Method Article

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

DOI:

10.3791/57065

⸱

February 16th, 2018

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia, beyin, yerleşik bağışıklık hücreleri iltihap veya Merkezi sinir sistemine yaralanmaya ilk yardım ekipleri vardır. Son araştırma dinamik, pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar fenotipleri varsayarak kabil olmak microglia ortaya koymuştur. Hem (pro-inflamatuar) M1 ve M2 (pro-onarıcı) fenotipleri oyun neuroinflammatory koşulları perinatal beyin hasarı ve sergi farklı gibi önemli bir rol belirli çevresel uyaranlara yanıt olarak işlev görür. Mikroglial harekete geçirmek modülasyon böylece microglia tedavi edici potansiyeli beyin hasarı olabilir düşündüren neuroprotection görüşmek için Not edildi. Ancak, daha fazla araştırma microglia hastalığında rolünün daha iyi anlamak için gereklidir ve bu iletişim kuralı bu kolaylaştırır. Protokol altında birleştiren son derece saf bir örnek içinde vitro deneyler için olmadan kullanılabilir birincil mikroglial hücre üreten manyetik ayırma ile hücresel enkaz azaltmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü işlemi açıklanmıştır. 2-3 hafta kültür gerek. Ayrıca, karakterizasyonu adımları rejeneratif tıp alanında güçlü etkileri vardır polarizasyon anlayışımızı geliştirmek için çalışmalar yardım ve bu hücrelerin priming microglia hakkında sağlam işlevsel veri verim.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnflamasyon, hipoksik iskemisi ve kanaması perinatal dönemde edinilen hasar uzun vadeli sekel bir dizi olabilir. Perinatal beyin hasarı karmaşık Patofizyoloji inflamasyon ve ardından gelen nöronal ve aksonal ölüm1iskemi dahil etmek teorisini. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı olaylar yaralanma2' ye çağlayan önemli bir rol oynar.

Microglia, merkezi sinir sistemi (MSS), içinde yerleşik bağışıklık hücreleri yaralanma3ilk yardım ekipleri vardır. Microglia plastik hücre türü kapasiteli çevre4koruyucu veya toksik, bağımlı olmak vardır. Onlar Kemotaksis,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki yordamlar Monash Üniversitesi'nde hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması. Sağlıklı tedavi edilmezse kardiyolojik C57Bl6/J P3-6 fareler temsilcisi sonuçları oluşturmak için kullanılan.

1. Enzimatik sindirim

Not: Yalıtma ve Primer hücre kültürü çalışmalarının kısırlık dikkate almak önemlidir. Çevre olarak steril olduğunu kontrol ettikten iken ilk diseksiyon ve fare beyni hasat laminal akışı başlık dışında bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar ile tamamlanabilir.

  1. Steril aletler kullanarak, fare tarafından servikal çıkığı ötenazi, hayvan başını kesmek ve % ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, saf microglia nüfusa ayrılmış olabilir ve vitro ve FACS çözümlemesi kullanarak karakterizasyonu için hazır olabilir. İlk olarak, kadar 18 hayvan itlaf, beklenen bir verim yaklaşık 450.000-600.000 mikroglial hücre ile başına kullanılabilir. İlk izole hücreler saflığı onaylamak çok önemlidir ve microglia tarafından ifade edilen birçok işaretleri de tarafından ifade edilir gibi FACS analiz için iki işaretleri CD45 ve CD11b. microglia tanımlama.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia çevre uyaranlara tarafından değiştirilmiş hem pro - ve anti-inflamatuar, yeteneği vardır. Önceki çalışmalar microglia harekete geçirmek modülasyon neuroprotection görüşmek göstermiştir. Yeteneklerini nöronlar koruma sağlamak ve hasarı onarmak için bu karmaşık hücrelerin geçerli anlayışı ilerletmek için daha fazla araştırma gerektirir. Böylece, yüksek saflıkta birincil microglia işlemleri olan bir önemli ve yararlı bir tekniktir. Bu son derece saf birincil microglia 2 gün içinde vitro deneyler için hazı.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, düşük glikoz, piruvatGibco11885084
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Gibco15240062
DNaseSığır pankreasından derece IISigma-Aldrich10104159001
Papain, tamponlu aqeuous solüsyonuSigma-AldrichP3125-100mg
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısıyla inaktive edilmişGibco16140071
PercollGE Sağlık17-0891-01
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (1X)Gibco14175-103
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (10X)Gibco14185052
EasySep Fare CD11b Pozitif Seçim KitiKök Hücre Teknolojileri18770EasySep mıknatıs varyantı
EasySep mıknatısKök Hücre Teknolojileri18000
EasySep TamponKök Hücre Teknolojileri20144
Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salinGibco14040182
Tripsin (%2,5) (10X)Gibco15090-046
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32 (Fare BD Fc Blok ve ticaret;)BD Biosciences 553141
Falcon 5mL Yuvarlak Alt Yüksek Berraklık PP Test Tüpü, Çıtçıtlı Kapaklı, SterilCorning352063
175cm² Havalandırma Kapaklı Açılı Boyun Hücre Kültürü ŞişesiCorning431080
Escherichia coli O127:B8'den lipopolisakkaritlerSigma-AldrichL5024
96 Kuyulu TC ile İşlem Görmüş Mikroplakalar boyutu 96 kuyulu, şeffaf, polistiren, yuvarlak tabanlıCorningCLS3799
Paraformaldehit (toz, %95)Sigma-Aldrich158127
Triton-XSigma-AldrichX100
Tavşan Anti-Iba1Wako01919741 
Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS AntikorlarıCompanyKatalog Numarası
V450,Sıçan,Anti-Fare,CD45,30-F11,RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Kırmızı E. coli BioParticles KonjugeThermo Fisher ScientificP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
Propodium İyodür çözeltisiMiltenyi Biotech130-093-233
Papaya lateksten

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia IsolationDensity Gradient CentrifugationMagnetic SeparationPrimary MicrogliaPercoll GradientCell CountingTrypan Blue StainingCD11b LabelingHemocytometer AnalysisPercoll Layering

Related Articles