Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mikro-diseksiyon emaye Organ dan çene kemiğinde kesici sıçan için çevre Toxicants maruz

10.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57081

⸱

29 Mart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

Bu makalede

Özet

Emaye oluşumu ve olası değişiklikler anlamak ameloblast etkinlik çalışması gerekir. Burada, emaye organları daha fazla nicel ve nitel deneysel yordamlar için kullanılabilir salgı ve olgunlaşma sahne ameloblasts içeren mikro incelemek için güvenilir ve tutarlı bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Çevre koşulları ve yaşam kaynaklanan emaye kusurları nedeniyle onların yüksek yaygınlık kamu sağlık endişeleri vardır. Bu kusurları hücre emaye organ mevcut ameloblasts adlı emaye sentezi için sorumlu değişmiş aktivitesindeki neden. Amelogenesis sırasında ameloblasts yayılması, farklılaşma ve ölüm olayları belirli ve kesin bir dizi izleyin. Sürekli büyüyen kesici dişler bir rat ameloblast etkinliği ve farklılaşma aşamaları fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmaya uygun bir deneysel modelidir. Burada, mikro-fareler için çevre toxicants maruz emaye organı incelemek için güvenilir ve tutarlı bir yöntem açıklanmaktadır. Mikro disseke diş epiteli kantitatif analizleri gibi yanı sıra immünhistokimya deneyleri ve in situ hibridizasyon, gibi nitel deneyler için kullanılabilir salgı ve olgunlaşma sahne ameloblasts içeren RT-qPCR, RNA-seq ve Western Blot.

Giriş

Birçok gelişimsel emaye kusurları maruz çevre toxicants ve/veya uygunsuz yaşam tarzı1,2,3,4neden olabilir. Olaylar ve şu anda açıklanan yordamı kullanarak amelogenesis molekülleri karakterizasyonu elde edilen emaye kusurları kullanımı birkaç toxicants etkilenme erken işaretleyici olarak teşvik edecek ve sağlık geçmişini reconstitute için yardımcı olabilir her hastanın perinatal dönemde emaye synthetized1,2ne zaman. Ameloblast etkinlik5bağlı olarak dört ana aşamadan emaye sentez ayrılabilir. İlk adım habercisi hücre ve pre-ameloblast yayılması regroups. İkinci adımı sırasında farklılaşmış ameloblasts emaye matris proteinler (EMP'leri), esas olarak amolgenin, enamelin ve ameloblastin, son emaye kalınlığını belirleyen salgılar. Böylece, herhangi bir kesinti EMP sentezi emaye nicel hatalarına karşı yol açar. Tam emaye kalınlığı birikimi sonra olgunlaşma aşamasında başlar. Bu aşamada, apatit crystallite büyüme genişlik ve kalınlığı emaye ağırlıkça % 96'ile biyolojik bir doku buldum en yüksek Qafqaz oranına ulaşmak sağlar. Olgunlaşma aşamasında müşteri adayına sırasında ortaya çıkan nitel dağıtmak olayları kusurları emay. Son olarak, ameloblasts sonrası olgunlaşma, kemirgen, pigmentasyon olarak da adlandırılan bir aşaması girin ve emaye hataları (varsa) yapma onarılamaz ve geri dönüşü olmayan diş patlama sırasında apoptosis tabi, böylece potansiyel geriye dönük kayıt hataları sağlar ameloblast vurguluyor. Kemirgen, amelogenesis benzer bir olay onları amelogenesis genel işlem çalışmaya uygun bir model kılan onların ön dişler sürekli büyüyor, özelliği ile sırasını izler. Böylece, değişiklikler emaye kalite ve/veya miktarı bağlı olarak dağıtmak olay saat penceresinin herhangi bir bozulma amelogenesis sonuçlanır. Bu anlamda, dioksin, kurşun ve endokrin engellemeden kimyasallar (EDCs) Bisfenol A (BPA), genistein ve vinclozolin, gibi maruz gösterilmiştir emaye hypomineralizations1,2,3 oluşturmak için ,6,7,8. Asimetrik beyaz opak noktalar fetal dönem ve ilk ay sonra doğum1sırasında Düşük doz BPA doz maruz sıçan ön dişler üzerinde tespit edilmiştir. Fareler ve o insan molar kesici hypomineralization (MIH), bu emaye hatalarını benzer klinik, yapısal ve biyokimyasal özellikleri paylaşıyor. MIH olduğunu son zamanlarda açıklanan diş Mine patoloji hangi etiyolojisi belirsiz9,10 birçok nedensel faktör rağmen hala için edilerek9,10,11 onaylanmadığına karar ,12.

Başka bir önemli emaye hypomineralization patoloji çevresel faktörler nedeniyle aşırı florür emme sonucu diş florozis (DF), olduğunu (> 0,1 mg/kg/gün)13,14. Ana florür içme suyu takıma veya doğal olarak florür ile zenginleştirilmiş kaynağıdır. Florür diş çürüğü önlemek için de sık sık reçete sadece % 50 tek toxic düşük (≤0.05 mg/kg/gün) profilaktik doz değildir MIH ve DF, çevresel faktörler, maruz kaynaklanan iki sık patolojiler kullanılmasının muhtemelen Flor EDCs2 gibi diğer toxicants ile birlikte hypomineralizing etkileri nedeniyle karakterize edilebilir gerek ortak özellikleri takdim ediyorum veya amoksisilin15.

Mikro-diseksiyon sıçan emaye organ ameloblasts farklı farklılaşma aşamalarında içeren moleküllerin ameloblast etkinliği bozabilir ve diş Erüpsiyonu sonra tanısı emaye kusurları neden etki mekanizması anlamak için yardımcı olacaktır. Başka bir deyişle, değişiklikler nedeniyle çevre toxicants emaye gen ifade ve emaye matris kompozisyon karakterizasyonu toxicants maruz tarihinin sulandırma sağlar ve halk için çevre güvenliği izleme kolaylaştırır Sağlık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Mevcut çalışmada kullanılan tüm hayvanların bakım ve Tarım (A-75-06-12) Fransızca Bakanlığı laboratuvar hayvanları kullanımı için kuralları uyarınca muhafaza.

1. hayvan Toxicants maruz

  1. Bu iletişim kuralı gerçekleştirmeden önce gerekli kurumsal onay aldıktan ve bunlar tüm hayvan bakımı yönergelerle uyumlu olmak emin olun.
  2. Farklı deneysel grupları Anayasası ameloblast salgılanması sahne ve ameloblast olgunlaşma sahne üzerinde araştırıldı molecule(s) etkisini test etmek için izin vererek araştırma protokolü tasarım uygula. Burada, dört erkek Wistar rats grupları florür (kaf) birlikte veya BPA (şekil 1A)2ile değil maruz kaldıkları bağlı olarak teşkil. Bütün hayvanlar gözlenen ve gün 65 (şekil 1B) disseke.

2. diseksiyon Hemi-Mandible yetişkin fareler üzerinden

  1. CO2 boğulma, isteğe bağlı olarak işten çıkarma tarafından vücudun geri kalanından ayrı başından takip tarafından fareler ötenazi. Fareler CO2 özel kutu165 min için maruz.
  2. #11 neşter kolay erişim sağlamak alt kesici kullanarak alt dudak tüm cilt kaldırın.
  3. Aynı neşter, çene kemiği iki yarısı bölünür ve bir kesi ile hafif bir basınç iki alt kesici dişler arasında olun.
  4. Zamansal çene kemiğinde ortak çene ayırmak için bir neşter ile kesme ve hemi-çene iyi cımbız ile tutun.
  5. Çevre yumuşak dokular bir neşter ile kesmek ve tüm kas, tendon ve bağ kemik tamamen temiz olana bir kazıyıcı kullanarak kaldırın.

3. yalıtım kesici17,18

  1. Dikkatli bir şekilde kemikten bıçak kesici büyük boyuna eksenine paralel yerleştirerek tıraş. Kemikli Ridge (proksimal uç) kesici uçları yakınındaki servikal döngü yakınındaki kesici sonuna kadar başlayın. Kesi hareket proksimal distal yönde üzerinden devam eder.
  2. İlk kesiği klemple hemi-çene gonion kaldırıp kesici kolayca servikal döngü veya ameloblasts ( Şekil 2' deki kırmızı çizgi) salgı sahne zarar vermeden gerçekleştirmeden izin vermek için neşter ile servikal döngü olun.
  3. İkinci altında ikinci bir kesim molar yapın ve neşter kemik ve kesici medial yüzeyi arasında ekleyin. Bazal kemik kaldırdı kesici dışa doğru döndürün ve dikkatle emaye önlemek için çıkar organ doku zarar iyi cımbız kullanarak.

4. mikro-diseksiyon emaye Organ dürbün mercek altında

  1. Serum fosfat tampon (PBS 1 X) 200 µL bir pipet kullanarak kesici diş üzerinde bırakın. Yukarı dönük olacak şekilde dudak yüzeyi ile iyi cımbız ile kesici alın. Renksiz ve doku portakal bölümleri arasında işaretlemek bir neşter olun. Bu işareti observable daha sonra (Şekil 2) olan temel beyaz noktaya karşılık gelir.
  2. , Bir tarak ya da eşdeğer aracıyla, apikal son salgı sahne (renksiz) ameloblasts ve olgunlaşma aşamasında (turuncu) ameloblasts için kesici ucu neşter işaretine buradan karşılık gelen hücre yüzeyine neşter Mark kazı.
  3. Daha önce açıklanan19geçiş aşamasına karşılık gelen 2 mm dokuyu. Kesici diş tarafından Mezenşim kirlenmesini önlemek için emaye organ diseksiyon sırasında açık değil.
  4. Hemen kesici apikal kısmında yer alan servikal döngü kesmek (Şekil 2) daha önce20açıklandığı gibi.
  5. (Bkz. Tablo reçetesi) daha ileri araştırmalar için % 10 formalin veya lizis çözümde toplamak.

5. ayrılmış emaye Organ dokuları için daha fazla araştırma topluluğu

  1. 200 µL PBS 1 X arabellek kesici diş üzerinde bırak.
  2. #11 neşter bıçakla dikkatle diş epitel hücreleri arabellekte yavaş yavaş ayrı olarak daha önce yapılmış neşter işareti yardımıyla her aşaması için bağlantısını kesin.
  3. Hücre RNA ve protein çekimi için doku protein ve RNA'ların (bkz. Tablo reçetesi) çıkarma sağlar lizis çözeltilerine koymak.
    Not: yüksek kaliteli RNA'ların doku-tarak tüp dönüm ve sonra hücreleri homojen bir karışım elde etmek kadar taşlama hazırlayın. Karışım yukarıda açıklanan2,8,17oldu üreticinin yordamına uygun olarak RNA ve protein çekimi için hazırdır. Genellikle, hakkında 5-10 µg toplam RNA'ların ve 150 µg toplam protein her hazırlık için elde.
  4. Histolojik analizler için immünhistokimya (IHC) ve in situ hibridizasyon (ISH), 2 h, o zaman mağaza PBS 1 X 4 ° C'de % 10 formalin hücre katmanı soktun. Doku sonra balmumu/parafin veya doku OCT donmuş bölümleri için gömülü olabilir.
  5. EMP çekimi için kesici iyi cımbızla almak. Hava (hafif dehidratasyon) için kısa maruz kaldıktan sonra beyaz bir nokta emaye Qafqaz inisiyasyon temsil eden kesici diş dudak yüzeyine orta kısmı görünür hale gelir. Bu beyaz noktaya karşılık gelen geçiş- / erken ameloblasts, olgunlaşma aşamasında öylesine kullanma o bir göstergesi olarak EMP'leri21çıkarılması için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Birçok diş florozis12,13, çevre koşulları nedeniyle aşırı florür emme sonucu veya hypomineralization benzer MIH için bazı EDCs1, maruz emaye gibi kusurlar, Mine 7,22. Bu gelişim emaye kusurları deneysel olarak fareler (şekil 1)1,2,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Değiştirilmiş ameloblast etkinliği ve/veya kesintiye ameloblast yayılması, farklılaşma ve olgunlaşma süreçleri kurşun geri dönüşü olmayan emaye kusurları ve sırayla, emaye kusurları karakterizasyonu değişmiş anlayış geliştirmek yardımcı olabilir ameloblast aktivite sırasında amelogenesis. Böylece, kökenlerine, çevresel veya genetik kusurları ne olursa olsun emay önde gelen patolojik olayları aydınlatmak için belirleyici izole emaye organ üzerinde çalışmalar vardır.

Bu teknik aslında Hiller

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Bu eser Odontolojik araştırma (IFRO) Üniversitesi Paris-Diderot, Fransız Ulusal Sağlık Enstitüsü ve tıbbi araştırma (INSERM) ve Fransız Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bisfenol A, Sigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formalin% 10Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReaktifEuromedex, FransaTR118
RLT tamponuQiagen, Les Ulis, Fransa74126RNeasy Protect Mini Kit
Androjen reseptör antikoruSanta Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA)SC-816tavşan poliklonal antikoru
PBS 10xEUOMEDEXET330. Bir
Sodyum florür (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast düzenliLeica mikrosistemleri, Nanterre cedex,  Metindokusunda was/parafinolarak
39601006 OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, Fransa411243
Ekstra İnce Bonn Makası - Düz/8.5 cmPHYMEP , Paris, Fransa14084-08
Neşter Bıçakları için Sap - 12,5 cmPHYMEP, Paris, Fransa10035-12
Kavisli Neşter BıçağıPHYMEP , Paris, Fransa10035-20
Diseksiyon Bıçağı - İnce/Düz UçluPHYMEP , Paris, Fransa10055-12
Daire BıçağıPHYMEP, Paris, Fransa10059-15
N° 11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, Fransa233-0024
dürbün lensLeica biosystems, Nanterre cedex,  FransaMZFLIII
adlandırılan Fransa

Kaynaklar

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343(2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1(2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503(2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mine Organı Mikro-diseksiyonuSıçan Kesici Diş İzolasyonuAmeloblast Evre AyrımıSekresyon Evresi AmeloblastlarıMatürasyon Evresi Ameloblastlarıİmmünohistokimya AnalizleriRNA Ekstraksiyon ProtokolüWestern Blot AnaliziFlorür BPA MaruziyetiMasson Trikrom Boyama
Mikro-diseksiyon emaye Organ dan çene kemiğinde kesici sıçan için çevre Toxicants maruz
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.