalai Tesque08948-25
Sodyum hidroksit (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS Pipet L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipet-Lite LTS Pipet L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
Pipet-Lite LTS Pipet L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
küçük değişimWAKENMODEL8864Mini santrifüj
küçük inkübatörWAKENWKN-2290Hava inkübatörü
SensiCare Pudrasız Nitril Muayene EldivenleriMEDLINESEM486802
Steril gazlı bezOsaki11138
Buzdolabı MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
TÜY DÜZELTME BLADTÜYNo.130
TÜY DÜZELTME BLADTÜYNo.260
TÜY STÜYFA-10
Vorteks Genius 3IKA41-0458Vorteks karıştırıcı
PincetteNATSUMEA-5
1.5 mL mikrotüpBIOBIKRC-0150
Serisi

Kaynaklar

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3(2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493(2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tümör DNA EkstraksiyonuFFPE DNA KarşılaştırmasıPEN Membran LamıDNA Kalite DeğerlendirmesiYeni Nesil DizilemeDijital PCRKantitatif Real Time PCRSomatik Mutasyon TespitiOtomatize Dizileme
Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.