Yöntem makalesi

Kornea Greftlerinde Stromal Özelliklerin Histoloji Benzeri Analizi için Tam Alan Optik Koherens Mikroskopisi

DOI:

10.3791/57104

⸱

21 Ekim 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vision Institute, Sorbonne University, UM 80 / INSERM, UMR_S 968 / CNRS, UMR_7210, 2Quinze Vingts National Ophthalmology Hospital, 3Laboratory of Ophthalmic Instrument Development, The Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Laboratory for Optics and Biosciences (LOB), École polytechnique, 5LOA - ENSTA Paris, École polytechnique

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam alan optik koherens mikroskopisinin kornea donör stromasının yüksek kalitede değerlendirilmesi için bir yöntem olarak kullanımını tanımladık. Bu protokol, sağlık veya hastalığın göstergesi olan özellikleri tanımlamak için kullanılabilir ve donör dokuların taranmasını ve seçimini ve dolayısıyla keratoplasti sonuçlarını iyileştirmeyi amaçlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toplam kornea kalınlığının yaklaşık% 90'ını oluşturan donör kornea stromasının kalitesinin, derin anterior lameller ve penetran keratoplastinin başarısı için majör olmasa da ana sınırlayıcı faktörlerden biri olması muhtemeldir. Bunlar, hastalıklı kornea tabakalarının bir kısmının veya tamamının, sırasıyla, yakın zamanda ölen bir kişiden alınan bağışlanan doku, greft ile değiştirilmesini içeren cerrahi prosedürlerdir. Bununla birlikte, göz bankalarında kornea greftlerinin stromal kalitesini değerlendirme araçları sınırlıdır ve hastalık göstergelerinin yüksek çözünürlüklü kantitatif değerlendirme yeteneğinden yoksundur. Taze veya sabit ex vivo biyolojik doku örneklerinin yüksek çözünürlüklü 3D görüntülenmesine izin veren tam alan optik koherens mikroskopisi (FF-OCM), donör kornea değerlendirmesi için çok uygun non-invaziv bir tekniktir. Burada FF-OCM kullanılarak kornea stromasının kalitatif ve kantitatif analizi için bir yöntem tanımlanmıştır. Protokol normal donör kornealara ve patolojik kornea düğmelerine başarıyla uygulanmıştır ve hem makroskobik hem de mikroskobik düzeyde sağlıklı ve patolojik özellikleri tanımlamak için kullanılabilir, böylece keratoplasti sonucunu tehlikeye atabilecek stromal bozuklukların tespitini kolaylaştırır. Greft kalite kontrolünü geliştirerek, bu protokol donör dokuların daha iyi seçilmesine (ve reddedilmesine) ve dolayısıyla greft başarısızlığının azalmasına neden olma potansiyeline sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea hastalıkları tüm dünyada körlüğün başlıca nedenleri arasındadır1. Bazı hastalıklar sadece cerrahi olarak tedavi edilebilir, genellikle yakın zamanda ölen bir kişiden alınan bağışlanmış doku, greft ile kısmen (yani lameller keratoplasti) veya tüm (yani penetran keratoplasti) hastalıklı korneanın değiştirilmesini içerir. Endoteli etkilemeyen kornea hastalıkları için (örneğin, keratokonus, enfeksiyöz keratit sonrası stromal skarlar, travma ve stromal distrofiler), derin anterior lameller keratoplasti (DALK) şu anda tercih edilen cerrahi teknik olarak kabul edilmektedir 2,3,4,5. Bu teknik, daha düşük greft reddi insidansı, endotel reddi yokluğu, daha düşük endotel hücre kaybı ve uygun maliyet-etkinlik oranı 6,7,8,9,10,11 ile ilişkili olan sadece merkezi kornea epiteli ve stromanın yerini alarak alıcının kornea endotelinin korunmasını mümkün kılar . DALK ayrıca, optimal endotel kalitesinden daha düşük olan korneaların greft olarak kullanılmasına izin verir, çünkü bu tehlikeye giren tabaka nakledilmeyecektir12. Tersine, donör kornea stromasının kalitesinin greft başarısı ve görme iyileşmesi için ana sınırlayıcı faktör olması muhtemeldir, çünkü stroma kalan tek donör kornea tabakasıdır, donör epitel ise alıcı epitel ile değiştirilecektir. Ne yazık ki, göz bankalarında donör kornea stromasını değerlendirme olanakları sınırlıdır. Genellikle enükleasyon ile doku alımı yapıldığında donör göz küresinin yarık lamba muayenesini ve donör stroma13'ün ışık mikroskobu muayenesini içerir. Bazı göz bankaları, Fourier etki alanı optik koherens tomografisi (FD-OCT)14 kullanarak bu tür standart prosedürleri desteklemeye başlamıştır.

Ultrason görüntüleme15'e optik bir analog olan oftalmik optik koherens tomografi (OCT), retina 16 ve ön segment17'nin optik kesitlerini oluşturmak için geniş bant veya ayarlanabilir ışığın parazitini kullanır. Erken klinik sistemlerin temeli olan zaman alanı OCT'de, bir referans aynasının konumu değiştirilir, böylece referans ışını çeşitli doku arayüzlerinde yansıyan ışınla neredeyse aynı miktarda zaman geçirdiğinde, A-taramaları zamanın bir fonksiyonu olarak üretilir. Çoğu modern klinik sistemin temeli olan FD-OCT'de (spektral veya frekans alanı OCT olarak da adlandırılır), referans aynası bir konuma sabitlenir ve tüm girişim kalıpları birbirine karıştırılmış bireysel bir A-taraması bir seferde elde edilir ve Fourier analizi ile parçalara ayrılır.

Klinik (zaman veya spektral alan) OKT sistemleri, korneanın kesitsel görünümlerine ve yarık lambalı biyomikroskopiden daha yüksek bir eksenel çözünürlükte stromal opasitelerin saptanmasına izin verirken, yanal çözünürlükleri sınırlıdır. Konfokal mikroskopi18 , korneanın histolojik detaylara yaklaşan lateral bir çözünürlükte incelenmesine izin verir, ancak aksiyel olarak sınırlıdır.

Tam alan optik koherens tomografik mikroskopi (FF-OCT veya FF-OCM)19,20, hem konfokal mikroskopi hem de OCT elemanlarını birleştirerek, yaklaşık 1 μm'lik eksenel çözünürlükle karşılaştırılabilir bir yanal çözünürlük elde eder. Daha spesifik olarak, FF-OCM, yanal tarama olmadan yüz 2D tomografik görüntüler elde etmek için tutarsız geniş bant ışık kaynakları (örneğin, bir halojen lamba) ve yüksek sayısal diyaframlı optikler kullanır. FF-OCM, derinlik yönünde tarama yaparak, taze veya sabit ex vivo biyolojik doku örneklerinin non-invaziv 3D görüntülenmesini sağlar. Korneayı görüntülemek için kullanılmıştır21,22,23. FF-OCM, hem yüksek çözünürlüklü en yüz hem de kesitsel görünümler sağlayarak, korneanın hem histolojik yapısı hem de hücresel detayları hakkında bilgi sağlar. Aslında, FF-OCM'nin histolojiden daha üstün yapısal bilgi sağladığı gösterilmiştir ve spektral-domain OCT ve konfokal mikroskopi24,25 kombinasyonu ile mümkün olduğunca daha fazla hastalık göstergesini tanımlayabilmiştir.

Burada FF-OCM kullanılarak kornea donör stromasının kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Yöntem, üç kantitatif stromal parametre (yani, Bowman'ın tabaka kalınlığı ve değişkenliği ve stromal yansıtıcılığı) dahil olmak üzere, stromal durumun göstergesi olan makroskopik ve mikroskobik özelliklerin histoloji benzeri analizine dayanmaktadır. Bu nedenle tarif edilen protokol normal ve anormal kornea dokularına uygulanır ve hastalıklı kişilerin normal insan kornea dokularından ayırt edilmesine izin verir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemler, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine göre gerçekleştirilmiş ve insan dokuları için uluslararası etik gereklilikleri takip etmiştir. Bu prospektif bir gözlemsel vaka kontrol çalışmasıydı. Hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Fransız tedavi veya takip standartlarında herhangi bir değişiklik yapılmamıştır. Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu (IRB) onayı, Hasta Koruma Komitesi, Ile-de-France V (14944) 'den alınmıştır.

1. Doku Seçimi ve Hazırlanması

  1. Donör korneaları seçin.
    1. FF-OCM görüntüleme28'den önce detürgescence27'ye izin vermek için organ kültürü ortamı26'da saklanan donör korneaları 3 gün boyunca dekstran takviyeli organ kültürü ortamına aktarın (bkz.
  2. Örnekleri hazırlayın.
    1. Depolama ortamına daldırılmış korneayı, epitel yukarı bakacak şekilde numune tutucuya yerleştirin.
    2. Korneanın üzerine temiz bir silika kapak kapağı (numune tutucu ile birlikte verilir) yerleştirin ve numune hafifçe düzleşene ve kapak kaymasının altında hareketsiz hale gelene kadar tabanını hafifçe çevirerek tutucuyu kapatın ve nispeten eşit bir görüntüleme yüzeyi sağlayın. Hava kabarcıklarını önlemek için önlemler alın.
    3. Daldırma ortamı olarak kapak kapağına kalın bir oftalmik veya optik jel tabakası uygulayın.

2. FF-OCM Başlatma, Kurulum ve Görüntü Alma

  1. Aygıtı başlatın.
    1. Cihazın arkasındaki güç düğmesini çalıştırarak cihazı açın; Cihazın önündeki yeşil bir LED'in yanması, gücün açık olduğunu gösterir.
    2. Özel bilgisayarı ve halojen ışık kaynağını, öndeki güç düğmesini çalıştırarak açın.
    3. Masaüstü kısayoluna çift tıklayarak satın alma yazılımını başlatın (bkz. Malzeme Tablosu).
    4. Görüntüleme aşamasının hareketli tepsi dışında net olduğundan emin olun. Ardından, motorları istemde başlatmak için "Tamam" ı tıklayın.
    5. Tepsiyi dışarı çekin ve numune tutucuyu özel kaba yerleştirin, ardından tepsiyi yavaşça geri itin.
  2. Cihazı kurun.
    1. Belirlenen ve zorunlu alana bir "örnek tanımlayıcı" girin; İsteğe bağlı olarak bir "Örnek Açıklama" ve/veya "Çalışma Açıklaması" girin.
    2. Hazır olduğunuzda, daha sonra yanal konumlandırma ve gezinme amacıyla kullanılabilecek bir örnek anlık görüntüsünü oluşturmak için "Makro görüntüsü al" ı tıklayın; tatmin olduktan sonra, "Evet" i tıklayarak istemde görüntüyü doğrulayın, ardından cihaz numune tepsisini hedefin altına taşır ve otomatik bir ayarlama gerçekleştirir.
    3. Daha fazla ilerlemeden önce mikroskop hedefinin optik jele iyice daldırıldığından emin olun.
  3. Yığınları alın.
    1. Bir satın alma işlemi hazırlamak için "Keşfet" sekmesini seçin.
      1. Bir görüntü yığını elde etmeden önce, joystick'in çevirisi veya ekrandaki manuel seçim yoluyla korneanın merkezine gidin (yani, elde edilen makro görüntüsündeki kırmızı kareyi tıklayıp istediğiniz yere sürükleyerek).
      2. Oyun çubuğunun döndürülmesi, kaydırıcının ayarlanması veya grafik kullanıcı arabiriminde (GUI) manuel klavye girişi yoluyla görüntüleme derinliğini değiştirin ve ortalama değerini ayarlayın (optimum kornea görüntülemesi için genellikle ortalama 40 önerilir).
        NOT: Bu, kornea örneğinin kalınlığını ve ilk ve son görüntü yerini derinlemesine not ederken, tüm kornea kalınlığı boyunca görüntü almak için gerekli ortalamayı belirlemek için yapılır. Kapak kaymasının alt yüzeyi, tomografik görüntüde (GUI'nin sağ tarafında) görülen ve kornea yüzeyinin yerini belirlemeyi kolaylaştıran paralel girişim saçakları oluşturur.
      3. Kornea yüzey değerini veya ilk görüntü konumunu derinlemesine "Derinlik" alanına girin.
    2. Görüntüleri almak için "Al sekmesini" seçin.
      1. "Dilim aralığı" nı seçin (varsayılan ve önerilen ayar, cihazın eksenel çözünürlüğüyle eşleşen 1 μm'dir) ve "Dilim sayısı" altında kornea kalınlığı değerini buna göre girin.
      2. Parametreleri ve edinme süresini gözden geçirin ve memnun kaldığınızda satın almayı başlatmak için "Tamam" a basın.
      3. Satın alma sırasında, FF-OCM'nin konumlandırıldığı tabloyla herhangi bir temastan kaçının.

3. Elde Edilen Görüntülerin Yönetimi

  1. Görüntüleri görüntüleyin ve dışa aktarın.
    1. Masaüstü kısayoluna çift tıklayarak FF-OCM görüntüleme yazılımını başlatın ( bkz. Malzemeler Tablosu); Elde edilen görüntüler (örnek kimliğiyle tanımlanan) "Yerel Çalışmalar" listesinde görünür.
    2. Hem makro görüntüsünü hem de edinilen görüntü yığınını içeren ilgili örnek kimliğine sahip etüdü seçin ve daha fazla analiz için ham piksel verilerini ve meta verileri saklamak üzere görüntü serisine sağ tıklayıp "DICOM" formatını seçerek etüdü "dışa aktarın".
    3. Görüntü serisine çift tıklayarak çoklu düzlemsel yeniden yapılandırma (MPR) modunu kullanarak 3B görüntü yığınlarını en yüz ve kesitsel görünümlerde görüntüleyin; Görüntüler arasında gezinin (örneğin, fare tekerleği kaydırma veya kaydırıcı ayarı yoluyla) ve her yığının temsili en yüz ve kesit görünümlerini seçin.
    4. "DICOM" formatını kullanarak pencerenin sağ alt köşesindeki simgeye tıklayarak seçilen görünümleri dışa aktarın.
  2. Görüntüleri içe aktarın.
    1. Masaüstü kısayoluna çift tıklayarak görüntü işleme yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve DICOM görüntülerini içe aktarmak için "Eklentiler" altındaki "Biyo-Formatlar" "İçe Aktarıcı" bölümüne gidin; "Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçenekleri" penceresinde "Benzer adlara sahip dosyaları gruplandır"ın seçili olduğundan emin olun.

4. Görüntü Analizi: Stromal Morfoloji ve Özelliklerin Nitel ve Kantitatif Olarak Değerlendirilmesi

  1. Stromal ve Bowman'ın tabaka kalınlığını değerlendirin.
    1. Mesafeleri kornea kesitlerinde manuel olarak ölçün, örneğin kesit25 boyunca eşit aralıklı beş noktada.
      1. Bilinen mesafenin iki noktası arasında bir çizgi çizin (örneğin, tüm görüntünün solundan sağına, yani varsayılan görüş alanına göre, 1.024 piksel veya 780 μm), "Analiz Et" e gidin ve "Ölçeği Ayarla" yı seçin ve uygun alanlara "Bilinen mesafe" ve "Uzunluk birimi" ni girin ve "Tamam" ı tıklayın.
      2. Bilinmeyen mesafedeki iki nokta arasında bir çizgi çizin; Ölçülen uzunluğu veya mesafeyi doğrudan durum çubuğundan okuyun.
    2. Ortalama ve varyasyon katsayısını (COV) kaydedin. Bowman'ın tabaka kalınlığı 6.5 μm'den az ve% 18.6'dan büyük bir COV, anormal kornea stroması25 ile ilişkilendirilmiştir.
  2. Keratosit yoğunluğunu belirleyin.
    1. Konfokal mikroskopi konvansiyonunu takiben: karşılaştırılabilir kalınlıkta dilimler üretmek için stromal en yüz görüntülerini 7'li gruplar halinde toplayın. Bunun için "Resim" sekmesine gidin ve "Yığınlar" altında "Z'yi Dilimle" yi seçin.
    2. Stroma24,25 boyunca ilerlemedeki farklı (azalan) hücre yoğunluğunu dikkate alın. Bunun için stromanın derinliğe göre 4 bölgeden oluştuğu düşünülebilir: (1) Bowman tabakasının altındaki çok ön stroma, yani tüm stromal kalınlığın% 2'si; Kalan stroma (yani, tüm stromal kalınlığın% 98'i), aynı kalınlıkta üç bölgeye sahiptir: (2) anterior stroma, (3) orta stroma ve (4) posterior stroma.
    3. Daha fazla analiz için, çok ön stroma için mevcut tüm yüz dilimlerini, anterior stroma için 15 görüntüyü, orta stroma için 5 görüntüyü ve arka stroma için 5 görüntüyü (güvenilir bir sayım için gereken bölge başına görüntü sayısının kademeli analiz29 ile belirlendiği) dahil edin.
    4. Her bir en yüz görüntüsünde, 300 μm x 300 μm boyutunda bir ilgi alanı seçin. Çekirdek görselleştirmesini geliştirmek için, "Düzenle" sekmesinin altındaki "Ters Çevir" seçeneğini kullanarak görüntüyü ters çevirin ve kontrastı ve parlaklığı ayarlayın. İkincisi için, "Görüntü" ye gidin ve "Analiz Et" altındaki "Parlaklık / Kontrast" a gidin.
    5. Hücre çekirdeklerini, örneğin "hücre sayacı" işlevi25'i kullanarak manuel olarak sayın. Bunun için "Eklentiler" e gidin ve "Analiz Et" altındaki "Hücre Sayacı" na gidin. "Başlat" a basın ve ardından bir sayaç türü seçin. Ardından, ters çevrilmiş görüntüdeki koyu oval özelliklere tıklayarak hücre çekirdeklerini saymaya başlayın, görüntü25'in yalnızca dört tarafından ikisi için bir görüntü sınırına inenleri göz önünde bulundurun.
    6. Hücre yoğunluğunu, keratosit yoğunluklarının hastalarda (örneğin, keratokonus ile) sağlıklı deneklere göre daha düşük olduğu ve hastalık şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilen konfokal mikroskopi konvansiyonunu takiben, hücreler / mm² cinsinden alan yoğunluğu açısından kaydedin (örneğin, keratokonusile) sayılmış hücre yoğunluğunu kaydedin (hücrelerden / 90.000 μm²'den hücrelere / mm²'ye dönüştürmek için sayılan hücre sayısını 0.09'a bölün).
      NOT: Transplantasyondan sonra mükemmel berraklıkta bir kornea grefti elde etmek için minimum keratosit yoğunluğu eşiğinin gerekli olup olmadığını belirlemek için daha ileri klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.
  3. Stromal yansıtıcılığı değerlendirin.
    1. Örneğin "Z ekseni profili" işlevini ve/veya özel yazılım25,30,31'i kullanarak stromal görüntü yığınlarının ortalama yoğunluk derinliği profillerini oluşturun.
      NOT: Bunlar aslında genlik derinliği profilleridir, çünkü FF-OCM, yoğunluğundan ziyade numune tarafından geri saçılan ışığın genliğini ölçer.
      1. Her bir yüz yığını için ortalama gri düzeyi hesaplayın.
      2. Minimum gri değeri çıkarın ve maksimum gri değere göre normalleştirin.
      3. Günlük ölçeğinde stromal derinliğin bir fonksiyonu olarak görüntüleyin (stromal kalınlığın %'si).
      4. Elde edilen logaritmik profili, karesel artıkların toplamını en aza indiren doğrusal bir regresyon çizgisi ile yaklaşık olarak tahmin edin (en küçük kareler sığar).
      5. R-kare değerini (R²) doğrusallık ölçüsü olarak kaydedin. 0.94'ün altındaki değerler kornea patolojisinin bir göstergesi olabilir25.
        NOT: Bir patolojinin varlığından dolayı doğrusal logaritmik regresyon modelinin (veya tek üstel bozunma modelinin) yetersizliğini sadece ölçüm gürültüsünden ayırt etmek için, Bayes çıkarımı ile sinyal analizi yapılabilir31. Ayrıca, doğrusal logaritmik (veya mono-üstel) stromal derinlik profillerine sahip kornealarda (örneğin, R-kare değerleri 30 veya Birge oranları31 ile 1'e yakın temsil edilir), foton ortalaması olmayan yolun sinyal bozunma hızından hesaplanması, şeffaflık derecesini daha da ölçmek için kullanılabilir31.
  4. Diğer stromal özelliklerin ve hastalık göstergelerinin görünürlüğünü değerlendirin.
    1. Yara izlerinin, fibrotik dokunun, göllerin veya Vogt strialarının varlığını kontrol edin.
    2. Ölçüm için yeterince görülebiliyorsa, stromadaki sinirlerin ortalama kalınlığını değerlendirin24.
      1. Stromal sinirin en görünür olduğu yerden birini seçin (genellikle orta stromal bölgede).
      2. Sinirin kalınlığını, örneğin beş nokta24'te ölçün, ardından ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. 9 μm'nin üzerindeki sinir kalınlıkları, keratokonus24 gibi patoloji için ek bir gösterge olabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FF-OCM cihazı (bakınız Malzeme Tablosu)28 ve bu yazıda kullanılan genel kurulum Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2'de , organ kültürü ortamında depolandıktan sonra şişmiş bir insan donör kornea, ödemli korneanın patofizyolojik bir modelini vermekte ve sınırlı penetrasyon derinliği nedeniyle tüm kornea kalınlığı boyunca FF-OCM görüntü alımını önlemektedir. Dekstran takviyeli organ kültürü ortamına transfer, şişmeye neden olur ve Şekil 3'te gösterildiği gibi normal kalınlıkta donör kornealarla sonuçlanır. Hastalıklı kornealar, morfolojik değişiklikler ve stromanın azalmış ve değişken kalınlığı (Şekil 4) ve / veya Bowman tabakası (Şekil 5) dahil olmak üzere tipik stromal özellikler ile tanınabilir. Keratosit yoğunluğunun (Şekil 6) ve stromal reflektivitenin (Şekil 7) değerlendirilmesi, klinik OCT sistemlerinin yeteneklerinin ötesinde, FF-OCM ile histoloji benzeri analize ve normalin patolojik kornea dokularından ayırt edilmesine yardımcı olabilir (Şekil 8).

figure-results-1
Resim 1: Bu çalışmada kullanılan genel kurulum ve FF-OCM cihazının şematik ve fotoğrafları. (A) FF-OCM cihazının fotoğrafı (bakınız Malzeme Tablosu)28. (B) Cihazın şematik ve optik kurulumu. (C) Numune tutucudaki bir insan donör korneasının fotoğrafı. (D) Daldırma hedefini ve numune tutucuyu yakınlaştırın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Detüresanstan önce organ kültürlü normal insan korneası. Göllerin karanlık alanlar olarak görülebildiği organ kültürü ortamında (oklarla gösterildiği gibi) depolanmasından kaynaklanan şişmiş ("ödemli") korneanın kesitsel (A) ve en yüz görünümü (B, stroma boyunca dilim). Kornea kalınlığı iki katına çıkarak 1.100 μm'nin üzerine çıkarak tüm derinlik boyunca görüntü alımını önledi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Detüresans sonrası organ kültürlü normal insan korneası. Tüm kornea boyunca kesitsel görünüm (A) ve dekstran takviyeli ortama batırılmış şişmiş korneanın en yüz stromal görünümü (B), düzenli olarak dağılmış hiper-reflektif (beyaz) keratositleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Stromal kalınlık da dahil olmak üzere stromal morfoloji ve özelliklerin genel değerlendirmesi. Normal insan korneasına (A) kıyasla, keratokonuslu (B) kornealar, kesitsel görünümlerde koyu dikey bantlar olarak gözlenebilen çok sayıda paralel Vogt striae ve orta stromal en yüz dilimlerinde (C) bulunabilen kalın stromal sinirler ile birlikte azalmış ve değişken stromal kalınlığa sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Bowman'ın hiper-reflektif epitelyal bazal membran tarafından önden ve posteriorda çok ön stromadaki hiper-reflektif keratositler tarafından tanımlanan tabaka kalınlığının değerlendirilmesi. Normal bir insan korneası (A) ile karşılaştırıldığında, patolojik kornea (örneğin, keratokonus) (B), kesilme ve skarlaşma nedeniyle Bowman tabakası kalınlığının azalmasına ve değişken olmasına neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Keratosit yoğunluğunun değerlendirilmesi. (A) Keratosit çekirdekleri, 300 μm x 300 μm'lik bir ilgili bölge seçildikten sonra geliştirilmiş ve ters yüz görüntülerinde manuel olarak sayılır. (B) Sayılan çekirdekler oklarla gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Stromal yansıtıcılığın değerlendirilmesi. Geri saçılan ışığın miktarı, normal donör korneaların stromasındaki derinlikle birlikte (üstel olarak) azalır (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4A), 1'e yakın R-kare değerleriyle temsil edilen doğrusal logaritmik derinlik profillerine neden olur (yeşil iz). Bu, artmış ışık geri saçılımının stromal bölgelerine sahip patolojik kornealar için geçerli olmayabilir (bkz. Şekil 4B). Enfeksiyöz keratitten sonra stromal skarlı bir kornea örneğinde olduğu gibi (girişte tasvir edilen) bu tür makroskopik özelliklerin varlığı, belirli bir eşiğin altında bir R-kare değeri ile temsil edilen doğrusal olmayan logaritmik yoğunluk derinlik profilleri yaratacaktır (örneğin, 0.9425'ten düşük; kırmızı iz). Logaritmik genlik derinlik profillerinin aslında FF-OCM'nin yoğunluğundan ziyade numune tarafından geri saçılan ışığın genliğini ölçtüğü için gösterildiğini unutmayın.  Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: FF-OCM'nin histoloji ve spektral alan OKT üzerindeki yararlarının gösterilmesi. (A) Histoloji ve (B) keratoplastiden önce aynı korneada in vivo olarak elde edilen spektral-alan-OCT görüntüsü. (C) Keratoplasti sonrası ex vivo kornea düğmesinin karşılık gelen FF-OCM kesiti, klinik spektral etki alanı OCT görüntülerine kıyasla üstün çözünürlük gösterir. Fibrozis ayrıca FF-OCM görüntülerinde histolojiden daha net görülür. Üst stromadaki keratositlerin yüksek yoğunluğu hem (C) kesitsel hem de (D) yüz görünümlerinde açıkça görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FF-OCM kullanılarak kornea donör stromasının kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için burada açıklanan protokol, spektral etki alanı OKT ve konfokal mikroskopi21,24,25'in yeteneklerinin ötesinde, stromal durumun göstergesi olan makroskopik ve mikroskobik özelliklerin histoloji benzeri analizine dayanmaktadır ve hastalıklıların normal insan dokularından ayırt edilmesini sağlar.

İnsan donör kornealarının speküler mikroskopi ile mükemmel bir endotel kalitesi değerlendirmesinin yanı sıra, stromal kalitenin değerlendirilmesi göz bankalarında zordur ve genellikle mevcut protokollerde yarık lamba biyomikroskobu ve / veya ışık mikroskobu ile brüt bir gözlemle sınırlıdır. Mevcut yöntemlerle iyi rezolüsyon eksikliği, sadece keratoplasti sonucunu tehlikeye atan bazı stromal hastalığı olan korneaların seçilebileceği anlamına gelmez, aynı zamanda korneaların aslında anterior stroma veya epitel bölgelerine kısıtlayıcı olan stromal opasiteler için reddedilebileceği ve endotelyal keratoplasti prosedürleri için hala kullanılabileceği anlamına gelir14.

Mevcut göz bankası protokolü, üstün çözünürlüğü nedeniyle, korneanın, özellikle de stromanın (Bowman tabakası dahil) kalite değerlendirmesini tamamlamak için güçlü ve invaziv olmayan bir araç oluşturan FF-OCM'nin eklenmesiyle desteklenebilir. Yarık lamba incelemesinden farklı olarak, greft, FF-OCM görüntü alımı boyunca depolama ortamıyla dolu kapalı bir odaya daldırılmış halde kalır ve olası kontaminasyon riskini azaltır.

FF-OCM ile başarılı görüntü elde etmek için (bakınız Malzeme Tablosu), mikroskop hedefinin numune tutucunun kapak kaymasının üzerine uygulanan optik jele iyice daldırılması önemlidir (adım 2.2.3). Ayrıca, başarısız otomatik ayarlamadan sonra da gerçekleştirilecek bir prosedür olan cihazın kalibrasyonunun düzenli olarak kontrol edilmesi önerilir (adım 2.2.2) ve edinme yazılımındaki "Araçlar ve seçenekler" aracılığıyla erişilir (bkz. Numune tutucuda bir kalibrasyon aynasının kullanılmasını içeren prosedür, normal numune hazırlama ile aynıdır (bkz. adım 1.2), ancak optik jel, kapak kaymasının konumlandırılmasından önce aynaya uygulanmalıdır.

Mevcut göz bankası prosedürlerine göre normal stromaya sahip olduğu düşünülen bir dizi donör kornea grefti bu yazıdaki protokolü tanımlamak ve özellikle donör stromal kalitesinin kesin ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için FF-OCM'nin uygunluğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu normal donör kornealar, depolama ortamına daldırılmış patolojik kornealarla karşılaştırıldı ve kornea greftlerinde çeşitli stromal özelliklerin (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8'de gösterilmiştir) FF-OCM ile mümkün kılınan histoloji benzeri analizin, hastalıklı insan kornea dokularını normal insan kornea dokularından ayırt etmeyi sağladığını göstermiştir.

Skar varlığı (Şekil 5 ve Şekil 7), fibrotik doku (Şekil 8), göller (Şekil 2), Vogt striae (Şekil 4) veya artmış stromal sinir çapı (Şekil 4) gibi morfolojik değişikliklerin yanı sıra, hastalıklı kornealarda tipik stromal özellikler mevcuttur. Stromal kalite değerlendirmesinde özellikle ilgili olan stromal parametreler, Bowman'ın tabaka kalınlığı ve değişkenliği ve stromal yansıtıcılığı gibi görünmektedir. Protokol içindeki kritik adımlar bu nedenle 4.1 ve 4.3 adımlarıdır.

İnsan kornea gelişimi sırasında salgılanırken, özellikle Bowman'ın tabakası 19 haftalık gebelik ile belirginleşir ve doğumdan sonra asla onarılmaz32. Bowman tabakasına verilen hasar bu nedenle geri dönüşümsüzdür ve refraktif cerrahi, enfeksiyöz keratit, keratokonusun neden olduğu hasar da dahil olmak üzere donör kornea dokusundaki önceki stromal hasarın ideal bir göstergesi olarak hizmet eder. Donör kornea kullanımı için kontrendikasyonları oluşturan bu tür kornea hastalıkları, kesilme ve skarlaşma nedeniyle azalmış ve değişken Bowman tabaka kalınlığı ile ilişkilidir (Şekil 5) ve donör öyküsü tam olarak bilinmediğinde mevcut göz bankası protokolleri tarafından gözden kaçırılması muhtemeldir.

Postmortem kornea ödemi nedeniyle donör ölümünden sonra kornea saydamlığı bozulsa da, geri saçılan ışık miktarının veya stromal yansıtıcılığın stromadaki derinlikle katlanarak azalması beklenmektedir (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4A); Sonuç olarak, normalize stromal yansıtıcılığın logaritması, normal donör kornealarda stromal derinliğin doğrusal bir fonksiyonu olacaktır ve 1'e yakın R-kare değerleriyle temsil edilecektir. Tersine, makroskopik özelliklerin varlığı doğrusal olmayan logaritmik derinlik profilleri ile ilişkilidir ve stromal hastalığın göstergesidir (Şekil 4B ve Şekil 7)25.

Keratosit yoğunluğu stromal kollajen fibril ve hücre dışı matriks sentezi ve yenilenmesinden sorumlu olduğundan, keratosit yoğunluğunun donör stromal kalitesini değerlendirmek için başka bir ilgili parametre olduğunu ve çok düşük keratosit sayısı gösteren dokuların nakledilmemesi gerektiğini varsaymak makul görünmektedir. Bu nedenle protokol, göz bankalarında kolayca kullanılabilen FF-OCM görüntülerinden keratosit yoğunluğunu ölçmek için hassas ve güvenilir bir yöntem içerir25 ve konfokal mikroskopi kuralını izler. FF-OCM ile, keratosit yoğunluğunun, keratositlerin doğrudan kesitsel görünüm33'te sayılmasıyla da belirlenebileceğini unutmayın; bu, keratositlerin birden fazla yüz diliminde sayılmasını gerektiren konfokal mikroskopiye göre potansiyel bir avantajdır. Bununla birlikte, keratosit yoğunluklarının hastalık hastalarında normal kontrollerden 34,35,36,37 daha düşük olduğu ve hastalık şiddeti34,38 ile ilişkili olduğu gösterilen canlı hastalardan farklı olarak, insan ex vivo doku örneklerinde durum böyle değildi 25 ve transplantasyon sonrası iyi görsel iyileşme ile sonuçlanması için donör kornealarda minimum sayıda keratosit gerekip gerekmediğini belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Patolojik dokuda olduğu gibi donör dokuda da düşük keratosit yoğunluğu yaşlanma, iskeminin neden olduğu hücrelerin postmortem kaybı ve/veya donör dokunun depolanması ile açıklanabilir 27,39,40,41. Ayrıca belirtmek gerekir ki, bu protokolde elde edilen ve görüntülenen normal donör korneaların AB Göz Bankası Birliği standartlarına göre endotel kalitesinin düşük olması nedeniyle nakil öncesi ya depolanmış ve ödemli ya da şişmiş ya da göz bankası tarafından atılmış olduğu da belirtilmelidir. FF-OCM görüntüleme, tarif edilen protokolle birlikte göz bankası ortamına dahil edilecek olsaydı, kornealar tipik olarak keratosit yoğunluklarını etkileyebilecek olandan daha taze bir durumda değerlendirilirdi.

Stromal kalite analizi için burada açıklanan protokol, kalınlık ve yapı21,24 açısından FF-OCM ile de çözülebilen Descemet membranının değerlendirilmesi için genişletilebilir. Bu, ince Descemet'in membranlarının stromadan ayrılmasının daha zor olabileceği Descemet'in membran endotelyal keratoplastisi için doku seçiminde yararlı olabilir.

Sonuç olarak, FF-OCM, depolama sırasında insan donör kornea stromasının hassas ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Greft kalitesini artırarak, bu protokolün mevcut göz bankacılığı prosedürlerine eklenmesi, donör dokuların taranmasını ve seçimini ve dolayısıyla keratoplasti sonuçlarını iyileştirme potansiyeline sahiptir. FF-OCM cihazının göz bankası rutinine gerçek hayattaki entegrasyonu, özel bir CMOS kameranın geliştirilmesi sayesinde daha hızlı görüntü elde etme ve daha geniş görüş alanı ve görüntüleme sırasında kornea depolama ve kullanım için özel steril tek kullanımlık kasetlerin tasarımı da dahil olmak üzere son teknolojik güncellemelerle kolaylaştırılmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Agence Nationale de Recherche'den (ANR), PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) hibe No ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) kapsamında ve Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 709104 (K.I.) kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından fon almıştır. Yazarlar, hücre sayımı ve histolojik işleme konusundaki yardımları için Céline de Sousa'ya teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Light-CT ScannerLLTech, Fransahttp://www.lltechimaging.com/products-applications/products/Bu yazıda görüntüleme için kullanılan FF-OCM cihazı
CorneaJetEuroBio, Fransahttp://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.htmlDonör korneaların saklandığı organ kültürü ortamı
CorneaMaxEuroBio, Fransahttp://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.htmlDeturgescence için kullanılan dekstran takviyeli organ kültürü ortamı 
Fiji (ImageJ)Ulusal Sağlık Enstitüsü, Bethesda, MD, ABDhttps://fiji.sc/Açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı
MatlabMathworks, Inc., Natick, MA, ABDhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlMatematiksel hesaplama yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment. Br J Ophthalmol. 96, 614-618 (2010).
  2. Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
  3. Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
  4. Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
  5. Amayem, A. F., Anwar, M. Fluid lamellar keratoplasty in keratoconus. Ophthalmology. 107, 76-79 (2000).
  6. Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
  7. Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
  8. Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
  9. Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
  10. Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
  11. Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
  12. Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
  13. Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
  14. Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
  15. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  16. Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
  17. Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
  18. Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
  19. Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H. Full-field optical coherence microscopy. Opt Lett. 23, 244-246 (1998).
  20. Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
  21. Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
  22. Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202(2007).
  23. Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006(2010).
  24. Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
  25. Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
  26. Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
  27. Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
  28. Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).
  29. Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
  30. Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
  31. Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
  32. Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
  33. Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
  34. Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
  35. Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
  36. Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A. Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik. Ophthalmology. 102, 140-146 (2005).
  37. Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
  38. Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
  39. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
  40. Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kornea Stromas AnaliziHistoloji Benzeri G r nt lemeStromal zellik TespitiKornea Grefti De erlendirmesiOptik Jel mmerziyonuStromal Kal nl k l mKeratinosit Yo unlu u AnaliziStromal Reflektivite De erlendirmesiDon r Kornea De erlendirmesi

İlgili makaleler