Bu yazıda biz üretim yöntemleri ve bir IL4-10 rekombinant füzyon protein kalite kontrolü için ayrıntıları sağlar. Biz de bir fare modeli enflamatuar ağrı ağrı gidermek için bu proteinin etkinliğini test etmek nasıl göstereceğim.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kronik ağrı tedavisinde rekombinant proteinler gelişimi
Bu makalede
Özet
Özet
Kronik ağrı tedavi etmek zordur ve inatçı ağrı gidermek için yeni yaklaşımlar acilen ihtiyaç vardır. Anti-inflamatuar sitokinlerin zayıflatıcı acı koşulları nedeniyle kapasitelerini anormal nöro-bağışıklık etkileşimleri düzenleyen tedavisinde umut verici adaylar bulunmaktadır. Ancak, fizyolojik bir ağda çeşitli sitokinlerin çalışır ve bu nedenle onların tedavi edici etkiye tek başına ilaç olarak kullanıldığında en uygun olmayabilir. Bu sınırlamayı aşmak için IL4 ve IL10 anti-inflamatuar sitokinlerin bir füzyon protein geliştirdi. Burada, üretim ve kalite kontrol IL4-10 rekombinant füzyon proteinin yönelik yöntemler tanımlamak ve bir fare modeli inatçı enflamatuar ağrı ağrı gidermek için IL4-10 füzyon protein etkinliğini test.
Giriş
Kronik ağrı en 21, zayıflatıcı ve altında tedavi tıbbi problemlerden biri kalır etkileyen > yetişkin nüfusun1,%220'si. Ancak, kronik ağrı yardım sağlamak için Tedaviler çoğu kez etkisiz veya ciddi yan etkileri3nedeniyle devam etmemek gerekir. Önemli, şu anda kullanılabilir ilaçlar sadece semptomatik rahatlama sağlamak ama değil önemli ölçüde değiştirmek ya da kronik ağrı tedavi. Kronik ağrı bir nörolojik bozukluk gibi görünmesine karşın, kronik ağrı geliştirme4,5bağışıklık sisteminde katılımı kanıtlar gösteriyor. Ayrıca, ağrı te....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri önceden onay yerel deneysel Etik Komitesi ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tam kan, Üniversitesi Tıp Merkezi Utrecht (UMCU) Hollanda Mini donör hizmetinden (Mini donör Dienst, MDD) elde edildi. MDD Protokolü sayı 07-125/c için UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) tıbbi etik Komitesi olumlu onay aldı
1. protein üretimi ve karakterizasyonu
- Hücre kültürü
Not: Kültür orta kullanılan Malzemeler tablo bakın.- Buz küçük bir yığın olana HEK293-F hücreleri 37 ° C'de erimek. Çözdürülen hücreleri hemen buz gibi orta (4 ° C) için 10 mL aktarmak ve h....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Farklı kesirler benzeşme Kromatografi arıtma sırasında elde edilen içeren bir SDS-sayfa jel temsili resmi şekil 1içindeAgösterilir. Yük (L) ve (FT) kesirler ile akışı tüm proteinler HEK293 süpernatant mevcut gözlenir. Hiç protein yıkama (W) kesir görülmektedir. Elüsyon (E) kesir, IL4-10 füzyon proteini (oklar) iki farklı glycoforms için karşılık gelen 35 ve 37 kDa iki grup gözlenir. Şekil 1B, tam.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu el yazması yöntemleri için üretim ve rekombinant IL4-10 füzyon protein karakterizasyonu ve kalıcı enflamatuar ağrı fare modellerinde inflamatuar hyperalgesia inhibe onun etkinliğini test etmek için yöntemler açýklanmýþtýr. Üretim ve arıtma IL4-10 füzyon proteinin küçük bir ölçekte yapılır. Prokaryotik ifade sistemlerinde elde edilemez translasyonel modifikasyonlar etkinleştirmek çünkü protein üretim için bir ifade sistemi olarak HEK293 hücreler seçilir. Translasyonel modifikasyonlar protein işlevi için uygun olan ve t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser parçası Utrecht Üniversitesi Yaşam Bilimleri tarafından finanse edilen hibe
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| FreeStyle 293-F hücreleri | Invitrogen | R790-07 | İnsan embriyonik böbrek hücreleri |
| GIBCO FreeStyle 293 Ekspresyon Ortamı | Yaşam teknolojileri | 12338018 | Kültür ortamı |
| 293fektin Reaktifi | İnvitrojen | 12347019 | Transfeksiyon reaktifi |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life teknolojileri | 51985026 | Katyonik lipid transfeksiyonları sırasında kullanım için Azaltılmış Serum Besiyeri |
| GIBCO RPMI Orta 1640 (1x) | Yaşam teknolojileri | 52400-025 | |
| CNBr-Aktif Sefaroz 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | antikorları veya diğer büyük proteinleri birleştirmek için önceden etkinleştirilmiş ortam |
| Hidroklorik asit dumanı %37 | Merck | 1003171000 | |
| Sodyum klorür | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma | 31437 | |
| Trizma hidroklorür | Sigma | T3253-500G | TRIS hidroklorür |
| Asetik Asit% 100 & nbsp; | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glisin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Eczane, UMCU | Fosfat Tamponlu Tuzlu | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | SDS elektroforezi için Tris/Glisin/SDS Tamponu |
| Mini-PROTEAN TGX Jeller | BIO-RAD | 456-1046 | %12 SDS prekast jeller |
| Trans-Blot Turbo Transfer Paketi | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer paketleri |
| Yarra 3u SEC-2000 sütunu | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | kullanıma hazır Poliakrilamid jeller için Coomassie protein lekesi |
| İnsan IL-10 DuoSet ELISA | R& D | DY217B | |
| İnsan TNF ve alfa; ELISA Seti | Diaklon | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Test Kiti | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | bitki mukopolisakkarit |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | aşı adjuvanı |
| Hamilton şırınga | Sigma-Aldrich | 20779 | cam şırınga |
| Hayvan Muhafazası | IITC Yaşam Bilimleri | 433 | Hayvan Muhafazası |
| Von Frey örgü standı | IITC Yaşam Bilimleri | 410 | Örgü Standı |
| von Frey kılları | Stoelting | 58011 | dokunma testi duyusal problar |
| Plantar Testi (Hargreaves Yöntemi) | IITC Life Science | 390G | ısıtılmış camlı plantar testi |
| Dinamik Ağırlık Yatağı testi | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postüral eksiklik testi |
| Cam Ekono-Kolon Kolonları, 1.5 > 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | cam kromatografi kolonu |
| SnakeSkin Diyaliz Tüpü | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Şırınga Filtresi | Sartorius | 16555-K | tek kullanımlık filtre ünitesi, 0.45 & mu; M |
| CASY Hücre Sayacı ve Analiz Cihazı | Roche |
Kaynaklar
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widesp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
