Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Nöronal iletişim nörotransmitter içeren sinaptik veziküller plazma zarı¹ile düzenlenmiş füzyon yoluyla oluşur nörotransmitter yayın kullanır. Ekzositozu^2,3,4,5,6 adı verilen bu işlem son derece dinamik ve yukarı - veya aşağı-düzenlenmiş göre stimülasyon⁷oranı dalgalanmalar olabilir. Bu süreçlerle ilgili proteinler Albert hareket tabi vardır ve bu nedenle Ortaölçek organizasyon bu fizyolojik fonksiyonları temelini oluşturan eylemleri bağlama bir dizi sürdürülmesi yetenekli görüntüleyin. Plazma membran proteinlerinin plazma zarı^{7,8,9,10,11nanoclusters içine moleküllerin yanal yakalama sağlayan son derece dinamik, 12}. Bu nedenle, bu proteinler hareketliliğini soruşturma eylem⁸onların modu aydınlatmak için yardımcı olur. Sinaptik proteinler çözünür N-ethylmaleimide hassas faktör ek protein reseptörü (tuzaklarına), örneğin sözdiziminin-1A, gibi şimdi yanı sıra yanal hızlı hareketlilik sergi lateral görüntü bindirme olarak moleküler sunabilir nanoclusters içinde olduğu bilinmektedir depoları ve siteleri vezikül füzyon^9,13,14,15.

Monomeric (m) Eos^16,17 ve Kaede¹⁸, gibi photoconvertible floresan proteinlerin son gelişmeler böyle nöronal plazma membran proteinlerinin yaklaşımlar kullanarak Ortaölçek çözünürlüğe sağladı Fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)^14,15,19. Bu gelişmeler hareketlilik ve nanoclustering kültürlü canlı hücreleri ve nöronlar biyolojik proteinlerin soruşturmalar etkinleştirdiniz. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar (benzer yüksek çözünürlüklerde) dinamiği ve canlı olduğu gibi organizmalar nöronlar içinde bu membran proteinlerinin organizasyonu böyle Mus musculus, Caenorhabditis elegans ve aydınlatmak için gerçekleştirilen Drosophila melanogaster^14,20,21,22.

Araştırma dynamics ve protein vivo içinde organizasyonu sadece (örneğin fluorophores) PALM, fırtına ve photoconvertible, son zamanlarda geliştirilen süper çözünürlük görüntüleme araçlarının kullanımı bu tür engelleri aşmak için de alması gereken Erişilebilirlik protein ve düşsel lazer penetrasyon derinliği. Sağlam bir hayvan hücre içi proteinlerin Imaging proteinler sağlam hayvan, sağlam bir farenin Hipokampus gibi dokuların yaşam içinde derin gömülü yapıları üzerinde görüntüleme doğal olarak meydan okuyor. Bu nedenle, proteinler veya doku yüzeyine yakın daha kolay görüntüsü. Vivo Imaging ile başka bir zorluk hayvanlar arasında tekrarlanabilirlik sağlamada olduğunu. Anatomi bir örnekten diğerine farklı olabilir gibi farklı olduğu gibi hayvan örnekleri çoğaltması kolaylığı ile bir yapı seçerek de zorlu kanıtlamak. Basmakalıp yapıların kullanımını gibi synapses, bazı bu zorlukların üstesinden ile yardımcı.

Diğer araştırmalar yüzeyi protein organizasyonu bir doku/organ, örneğin yansıma iken son yıllarda yapılan çalışmalarda protein hareketlilik Caenorhabditis elegans²²gibi optik şeffaf bir epidermis ile hayvanlarda görüntüsü bir canlı fare²¹kafatası ile kortikal nöronlar aktin görüntüleme. Bazı durumlarda, anestezikler hayvan hareketsiz tutmak için kullanılmıştır; Ancak, belirli anestezikler faiz protein olumsuz etkileyebilir. Hayvanlar vivo içinde görüntüleme sırasında hareketsiz tutmak için alternatif yolları bu nedenle hata en aza indirmek için keşfedilmeyi.

Süper çözünürlük görüntüleme vivo içinde için başka bir uyarı faiz proteinlerin aydınlatmak için kullanılan lazerler çevreleyen doku olumsuz etkileyebilecek ve bu nedenle uyarma yoğunluk mümkün olduğunca düşük tutmak tavsiye edilir. Aydınlatma lazer tarafından çevreleyen doku aynı zamanda arka plan sinyal artırmak eğilimindedir. Düşük uyarma yoğunluğu kullanımı arka plan azaltmak yardımcı olur, olmak uyarı da floresan protein foton verim azalmasına neden olabilir. Alternatif arka plan sinyal görüntü analizi önce azaltmak aracı olarak arka plan çıkarma analizi sırasında kullanılabilir.

Drosophila belirli protein fonksiyon incelenmesi için köklü genetik araçları sağladığından vivo içinde görüntüleme için ideal bir organizma sunar. Ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS)-Gal4 sistemi proteinlerin zamansal ve mekansal ifade sağlar ve bu nedenle neurotransmission²³, işlemek için kullanılabilir öyle ki termo-genetik stimülasyon Drosophila geçici kullanma reseptör olası alt aile A1 (dTRPA1)²⁴ veya opto-genetik uyarı far kırmızı kaymıştır CsChrimson²⁵ kullanarak¹⁴Imaging ile birleştirilebilir. Vivo içinde tek molekül görüntüleme programında küçük bir sistem performans komplikasyonlar çoğunun üstesinden var ve şimdi nasıl tek-parçacık izleme Drosophila melanogaster üçüncü INSTAR larva içinde yürütülen olabilir açıklar.

1. tasarım transgenik Drosophila mEos2 öğesini proteinler ifade

1. MEos2 protein ile etiketlenmesi için protein seçin. Proteinler bir transmembran etki alanı ile görüntüleme başarı oranını artırmak için proteinler sinaptik veziküller veya autophagosomes^26,27 (Örneğin, nöronal plazma zarı¹⁴ ' te (örneğin, sözdiziminin-1A), seçin Synaptobrevin-2), ya da yakın etkileşim nöronal plazma membran proteinlerinin (örneğin, Munc18-1) ile sitozolik protein.
2. Transgenes (şekil 1) mEos2 öğesini protein kodlama oluşturmak. Protein ve mEos2 için ileriye ve geriye doğru astar tasarım.
   Not: MEos2 kodlama dizisi üzerinden faiz protein C-terminus sigorta için tasarlanmış pmEos2-N1 plazmid çoğaltılabilir. Klonlama örneğin yapılabilir pFL44S kullanarak Saccharomyces cerevisiae vivo içinde rekombinasyon tarafından-attB-MCS-w + vektör^14,28, klonlama başka yöntemler Gibson gibi alternatif olarak kullanılabilir derleme protokolü²⁹.
   1. Vektör BamHI ve XbaI ile linearize ve ura3 - Maya hücreleri mEos2 ve faiz protein kodlama PCR parçaları ile birlikte ortak dönüştürmek. Drosophila embriyo bir transgenik sinek çizgi³⁰oluşturmak için sahip yapı enjekte.
3. Transgenik sinek kültürler standart Maya ve Şeker Pekmezi orta veya bazı diğer uygun yerine Plastik şişeleri bulunan arka. Sağlıklı ve oldukça büyük sinaptik boutons³¹emin olmak için şişeleri doluluk sinekli önlemek ve sinekler için yeni tüpleri yumurta atma her gün sonra çevir; Bu üçüncü INSTAR larva iyi beslenir ve medyada dolaşan başlamak zaman uygun büyüklük ulaşmak sağlar. Oda sıcaklığında (25 ° C) transgenik sinek yükseltmek.
   Not: Daha büyük sinaptik boutons proteinler görüntüleme sırasında görselleştirildiği daha büyük miktar verim eğilimindedir.

2. üçüncü INSTAR Larva diseksiyon

1. Silindirik veya semicylindrical şekilli polydimethylsiloxane (PDMS) temel ≤20 mm çap ve ≤20 mm yüksekliğinde bir uygun silikon elastomer Kiti (şekil 2A) kullanarak olun. Ajan 10:1 oranında artırma bir silikon silikon elastomer karıştırın.
   1. İyice için 5 dk. dimsensions ile bir kalıp içine karışımı yukarıda listelenen Pour karışımı ilave edin. Bir fırında 45 dk için 100 ° C'de sertleşmesine izin. PDMS Bankası hangi diseksiyon taşımak temel olarak hizmet verecek. PDMS Bankası kültür cam popolu çanak kuyuya uyuyor emin olun.
2. Bir göçebe üçüncü INSTAR larva şişe duvardan seçin. Optik bir stereo mikroskop 4,5 büyütme oranında PDMS silindir tabanı dorsal yüzü yukarı yerleştirilen larva görselleştirmek için kullanın.
3. Kavisli ve açılı ön vızıltısı, genişletme ikisi arasında ağız kanca kafasına ve iki arka vızıltısı arasında anüs üzerinde kuyruk minutien iğne sopa için cımbız kullanın. Schneider'ın böcek Orta 40 µL üzerine immobilize larva oda sıcaklığında ekleyin.
   Not: Hemolyph benzeri çözümler (HL3 veya HL6) de Schneider'ın çözüm^32,33yerine kullanılabilir.
4. Duvar orta hat deşmek için minutien iğne kullanımı tarafından larva karın vücut duvarına sırt tarafında üzerinden erişimi sağlar.
5. Vücut duvar kesmek için kullanım bahar makas kesiği noktadan açın. Ön-arka yönü³⁴orta çizgi boyunca kesin.
6. İyi forseps kullanın ve bahar larva deşeceğin makas: tükürük bezleri, trakea ve gut gibi iç organların kaldırın. Larva Schneider'ın böcek orta ile iki kez yıkayın.
7. İyi Forseps ile iki vücut duvar flep tutun, yavaşça onları dışarı uzatmak ve her iki tarafta iki minutien iğne sopa. Bu bir Altıgen şeklinde hazırlık (şekil 2A) üretmek gerekir.
8. Beyin görüntüleme sırasında kas hareketi olasılığını azaltmak için Bahar makas kullanarak ventral sinir kablosu bağlantısını kesin; Bu da hazırlık karşı düz görüntüleme çanak tutmak için hizmet vermektedir. Tüm altı minutien mandal PDMS temel içine itmek için eğri cımbız kullanın.
   Not: Pimleri yalnızca küçük bir bölümünü karın duvarı içinde gömülü olması.
9. Larva diseksiyon yordamı yaşamıştır onaylamak, biraz it ventral sinir kablosu için bu larva karın duvarı Peristaltik bir daralma temin.

3. hafifçe eğik aydınlatma tek-parçacık izleme mikroskobu

1. Bir cam popolu kültür yemek üzerine disseke larva-PDMS Bankası tersine çevirin. Görüntüleme yemek oda sıcaklığında Schneider'ın böcek orta (şekil 2B) 2 mL ile doldurulması.
2. Motor nöronlar sinapslarda karın kasları 6 ve 7³⁵ 63 x kullanarak üzerinde olan ikinci ve üçüncü kesimi bulun / 1.2 NA su-daldırma amaçta floresan toplam iç yansıma (TIRF) floresan mikroskop.
3. Mikroskop göz mercekleri disseke larva bulmak için kullanın; kas 6 parlak alan aydınlatma kullanımı ile tanımlayın.
4. Mikroskop edinme yazılım kullanın (bkz. Tablo reçetesi) TIRF yapılandırma; Kolimatör kamera açısını penetrasyon arttırmak, aksi takdirde eğik aydınlatma elde etmek için TIRF kritik açı dışarı taşımak için 1 ° için kaydırın.
5. 488 nm lazer mEos2 yeşil görselleştirmek için geçiş yapma. Düşük lazer gücü kullanmak (22,8 az % 5 mW) yeşil Floresans ağartma önlemek için. (Bu boncuklar gibi bir ipe bak) nöromüsküler kavşak bulun ve düşük çözünürlüklü TIRF görüntü elde etmek.
6. Aynı anda 405 nm lazer üzerinde geçiş (photoconverts mEos2 gelen yeşil kırmızı türler için) ve stochastically tek mEos2 floresan proteinler yerelleştirmek için 561 nm lazer (İmaj photoconverted kırmızı mEos2).
   Not: Düşük 405 nm lazer güç kullanılması tavsiye edilir (4,78 %0,9 0.005 mW) gibi bu film satın alma sırasında bir nispeten sabit photoconversion oranı için sağlar. 50 ve 561 nm lazer % 75'i arasındaki kullanım (20,1 mW), bu olumsuz nöromüsküler kavşak çevreleyen kas dokusu morfolojisi etkilemeden Floresans kırmızı mEos2 türlerden elde etmek yeterli olduğu gibi.
7. Her nöromüsküler kavşak zinciri için serisi 15.000 çerçeveler ya da daha fazla 33 Hz., as.czi biçimi eşlik eden meta veri olası başvuru için korumak için oluşan bir zaman alacak.
8. ImageJ '.czi' film dosyaları '.tiff' dosyalarını dönüştürmek için kullanın.
9. Uygun tek molekül FIJI/ImageJ³⁷ ' TrackMate gibi analitik yazılım^11,14,36 izleme ile alınan Filmler analiz ( Tablo malzemelerigörmek). 'X' ve 'y' bulur her yerelleştirme tarafından Gauss uygun yoğunluk noktasının koordinatlarını yayıldı fonksiyonu (PSF).
   Not: sorun giderme: yeşil floresan değil görülmektedir veya çok karanlık 488 nm lazer maruz üzerine nöromusküler kavşakta, kısaca photoconverting ve lazerler Imaging geçiş (405 nm ve 561 nm), bu kırmızı daha fazla üretmek için yardımcı olarak mEos2 tür. 488 nm lazer geri geçiş yapmak ve TIRF resim al.

4. tek molekül yerelleştirme sabit larva içinde

1. Protein nanocluster boyutu PALM ile ölçmek için sonra diseksiyon bir sabitleştirici - fosfat tamponlu tuz (PBS) seyreltilmiş %4 paraformaldehyde ile Schneider'ın böcek orta yerine.
2. Larva, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
3. Diseksiyon pimleri ve sabit larva 1.7 mL içinde yer Kaldır ek kilit microcentrifuge tüp temizleyin.
4. İncelemek ve birçok diğer larvalar gerektiği gibi o zaman onları üç kez PBS ile yıkamak gibi düzeltin.
5. PBS blok arabellek (PBS, %0.1 Triton X-100 ve % 3 normal keçi serum bir çözüm) ile değiştirin.
6. Larvalar PBS ile üç kez yıkayın, sonra gerekli birincil antikor (blok arabellek çözümde seyreltilmiş) ile kuluçkaya.
7. Gecede 4 ^EyC. kuluçkaya
8. Larvalar üç kez PBS ile yıkayın, sonra gerekli ikincil antikor (blok arabellek çözümde seyreltilmiş) ile kuluçkaya.
9. Larvalar üç kez PBS ile yıkayın, larva geri PDMS Bankası ve daha önce açıklanan tek molekül izleme için görüntü üzerine ekleyin.

Yukarıda listelenen, sözdiziminin-1A-mEos2 transgenik Drosophilamelanogaster vardı protokolü kullanılarak oluşturulan (şekil 1). Transgenik üçüncü Drosophila biçim larva PDMS silindirik Bankası (şekil 2A-F) disseke. Sözdiziminin-1a tek molekülleri görselleştirmek için PALM üzerinde hafifçe eğik lazer aydınlatma14TIRF mikroskopla kullandık.

Sözdiziminin-1a tek molekülleri kas 6 ikinci karın parçasının presynaptic motor sinir terminalde üzerinde takip. MEos2 yeşil Floresans sözdiziminin-1A-mEos2 düşük çözünürlüklü görüntü 488 nm lazer (şekil 3A) kullanarak heyecanlı zaman tip 1b boutons üzerinde görüldüğü gibi tespit edilemedi. Görüntüleme deneylerde, 405 nm ve 561 nm uyarma lazer görüntüleme derinliklerinde idi 133.5 nm ve 165.6 nm, anılan sıraya göre. Yeşil resim 16 tek tek kare ortalama satın alınmıştır. Bu yeşil görüntü bölge presynaptic motor sinir terminallere yalnız photoconverted filmi yerelleştirmeler analizini sınırlamak için kullanılan ilgi oluşturmak için kullanılan.

Çözümleme alınan photoconverted sptPALM film süper çözümlenmiş bir yoğunluk, difüzyon katsayısı, oluşturulan ve yörünge (şekil 3A) eşler. Sözdiziminin-1A-mEos2 hareketlilik daha fazla bireysel yörüngeler (şekil 3B) ortalama kare deplasman (MSD) analizi ile sayısal. İstatistiksel karşılaştırmalar yapılabilir (şekil 3B) MSD eğri altındaki alan kullanarak. Hareketlilik daha fazla çözümleme sözdiziminin-1A-mEos2 Difüzyon katsayısı dağılımı verir ve bu istatistiksel olarak hareketsiz nüfus (şekil 3 c) mobil karşılaştırma tarafından değerlendirilir.

Resim 1 : MEos2 öğesini yapıları oluşturuluyor. PFL44S-attB-MCS-w + vektör doğrusallaştırılmış BamHI ve XbaI ile. Faiz (POI) protein kodlama örtüşen Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) parçaları ve mEos2, sırasıyla, örneğin, in vivo rekombinasyon ura3 - Maya hücrelerinde veya Gibson derleme klonlanmış. Sözdiziminin-1A-mEos2 transgene üretmek için biz endojen sözdiziminin-1A organizatörü ve Sonlandırıcı dizileri tarafından çevrili yapı klonlanmış olduğunu unutmayın. Elde edilen yapı daha sonra mEos2 için erimiş protein (POI) ilgi ifade transgenik bir sinek satır oluşturmak için Drosophila embriyo içine enjekte edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Drosophila larva diseksiyon ve eğik aydınlatma. Yarım silindirik PDMS üste yürütülen Drosophila larva diseksiyon gösteren(a)şema. Filetoların larva üzerine düzenlenen PDMS minutien iğne kullanımı ile jel. (B-C) Larva PDMS hazırlık Schneider'ın böcek orta içeren bir kültür cam popolu çanak yerleştirilmiştir. TIRF mikroskop hafifçe eğik aydınlatma yapılandırmasında sözdiziminin-1A-mEos2 motor sinir terminallerine görselleştirmek için kullanıldı. (D-F) Yarım silindirik PDMS Bankası disseke Drosophila larva ile. Larva PDMS hazırlık Schneider'ın orta ile dolu bir görüntüleme tabağına yerleştirildi ve larva süper çözünürlük PALM mikroskobunun görüntüsü. Ölçek çubuğu, 10 mm. (bu rakam14değiştirildi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Vivo sözdiziminin-1A-mEos2 presynaptic motor sinir terminal, bir izleme. (A) A düşük çözünürlüklü TIRF görüntü sözdiziminin-1A-mEos2 üzerinde bir tip 1b motor sinir terminal. Photoconversion film analizi 33 oluşturulan Hz sptPALM süper çözümlenmiş yoğunluğu, difüzyon katsayısı ve yörünge haritalar görüntüsü. 5,309 bireysel yörüngeleri görüntülü üzerinde 16.000 kare film satın alma olduğunu. Ölçek çubuğu, 3 mikron. (B-C) Ortalama kare deplasman (MSD) sözdiziminin-1A-mEos2 6 farklı motor sinir terminallerine çizildi; (AUC) MSD eğri altındaki alan hareketlilik düzeyini ölçmek için kullanıldı. Difüzyon katsayısı dağıtım birbirlerinin oranları sayısal telefon ve hareketsiz sözdiziminin-1A nüfus ortaya koymaktadır; ~ 2400 yörüngeleri ortalama motor sinir terminal elde (n = 3 larva). Ortalama ortalama standart hatası sunulan veri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.