Method Article

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

DOI:

10.3791/57020

⸱

May 11th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüs gibi parçacıklar (VIP) nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya algılama ve çeşitli hastalıkların tedavisinde küçük moleküller teslim etmek için kullanılmaktadır. Bu uygulama üzerinde genetik değişiklik, kendinden montajlı dayanır ve sistein konjügasyon, rekombinant VIP'ler. tümör hedefleme uygulama yerine getirmek ile genetik karşılaştırıldığında yabancı peptidler VIP'ler için değişiklik yalnız, kimyasal konjugasyon sunar bir önemli avantaj varlıkları, sentetik peptidler veya oligosakkaritler VIP yüzeye bir modüle edilmiş ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan Birleşik, gibi çeşitli sağlar çünkü.

Burada, biz nasıl hepatit E virüs nanopartikül (HEVNP), bir modularized theranostic kapsülü, bir çok fonksiyonlu teslim taşıyıcı olarak kullanıldığını göstermektedir. HEVNPs fonksiyonlar doku hedefleme, görüntüleme ve tedavi teslim. HEVNP köklü yapısal araştırmaya dayalı, yapısal olarak bağımsız ve yüzey Günese maruz kalan artıkları sistein yerine konjugasyon siteleri maleimide bağlı kimyasal gruplar thiol seçici bağlantıları üzerinden için seçildi. Belirli bir sistein-modified HEVNP (573, asparagine Cys yerine aa (HEVNP - 573C)) için bir meme kanseri hücre özgü ligand, LXY30 Birleşik ve tümör hedefli işleme yakın kızılötesi (Nur) floresan boya ile (Cy5.5), etiketli Etkili tanı kapsül (LXY30-HEVNP-Cy5.5) olarak HEVNPs. Benzer mühendislik stratejileri tanınmış atomik yapıları ile diğer makromoleküllerin kompleksleri ile theranostic teslim potansiyel uygulamalar keşfetmek için istihdam edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nano ölçekli vektörel çizimler nanotheranostics bilinen tedavi ve teşhis teslimat gelişimi çok hedeflenen teslimat1doğru Genelleştirilmiş tedaviler uzak Biyomedikal alanının kaymıştır. Hedeflenen nanotheranostic teslim stabil bir belirli hastalıklı doku ya da biyokimyasal yol2,3,4 theranostic moleküller doğrudan theranostic molekülleri ile nano ölçekli vektörel çizimler (nano tanecikleri) entegre . Çünkü en iyi şekilde ölçekli nano tanecikleri kapasite theranostic molekülleri ise stabilize ve seçmeli olarak hedef hücre yüzey molekülleri hastalıklı doku....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HEVNP üretim böcek hücrelerinde

Not: Tüm aşağıdaki adımları bir hücre kültür mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Bizim önceki yayın için daha ayrıntılı HEVNP üretim işlemleri11bakın.

  1. Kültür Sf9 böcek hücrelerinde ( Tablo malzemelerigörmek) Medya 50-u izdiham içinde 6-şey plakaları için hücre.
  2. Böcek hücre transfection reaktifler göre üreticinin iletişim kurallarını kullanarak, rekombinant baculovirus üretmek için Bacmids HEVNP - 573C ORF2 Sf99 hücrelere içeren transfect. 27 ° C'de transfected hücreleri hücre canlılığı bağlı olarak 3-6 gün kuluçkaya.
  3. (Transfected hü....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEV-VIP, benzer tüm Cys oluşan HEVNPs çözünür icosahedral capsids değiştirilebilir ve çözümde üretim veya arıtma sırasında toplam değil. Önce ve sonra tek adım maleimide-biotin konjügasyon, her biri Cys modifiye HEVNPs HEV-VIP negatif leke EM (Şekil 2) içinde ayırdedilemez. Maleimide-biotin konjugasyon verimliliği Cys değiştirilmiş HEVNPs ilk Batı chemiluminescent streptavidin bağlama yoluyla kurutma ile test edildi. Maleimide-biotin oluşun Cys görüntülenen H.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle hafta sürer, zaman alıcı genetik mühendisliği yordamı aksine burada biz basit iki adım ve ligand hedefleme kanser ekleme 3 gün içinde tamamlanabilir tek adımlı kimyasal konjugasyon yordamlar göstermek ve/veya Floresans algılama boya HEVNPs Cys/Lys sitelerine. Teknik-ebilmek var olmak kullanılmış için en iyi ligand hedef ekran aday havuzu ve böylece mevcut peptit/küçük molekül sentezi Hizmetleri makul maliyet ve teslimat teker yararlanır.

Geleneksel genetik hangi yalnızca polipeptitl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar tarafından NIH RHC için fon sponsorluk kabul vermek #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım gibi Finlandiya ayırt edici Profesör programı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MINI Diyaliz Üniteleri, 10K MWCOThermo Fisher Scientific69572mini diyaliz ünitesi
High Five Cells ThermoFisher ScientificB85502Tn5 hücreleri
SF9 Hücreleri Thermo Fisher Scientific11496015Sf9 hücreleri
Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon SistemiThermo Fisher ScientificA11101, A11100Baculovirus ekspresyon sistemi
Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon SistemiYaşam Teknolojileri10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024Bacmid
ESF921 Böcek Hücresi Medyaİfade Sistemleri LLC96-001-01böcek hücre ortamı
Cy5.5 NHS ester, 5mgLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları, 40K MWCO, 0.5 mLThermo Scientific87766spin tuzdan arındırma kolonu
MES HidratSigma-Aldrich Chemical CoM8250-250GMES
Ultra Şeffaf Santrifüj İnce Duvar Ultra Santrifüj TüpleriBeckman Coulter, IncRotora Bağlıdırultrasantrifüj tüpü
NuPage% 4-12 Bis-Tris Protein JelleriThermo Fisher ScientificNPO321BOXSDS protein jeli
Cellfectin II ReaktifiThermo Fisher Scientific10362100transfeksiyon reaktifi
EMS Kızdırma Deşarj ElektronMikroskobu Bilimkızdırma deşarj edici

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E Virus NanoparticlesChemical ConjugationSurface FunctionalizationMaleimide BiotinLXY30 LigandCy5 5 Fluorescent TagClick ChemistryTEM ImagingConfocal MicroscopySpin Desalting Column

Related Articles