Yöntem makalesi

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

13.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57028

⸱

9 Nisan 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

Biz coverslips karşı antikorlar için B-hücre reseptör, ilk aşama için bir model ile kaplı üzerinde yayılmış B hücreleri aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve Mikrotubul artı uç proteinler STED mikroskobu kullanılarak bir protokol mevcut bağışıklık synapse oluşumu.

Özet

Membran bağlı antijenleri (örneğin, bir antijen sunan hücre yüzeyinde) bağlamak B hücreleri bağışıklık sinaps, B hücre reseptörü (BCR) sinyal en iyi duruma getirir özel bir hücresel yapısı ve antijen BCR aracılık edinme formu. Her iki aktin sitoiskeleti ve hale gelmesini karşı antijen iletişim site Mikrotubul ağının remodeling bağışıklık synapse oluşumu için gerekli. F-aktin bir yoğun periferik ringe aktin sitoiskeleti remodeling Mikrotubul organize merkezine doğru bağışıklık synapse kutuplaşma eşlik ediyor. Mikrotubul artı uç proteinler gibi kortikal artı uç yakalama proteinler arasında koordineli bir şekilde yeniden izin aktin ve Mikrotubul cytoskeletons fiziksel etkileşimleri aracılık. Denetim hücre iskeleti nasıl bu yapıların anlama yanı sıra, bu hücre iskeleti yeniden yapılanma bağışıklık synapse oluşumu ve BCR sinyal, Şekil B hücre aktivasyonu yeni görüşler sağlayabilir mekanizmaları elucidating. Bu yeni hücre iskeleti ağ organizasyon ayrıntılarını ortaya süper çözünürlük mikroskobu yaklaşımlar geliştirme tarafından destekli. Biz burada uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve transfected GFP öğesini Mikrotubul artı uç proteinler B hücreleri kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bağışıklık sinaps oluşumunda erken olayları modellemek için B hücreleri BCR sinyal ve sitoiskeleti remodeling başlatmak Anti-immünglobulin (anti-IG) antikorları ile kaplı coverslips yaymak için izin verir. Biz adım adım protokoller GFP füzyon protein A20 B-Lenfoma hücrelerdeki ifade etmek için anti-IG-indüklenen hücre yaymak için ve sonraki hücre fiksasyon, Immunostaining, resim alma ve görüntü deconvolution adımları sağlar. Bu yordamları kullanarak elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntüleri aynı anda aktin yapıları, mikrotübüller ve bu iki hücre iskeleti ağ bağlantı olabilir Mikrotubul artı uç bağlayıcı proteinler görselleştirmek izin.

Giriş

Ne zaman B hücreleri bağlamak polarize diziler antijenleri (antijen sunan yüzeyinin üzerinde görüntülenenörneğin, hücreleri (ZPT)), ilk bir klasik bağışıklık synapse yapısı oluşumu açıklanan sürücüler sinyal elde edilen B hücre reseptörü (BCR) T hücreleri1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Başlangıçta, microclusters antijen-bağlı BCRs formun B hücre: APC iletişim site çevre. Bu microclusters sonra nerede bağışıklık synapse özünü oluşturan bir merkez supramolecular etkinleştirme küme (cSMAC) birleşim antijen iletişim site merkezine doğru hareket ettirin. Bağışıklık synapse oluşumu BCR sinyal en iyi duruma getirir ve BCR aracılık antijen APC membran14çıkarma kolaylaştırır. BCR aracılık antijen içselleştirilmesi ve sonraki antijen işleme takip eder, bu antijen satın alma B hücreleri peptid: MHC II kompleksleri T hücreleri için mevcut ve T hücre yardım14temin için sağlar. B hücre aktivasyonu, reseptör organizasyon bu fonksiyonel model yeni sağlayabilir kurmak mekanizmaları elucidating bağışıklık synapse oluşumu teşvik çünkü nasıl humoral bağışıklık yanıtı anlayışlar başlatılan ve düzenlenir.

Yeniden düzenleme-in belgili tanımlık aktin ve Mikrotubul cytoskeletons bağışıklık synapse oluşumu için önemlidir. Yerelleştirilmiş BCR antijenleri dağınık şekilde polarize dizisi tarafından uyarılan sinyal hızlı ve dramatik aktin sitoiskeleti1,15remodeling neden olmaktadır. B hücresi çevre dendritik aktin yapıların oluşumu plazma zarı itme Kuvvetleri giderek artan ve B hücre yayılmasını teşvik etmektedir. Bu hücre B antijeni taşıyan yüzeyinde daha büyük bir alanı taramak izin verir ve antijen bağlamak ve yolları sinyal BCR etkinleştirmek BCRs sayısını artırır. Aynı zamanda, MTOC ve Mikrotubul ağ antijen iletişim site doğru reoriented. MTOC antijen iletişim site yaklaşırken, MTOC yayılan mikrotübüller plazma zarı B hücresi antijen taşıyıcı yüzey16,17arasındaki arabirimi, iç yüzü boyunca uzanır. Bu juxtamembrane mikrotübüller sonra parça dinein aracılı merkezcil hareketinin önde gelen bir cSMAC oluşumu için antijen-bağlı BCR microclusters18, için kullanılabilir.

Hale gelmesini ve MTOC karşı bağışıklık synapse kutuplaşma olduğu gibi aktin ve Mikrotubul cytoskeletons gerektirir ve genellikle kortikal aktin ağ ve mikrotübüller16,17arasındaki etkileşimler bağlıdır, 19,20. Kortikal aktin bağlanıcı proteinler, IQGAP1 gibi mikrotübüller Mikrotubul artı-uçları21süslemeleri protein kompleksleri ile etkileşerek yakalayabilirsiniz. Artı uç proteinler dinamik bu komplekslerin EB1 ve CLIP-170, topluca Mikrotubul artı izleme proteinler (+ ipuçları)21,22uç denir içerir. + İpuçları mikrotübüller ucunda plazma zarı veya kortikal aktin sitoiskeleti ile ilişkili proteinler bağlayabilirsiniz. Bu güç üreten mekanizmalar sağlar (örneğin, eksi uç yönetmen cortically bağlantılı dinein mikrotübüller boyunca hareketi) çekme kuvvetleri mikrotübüller uygulamak ve böylece MTOC yeniden konumlandırmak için. KLİP-170 iskele aktin ilişkili protein IQGAP123bağlayabilirsiniz ve her ikisi de bu proteinler BCR kaynaklı MTOC polarizasyon bağışıklık synapse17doğru için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu IQGAP1-klip-170 etkileşim B-hücre bağışıklık synapse Mikrotubul ağ konumlandırma ile aktin sitoiskeleti remodeling yönetiminde önemli bir rol oynayabilir.

Geleneksel floresan mikroskopi aktin ve Mikrotubul cytoskeletons dramatik düzenlenmesi B-hücre bağışıklık synapse oluşumu2sırasında ortaya koymuştur. Ancak, bu yaklaşım küçük Hücresel yapıları ayrıntılı ışık, Abbe'nın yasasına göre örnek ve objektif24diyafram aydınlatmak için kullanılan ışığın dalga boyu üzerinde bağlıdır kırınım sınırı nedeniyle çözümlenemiyor. Bu kırınım sınırı 200-300 nm yanal yönde ve eksenel yönde25500-700 nm konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlüğü sınırlar. Bu nedenle, küçük hücre altı yapıları gibi aktin ve Mikrotubul cytoskeletons ince detaylar sadece gözlenen elektron mikroskobu kullanarak. Elektron mikroskobu görüntüleme sitoiskeleti zaman alıcıdır, biyolojik yapıları değiştirebilir ve antikor aracılıklı algılama için sınırlıdır sert örnek fiksasyon ve hazırlık protokolleri gerektirir. İmmunostain ve aynı anda birden fazla protein görüntü veya hücresel yapılar Floresans mikroskobu önemli bir avantajı olduğunu. Ayrıca, floresan füzyon protein hücrelerdeki ifade gerçek zamanlı görüntüleme sağlar ve etkili antikorlar immunostaining protein ilgi için kullanılabilir olduğunda yararlıdır.

Süper çözünürlük mikroskobu son teknolojik gelişmeler ışığın kırınım sınırları aşmak ve Nano hücresel yapılar24görselleştirme izin. Bir tür süper çözünürlük mikroskobu teknik uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi denir. STED iki lazerler, nerede bir lazer fluorophore heyecanlandıran ve ikinci bir lazer ile bir çörek-şekilli desen seçici Floresans emisyon fluorophore çevresinde bastırır kullanır. Bu tek bir floresan parçacık noktası yayıldı fonksiyonu (açık alan) azaltır ve bir alt kırınım sınırı floresan görüntü25,26sağlar. Zemin-devlet tükenmesi mikroskobu da süper çözünürlük görüntüleri Floresans tabanlı teknikleri kullanır. Ancak, görüntü alma ve yeniden yapılanma kez uzun, orada sınırlı sayıda kullanılabilir fluorophores ve birden çok hücre iskeleti bileşenlerinin aynı anda yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknik bakımı çünkü meydan okuyor aktin ve Mikrotubul yapıları farklı fiksasyon yordamlar gerektirir. Bu nedenle, STED elektron mikroskobu üzerinde birden çok avantajları vardır ve hızlı resim alma sunar, en az son işlemci gereksinimleri vardır ve aynı fluorophores ve teknikleri boyama istihdam diğer süper çözünürlük mikroskobu yaklaşımlar Bu sabit örnekleri26geleneksel floresan mikroskopi için kullanılır.

Süper çözünürlük mikroskobu aktin yapıları bağışıklık synapse doğal öldürücü (NK) hücreleri ve T hücreleri26,27,28,29,30, , görselleştirmek için artık kullanılmıştır 31. ancak, süper kararlılık düşsel mikrotubul sitoiskeleti in yanı sıra, aktin ve Mikrotubul cytoskeletons koordineli düzenlenmesi sırasında bağışıklık synapse oluşumu, ancak son zamanlarda bildirilen17olmuştur. Anti-immünglobulin BCR sinyal teşvik ve sitoiskeleti reorganizasyon başlatmak (anti-IG) antikor kaplı coverslips yaymak için izin vermişti resim B hücreleri STED mikroskobu yapardık. Ne zaman üzerinde immobilize anti-IG antikorlar kaplama, B hücreleri dramatik aktin bağımlı yayma, hangi bağışıklık synapse oluşumu sırasında ilk olaylar beyannamedir tabi. Önemlisi, STED mikroskobu F-aktin bağışıklık çevre formları sinaps ve MTOC yanı sıra, bağlı mikrotübüller yakın antijen iletişim site17hareket ettiğini gösterdi dendritik yüzük ince detayları ortaya koydu. Bu mikrotübüller dışa F-aktin periferik halka doğru genişletilmiş. Ayrıca, F-aktin, tübülin, IQGAP1 ve GFP tagged klip-170 + ipuçları çeşitli kombinasyonları çok renkli STED görüntüleme Mikrotubul artı klip-170-GFP tarafından işaretlenmiş uçları ile IQGAP1, periferik aktin meshwork ile yakından ilişkili olduğunu gösterdi bir kortikal yakalama protein17.

Burada, aktin ve Mikrotubul cytoskeletons STED mikroskobu kullanarak bağışıklık sinaps, görüntüleme için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntemler yaygın BCR sinyal ve bağışıklık synapse oluşumu17,32,33,34,35 eğitim için istihdam edilmiştir A20 fare B hücre satırı kullanarak optimize edilmiştir , 36 , 37 , 38 , 39. ticari karşı antikorlar için klip-170 immunostaining önceki deneylerde için de işe yaramadı çünkü biz ifade GFP tagged klip-170 kadar aynı anda görüntülenmesi için protokol boyama ile birlikte A20 hücre içinde ayrıntılı olarak tarif üç hücre iskeleti bileşenleri veya sitoiskeleti ilişkili proteinler. NK hücre bağışıklık sinapslarda STED mikroskobu Image aktin için kullanma yöntemleri-si olmak be daha önce açıklanan40. Biz bu uzatmak B hücreleri aktin ve Mikrotubul cytoskeletons çok renkli süper çözünürlük görüntüleri elde etmek.

Süper çözünürlük mikroskopi için kritik bir dikkate uygun fiksasyon yordamlar hücresel yapıların Bakımı ve floresan proteinler için hasar önleme kullanıyor. Fiksasyon ve burada sunulan yöntemleri boyama GFP Floresans korumak ve aktin ve Mikrotubul ağların yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlamak için optimize edilmiştir. Floresan proteinler ifade edilirken, B hücreleri transfect genellikle zor olduğu unutulmamalıdır. Bu iletişim kuralı, 20-%50 kullanarak A20 hücre genellikle transfected GFP füzyon protein hızlı, ve bu halk arasında protein ifadesi düzeyi değişken. Bununla birlikte, süper kararlılık düşsel aktin ve biz tarif yordamları kullanarak mikrotübüller oldukça sağlam ve yüksek-nitelik imge kolayca elde edilir. A20 hücre göre küçük boyutlarına rağmen bu yordamları da kısaca lipopolysaccharide (LPS) ile aktive edilmiş birincil B hücreleri Mikrotubul şebekede görüntüye kullanılabileceğini göstermektedir. LPS-harekete geçirmek birincil B hücreleri ile çift (Yani, böyle protein tükenmesi immunoblotting tarafından tespit edilebilir), nispeten yüksek verimlilikle transfected göstermiştir onları B hücre hatları kullanımı için bazı çalışmalar için iyi bir alternatif yapmak 17.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan yordamları University of British Columbia hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. A20 B-Lenfoma hücreleri GFP-füzyon proteinler ifade

  1. Kültür A20 hücre doku kültürü kuluçka 5 37 ° C'de RPMI orta (RPMI-1640 % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvate, 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş) tamamlamak % CO2.
  2. Transfection reaktif hazırlamak ( Tablo reçetesigörmek) üretici yönergelerine göre.
    Not: Bu protokol için belirli reaktifler getirilmiş ve transfection Protokolü açıklanan Tablo reçetesi. Biz-si olmak güvenilir diğer transfection reaktifler yeterli transfection verimliliği vermiştir değil.
  3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Santrifüj 2.5 x 106 A20 hücreleri (her transfection için) x 525 g., 5 min için 100 µL transfection reaktif 1-2,5 µg, plazmid DNA içeren hücrelerde Resuspend. KLİP-170-GFP23kodlama DNA örneği almak için transfection başına 2,5 µg kullanın. Hafifçe karıştırın.
  4. 6-şey plaka bir kuyu için hücreleri aktarmak ve Önceden ısıtılmış tam RPMI orta ile 2 ml ses seviyesini. 18 h 37 ° C'de protein ifade izin vermek için hücreleri kültür.

2. birincil fare B hücreleri izole edip onları LPS ile aktive

  1. Kurumun hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri takip bir fareden dalak silmek için steril cerrahi araçlarını kullanın.
  2. Doku kültürü başlık, bir steril 70 µm hücre süzgeç 3 mL steril oda sıcaklığında PBS içeren bir 35 mm doku kültürü tabak yerleştirin. Dalak hücre süzgeç aracılığıyla ezmek için 5 ml şırıngadan pistonu kauçuk parçası kullanın.
  3. Damlalıklı splenoctyes steril 15 mL tüp ve 5 min için 525 x g, santrifüj içine tek hücre süspansiyon.
  4. Manyetik boncuk tabanlı B hücre izolasyon Kiti ( Tablo malzemelerigörmek) B hücreleri zenginleştirilmiş nüfusu elde etmek için kullanın.
  5. 3 x 106/mL 2,5 µg/mL LPS artı 5 ng/mL B faktörü (BAFF; bir hayatta kalma sitokin) aktive hücre ile desteklenmiş tam RPMI ortamda B hücrelere resuspend.
  6. İçin 6 saat 37 ° C'de hücreler kültür

3. kaplama cam Coverslips Anti-IG antikorlar ile

  1. Antikor çözüm coverslips kaplama için hazırlayın. Keçi-anti-fare IG antikorlar içine oda sıcaklığında steril PBS 12.5 µg/mL solüsyon yapmak için hisse senedi çözüm seyreltik; Antikor çözüm 400 µL her coverslip için gereklidir.
    Not: keçi Anti-IgG A20 hücre için fare; keçi Anti-fare IgM birincil B hücreleri için kullanın. Keçi IgG antikorlar de fare Fc reseptör bağlamak etmeyin. Ancak, herhangi bir potansiyel Fc reseptör bağlama önlemek için bir anti-fare IgG F(ab) veya F(ab')2 parçaları veya anti-fare IgM antikor kullanabilirsiniz.
  2. #1.5 18 mm yuvarlak cam coverslip % 100 metanol içinde daldırma ve kurumasını bekleyin (~ 10 dk).
  3. Coverslip ortasındaki bir kabarcık oluşturur ve kenarlar'yayılır forseps kullanarak, kurutulmuş coverslip çözümün 12.5 µg/mL antikor (5 µg Toplam; 2 µg/cm2) coverslip üzerine 12-iyi doku kültürü plaka ve damlalıklı 400 µL içine yerleştirin.
  4. Tüm coverslip karşılamak dikkatli olun, ama geçmiş kenarına cam coverslip ve doku kültürü plastik üzerine genişletmek antikor çözüm izin vermez. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Coverslips steril PBS tarafından pipetting 1 mL de ve daha sonra çözüm alıyorum içine yıkayın. İlişkisiz antikorlar kaldırmak için iki kez daha tekrarlayın.
  6. 1 mL steril PBS hücreleri eklemek hazır olana de antikor kaplı coverslip içeren için ekleyin.
    Not: Aynı gün kullanmak için PBS ile kaplı oda sıcaklığında coverslips tutulabilir.

4. B hücre Coverslips Anti-IG-kaplı Yayilim

  1. Hazırlamak HEPES tampon modifiye serum fizyolojik (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7.2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, 1 mg/mL dekstroz, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 µM 2-mercaptoethanol). Filtre bu çözüm sterilize ve 4 ° C'de depolayın
  2. Deneme günü, mHBS % 2 ile 50 mL olun FBS ısı inaktive 1 mL 50 mL mHBS ekleyerek FBS (mHBS-FBS). MHBS-FBS kullanmadan önce 37 ° c sıcak.
  3. Transfected A20 hücre veya BAFF artı LPS-var kültürlü 525 x g 5 min için de birincil B hücreleri santrifüj kapasitesi.
  4. 1 mL mHBS-FBS hücrelerde resuspend, bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 x 105 hücre/mL mHBS-FBS hücrelere oranında seyreltin.
  5. Forseps kullanarak, coverslip parafin film bir parça için doku kültürü plaka aktarın.
  6. B hücreleri (5 x 104 hücreleri) 250 µL her coverslip için ekleyin.
  7. B hücreleri anti-IgG-boyalı yüzeye yaymak için izin vermek için karanlıkta 15 dakika 37 ° C'de coverslips kuluçkaya.

5. sabitleme ve Immunostaining hücreleri

  1. % 16 paraformaldehyde hisse senedi çözüm sulandrarak tarafından fiksasyon çözüm ve % 50 oxazolidin hisse senedi çözüm oda sıcaklığında distile su son %3 paraformaldehyde ve % 0.1 oxazolidin konsantrasyonları verim için hazır olun. Fiksasyon çözüm kullanılabilir ve herhangi bir aşırı atmak için o gün hazırlayın.
    Dikkat: Paraformaldehyde ve oxazolidin hisse senedi çözümleri yalnızca bir kimyasal duman mahallede kullanılmalıdır. Malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) üzerinde yönergelere bakın.
  2. Permeabilization/engelleme arabellek hazırlamak (% 3 BSA ve % 0.1 Triton X-100 seyreltilmiş PBS içinde). Filtre bu çözüm sterilize ve 4 ° C'de depolayın Deneme günü, oda sıcaklığında için gerekli miktar sıcak.
  3. Boyama arabellek (%1 BSA ve % 0.1 saponin PBS içinde) hazırlayın. 0.2 µm filtre kullanarak bu çözüm sterilize ve 4 ° C'de depolayın Deneme günü, oda sıcaklığında için gerekli miktar sıcak.
  4. Damlalıklı 350 µL fiksasyon çözüm yüzey tamamen kaplıdır sağlanması her coverslip üzerine. 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Fiksasyon çözüm coverslip dikkatle alıyorum bir micropipet kullanarak coverslip kenarından tarafından kaldırın.
    Dikkat: Fiksasyon çözüm tehlikeli kimyasal atık atılmalıdır.
  6. Coverslips permeabilization/engelleme arabelleği 500 µL hemen ile yıkayın. Damlalıklı sıvı kapalı.
  7. Permeabilize ve her coverslip için 250 µL permeabilization/engelleme arabelleği ekleyerek ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçka hücreleri engellemek.
  8. Arabellek boyama, tavşan Anti-tübülin antikor 1: 100 oranında seyreltin.
  9. Coverslips permeabilization/engelleme arabelleğinden kapalı Aspire edin ve her coverslip için 50 µL seyreltilmiş Anti-tübülin antikor çözüm ekleyin. 30 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
  10. İkincil antikor/aktin leke çözüm Alexa Fluor 532 Birleşik keçi Anti-tavşan IgG ikincil antikor ve tampon boyama içinde Alexa Fluor 568-Birleşik phalloidin 1: 100 sulandrarak hazırlayın.
  11. Coverslips arabellek boyama ve sonra aspirating 500 µL ekleyerek aşırı birincil antikor kaldırmak için 3 kez yıkayın.
  12. Her coverslip için 50 µL ikincil antikor/aktin leke çözüm ekleyin ve karanlık oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  13. Coverslips arabellek boyama ve sonra aspirating 500 µL ekleyerek aşırı ikincil antikor kaldırmak için 3 kez yıkayın.
  14. Montaj reaktif 10 µL mikroskop slayda ekleyin. Aşağı coverslip hücre tarafı ile mikroskop slayda bağlayın.
    Not: Bir "Anti-fade" montaj orta ( Tablo malzemelerigörmek) GFP füzyon protein floresan yoğunluğu korumak için önerilir. Fluorophores görüntüleme ile STED lazer kullanırken engelleyebilir DAPI içeren reaktifler montaj kaçının.
  15. Kuru gecede slaytlara karanlıkta izin. Slaytları ertesi gün görüntü.
    Not: GFP Floresans zamanla azalacak gibi coverslip kuru olduğunda slaytları Imaging, önerilir.

6. STED mikroskop kullanarak görüntüleme

Not: Lütfen aşağıda açıklanan tüm yazılım adımları biz kullanılan yazılım ve mikroskop belirli olduğuna dikkat edin (bkz. Tablo malzeme). Adımları ve ayarları farklı bir mikroskop/yazılım kullanarak görüntüleme gerçekleştirdiyseniz ayarlanması gerekir.

  1. STED mikroskobunun açın, lazerler ve epifluorescence aydınlatma lambası etkinleştirmek ve belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı başlatın.
  2. STED tükenmesi lazerler için parametrelerini ayarlamak.
    Not: Bu kullanılan belirli mikroskop ve ile donatılmış lazerler göre değişir. Önerilen bazı ayarlarıdır beyaz ışık (WLL) % 70; 592 nm lazer % 80; 660 nm lazer %80.
  3. STED ayarlarını etkinleştirin ve 100 X amacı istimal STED lazer ışınları hizalayın.
  4. Mercek kullanarak örnek odaklanmak ve ılımlı GFP ifade içeren bir hücreyi seçin.
    Not: STED emisyon yoğunluğu azalttığı düşük GFP ifade görünür olmaz. Diğer taraftan, klip-170-GFP yüksek ifade büyük kümeler, normal Mikrotubul artı uç protein kompleksi morfoloji ve dağıtım yansıtmaz kendiliğinden oluşumu neden olmaktadır. Orta GFP ifade içeren bir hücreyi seçerek doğru antijen iletişim site, hücre iskeleti yapıları görüntüleme için esastır.
  5. Seçili hücreye zoom ve yansıması ilgi bölge seçin. Coverslip için en yakın olan B hücresi x-y düzlemi odakta odak ayarlamak.
    1. B hücre hücre iskeleti yapıları odak haline gelir ve sonra odak dışında gider bunu yapmak için hedefi giderek daha yakın coverslip için taşıyın. B hücre hücre iskeleti yapıları ilk odak haline gelene sonra yavaş yavaş amacı ters yönde hareket.
  6. Lazer güç, uyarma kiriş ve Dedektör aralığı da dahil olmak üzere ayarları optimize etmek. Üreticinin yönergelerini tarafından önerilen ayarlarla başlatın. Ardından sinyal örnekleri için en iyi duruma getirmek için gerekli ayarlamaları yapın. Birbirlerine aynı ayarlara sahip karşılaştırılmak üzere tüm örneklerini görüntü.
  7. Yazılım "elde" sekmesi altında resim alma sıralı çerçeve kazanım alt sol panelinde "sıralı tarama" için seçenek "Çerçeveler arasında" kontrol ederek ayarlayın.
  8. Satın alma sırası oluşturun.
    Not: Biz GFP Floresans ilk GFP sinyal bozulması önlemek için elde.
    GFP ek olarak kullanılan fluorophores birlikte bağlı olarak, daha uzun dalga boyu Floresans sinyal görüntüleme ilk daha iyi sonuçlar verebilir. Ancak, hangi fluorophores veya floresan proteinler uyarılmış emisyonu tükenmesi için tabi ve yansıma sipariş en güçlü floresan sinyallerini ve en iyi çözünürlük elde etmek için optimize edilmelidir.
  9. Seçin ve yazılımın "Ele geçirme" sekmesi altında her fluorophore STED lazer güç ayarla ve lazer güç ayarlamak için 592-nm ve 660 nm STED lazer için kaydırma çubuğunu kullanın. 592-nm tükenmesi lazer için güç GFP ve Alexa Fluor 532 ayarlayın. 660-nm tükenmesi lazer için güç Alexa Fluor 568 için ayarlayın.
  10. Çözünürlüğünü artırmak ve arka plan sinyal azaltmak için yazılım "Ele geçirme" sekmesi altında "Satın alma" ayarlarına gidin, satır ve/veya damla-aşağı yemek listesi için her seçeneğini kullanarak 1'den büyük bir değer seçerek ortalama çerçeve artırmak.
  11. Ayrıca, fluorophore "Ele geçirme" sekmesi altında gating seçeneğini kontrol ve zaman geçişi için değerler belirterek zaman Geçitli STED kullanarak floresan sinyali elde etmek (aşağıdaki nota bakın). Bu da fluorophores photobleaching artacak rağmen çözünürlük artırmak için STED lazer gücünü arttırın.
    Not: Gating zaman mikroskop, örnek ve kullanılan fluorophores için optimize edilmiş olması gerekir. Bir zaman 0,3 ns tavsiye edilir 6 toplam geçişi. Fiksasyon sonra GFP yüksek lazer gücü özellikle duyarlıdır. GFP photobleaching azaltmak için zaman geçişi uygulanmalıdır ve STED lazer güç azaltılmalıdır.
  12. 3D STED çekim, bir noktayı değiştirmek için kaydırıcıyı kullanın işlev (PSF) "için 3D STED" yayıldı.
  13. El ile yeniden üretilebilirlik sağlamak için birden çok görüntüyü elde etmek. (Bkz: şekil 1) görüntüleri deconvolve deconvolution yazılımını kullanarak paket41( Tablo malzemelerigörmek).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

B hücreleri için immobilize anti-IG üzerinde yayılan STED mikroskopi deconvolution yazılımı ile birlikte kullanılan hücre iskeleti yapıları daha yüksek çözünürlük görüntüleri confocal mikroskobu daha sağlar. Bu, şekil 1' de, belirgindir F-aktin ağ yukarıda açıklanan protokolü kullanılarak görüntülenir yerde. Confocal karşılaştırılması ve STED süper çözünürlük fotoğraf aynı örnek daha yüksek çözünürlüğe STED görüntülerdir gösterir ve daha ayrıntılı aktin sitoi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hücre iskeleti yapıların detaylı görüntü elde teorik olarak 50 bir çözünürlük elde edebilirsiniz STED süper çözünürlük mikroskobu kullanılarak nm kırınım-sınırlı çözünürlük ~ 200 olduğu geleneksel confocal mikroskopi için karşılaştırıldığında, nm 24. ince yapıları gidermek yeteneği daha da gözlenen "bulanık" floresan sinyal özgün ışık kaynağından en olası konumunu hesaplamak için deconvolution yazılım kullanarak geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı STED sitoiskeleti ilişkili proteinler yanı sıra a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

UBC Yaşam Bilimleri Enstitüsü (LSI) görüntüleme tesis STED mikroskop ve desteklenmesi için teşekkür ediyoruz. Bu eser hibe #68865 Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri (için M.R.G.) tarafından finanse edildi. Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Üniversitesi, Nagoya, Japonya) klip-170-GFP plazmid için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü
A20 fare B-lenfoma hücreleriATCCTIB-208Yüzeyinde IgG içeren bir BCR eksprese eden Balb/c kökenli Murin B hücreli lenfoma
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific  R0883
Fetal sığır serumuThermo Fisher Scientific1248302030 dakika boyunca 56 oC'de ısı inaktive
2-merkaptoetanolMillipore SigmaM3148
GlutaminMillipore SigmaG5763
Sodyum piruvatMillipore SigmaP5280
Penisilin-StreptomisinTermo Fisher Bilimsel15140122Sıvı, 10.000 birim
< güçlü > birincil B hücreleri için ek malzemeler< / güçlü >
70 -&mikro; m hücre süzgeciCorning352350
Manyetik boncuk tabanlı B hücresi izolasyon kitiKök Hücre Teknolojileri19854EasySep Fare B hücresi İzolasyon kiti
Lipopolisakkarit (LPS)Millipore SigmaL4391E. coli 0111:B4
B hücre aktive edici faktörden (BAFF) LPS& D Systems2106-BF-010
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Transfeksiyon
Plazmid kodlaması CLIP-170-GFPDr. Kozo Kaibuchi'den Hediye (Nagoya Univ., Nagoya, Japonya); Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Önerilen transfeksiyon reaktifleri ve ekipmanı
Amaxa Nükleofektomi kiti VLonzaVCA-1003'teTransfeksiyon reaktiflerini DNA ile karıştırmak için üreticinin talimatlarını izleyin
Amaxa Nükleofektör modeli 2bLonzaAAB-1001Kullanılan L-013 programı
Falcon 6 oyuklu plakalar, TC işlenmiş, sterilCorning353046
İsimgüçlü><ŞirketKatalog NumarasıYorumlar
Kaplama lameller
18 mm çaplı yuvarlak # 1.5 kapak camlarıThomas Bilimsel1217N81Benzer ürün: Marienfield-Superior katalog #117580
ForsepsFisher Scientific1381242Diseksiyon ekstra ince kıymık forseps
Falcon 12 kuyulu steril doku polistiren doku kültürü plakasıCorning353043
%100 metanolFisher ScientificA412-4
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen steril fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Keçi-anti-fare IgG antikoruJackson ImmunoResearch115-005-008A20 hücreleri için
Keçi-anti-fare IgM antikoruJackson ImmunoResearch115-005-020Birincil fare B hücreleri için
NameCompanyKatalog Numarası Yorumlar< / güçlü >
< güçlü > Boyama< / güçlü >
Paraformaldehit (% 16 stok çözeltisi)Elektron Mikroskobu Bilimleri15710PBS ile çalışma konsantrasyonuna seyreltin
Gluteraldehit (% 50 stok çözeltisi)Millipore Sigma340855PBS ile çalışma konsantrasyonuna seyreltin
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinMillipore SigmaS2149
Sığır serum albümini (BSA), Fraksiyon VMillipore Sigma10735094001
Tavşan anti-tubulin antikoruAbcamab528661:250 seyreltme önerilir ancak optimize edilmelidir
Alexa Fluor 532-konjuge keçi anti-tavşan IgGThermo Fisher ScientificA110091:100 seyreltme önerilir ancak optimize edilmelidir
Alexa Fluor 568-konjuge falloidinThermo Fisher ScientificA123801:100 seyreltme önerilir ancak optimize edilmelidir
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970DAPI
Olmadan Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları FisherScientific12-550-15
İsimCompanyKatalog NumarasıComments
Materials
ParafilmVWR P1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DekstrozFisher ScientificD16-500
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED mikroskopLeica
Huygens evrişim yazılımıBilimsel Voume GörüntülemeBkz. https://svi.nl/HuygensProducts
edin , R açıklanmıştır güçlü

Kaynaklar

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311(2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873(2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290(2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586(2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aktinle skeletiMikrot b l skeletiskeletsel Yeniden D zenlenmemm n Sinaps Olu umuGFP Etiketli ProteinlerH cre Yay l m ProtokolG r nt Dekonvol syonuFloresan F zyon Proteinleri

İlgili makaleler