Bir mouse adacıkları omental nakli için bir yöntem tanıttı. İzole adacıkları hidrojel ile karıştırılır ve karışımı bir diyabetik fare omental kese yerleştirilir. Daha sonra kan şekeri izlenir ve IMMUNO-histochemical çözümleme yapılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Adacık nakli tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olmak için teklif edildi. Son esaslı bir kanıt bulmadığınız intravasküler adacık infüzyon ideal çok uzak olduğunu gösterir ve bu nedenle, omentumun yeniden ortaya çıkan adacık nakli için potansiyel olarak değerli bir site olarak. Bu deney yalıtım kaliteli adacıkları ve diyabetik alıcılara adacıkları implantasyonu gerektirir. Nakli için omentumun daha iyi görsel olarak göstermiş olabilir cerrahi adımları gerektirir. Burada, bu yordam için ayrıntılı adımlar sunulmaktadır. Karışımı diyabetik farelerin kese omental yerleştirmeden önce hidrojel ile izole adacıkları karıştırma için iki yöntem burada açıklanmıştır. Farklı hydrogels farklı koşulları için kullanılır. Kan şekeri düzeyleri diyabetik fare alıcıların omentumun syngeneic adacıklar 35 gün için takip. Bazı hayvanlar IMMUNO-histochemical analizi yapmak için 14 gün sonra kurban edildi. Bu önceden klinik nakli yaklaşım klinik nakli için çeviri kadar önde gelen ön veriler olarak kullanılabilir.
Giriş
Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF) göre diyabet Şu anda 592 milyon kişi 20351tarafından öngörülen bir artış ile 382 milyon insanı etkiliyor. Her iki allojeneik ve xenogeneic adacık nakli sistemik immünsupresif tedavi gereklidir. İmmünosupresyon bağışıklık ret greft kaybı2önemli bir nedenidir. Transplante adacık kaybı nedeniyle anında kan aracılı inflamatuar reaksiyon (IBMIR)3,4önemli bir sorun da vardır. Ancak, syngeneic olduğu gibi böyle bir bağışıklık yanıtı yokluğunda bile veya auto-nakli modelleri, adacık hücreleri karaciğer portal ven yoluyla içine nakledilen iltihap nedeniyle ve/veya zayıf kan gibi olumsuz çevre koşulları için kayıp düşük oksijen ve/veya besin5,6ile sağlayın. Sonuç olarak, uzun vadeli metabolik işlevi sağlamak için adacık numaraları daha büyük engraftment7azaltır ilk hücre kaybı için telafi etmek gereklidir.
Adacık engraftment optimize etmek için bir girişim, birkaç alternatif anatomik sitesi deneysel olarak araştırılması gibi klinik olarak, yapılan umut verici ile henüz değil kesin görüntülenen8. Bazı alternatif siteleri kolay ve güvenli erişim sunan ise (Örneğin., cilt, böbrek kapsülü, gastrik submukoza ve gözün ön odası) veya daha büyük adacık kitleler için daha geniş bir yüzey (e.g., periton boşluğu), hayatta kalma ve fizyolojik transplante adacıklar metabolik performans ve hala sınırlı bir endişe9kalır. Adacık engraftment için daha uygun bir site için arama devam ediyor.
Omentumun adacık nakli erken gelişme araştırıldı ve başarılı bir ortam adacıkları10,11,12,13kanıtlamış birçok anatomik siteler arasında yapıldı, 14. Ancak, intraportal adacık infüzyon klinik seçim nedeniyle kısmen yordamı göreli kolaylığı oldu ve6hayvan erken başarı modelleri. Ayrıca, kısmen, negatifleri ilişkili ile bu site, özellikle büyük erken adacık kaybı vardı daha az anlaşılan ve daha az alan olarak deneysel adacık nakli ilk günlerinde sınırlama olgunlaştı. Damar içi adacık infüzyon uzakta olduğunu belirten daha yeni zorlayıcı kanıtlarla omentumun yeniden ortaya çıkan hücre transplantasyonu için potansiyel olarak değerli bir site olarak idealdir.
Omentumun (omental bir kese şeklinde) karaciğer15,16göreli avantaj sunar. İyi bozukluklarına ve kolayca erişilebilir. Greft (gerekirse) ve/veya biyopsi alınmasını sağlar. Tarafından adacıkları deneyimli iskemik dönem karaciğer ile karşılaştırıldığında azalır ve omentumun nispeten intraportally, bir artış nerede portal basınç mümkün değil büyük adacık kitleler komplikasyonlara neden olabilir kabul edebilir.
Bir syngeneic fare modeli nakli C57BL/6 erkek fareler arasında 6 – 8 haftalık 20-25 g. adacık alıcılar ile streptozotocin tek bir enjeksiyon 250 doz ile diyabetik hale vücut ağırlığı ile istihdam çalışmada test protokolü kullanıldı mg/kg IP. Kan şekeri düzeyini fare enjeksiyon sonra 24 mmol / M 48 h büyüktür ve bu düzeyi en az 5 gün için yukarıda hala diyabet indüksiyon başarılı kabul edilebilir.
Syngeneic adacıkları yaş eşlemeli bağış bazı değişikliklerle daha önce yayımlanmış yöntemleri takip pankreas dan izole edildi. Kısacası, collagenase safra kesesi safra kanalını yerine içine enjekte ettiler. Bu enjeksiyon kolaylığı kolaylaştırmak için bir gelişme yapıldı. Collagenase infüzyon kuluçka, doku bozulması, yoğunluk gradient ayırma tarafından izlenen ve el-toplama saf adacıkları elde etmek için. Adacıkları gecede ile % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) 37 ° C'de T175 şişeler içinde küçük takıma CMRL-1066 ortamda kültürlü % 95 hava - %5 CO2 nakli önce.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada kullanılan tüm fareler tıbbi hayvan merkezi Guangdong eyaleti elde edilmiştir. Hayvanlar kullanımı hayvan refah ilkelerine uygun olarak etik İnceleme Komitesi, Shenzhen ikinci halk Hastanesi tarafından kabul edildi.
1. adacık nakli için omentumun
Not: Bu protokol gerçekleştirmek 2 kişilik gerektirir.
- Tablo 1' de listelenen cerrahi malzemeleri bir araya getirin. Perdeler ve tek kullanımlık gibi steril malzemeler ile cerrahi alanındaki aseptik alan hazırlamak ve cerrahi aseptik koşullarını korumak. Tüm cerrahi aletler sterilize. Steril önlük giymek.
- Stereomicroscope altında 200 µL pipet ucu kullanarak adacıkları seç. Her fare 450-500 adacık eşdeğer (IEQ) tansplant ücret alacaksınız. Her hayvan için yeterli adacıkları tek nakli için CMRL-1066 orta 100 µL ile steril 1,5 mL ek-üst tüp içine koyun.
Not: Adacıkları nakli günü izole, ama onları kurtarmaya yalıtım işlem için izin verecek bir gün önce yalıtmak daha iyi. - Buzda adacıkları ile ek alıcı tüpler nakli için hazır kadar tutun.
- Membran matris hidrojel çözülme ve -20 ° C dondurucudan çıkardıktan sonra buz üzerinde tutun. Hidrojel sıvı 4 ° c ile 10 ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda katılaşır.
- Tartmak ve tüm diyabetik alıcı fare etiket. 60 mg/kg Fentobarbital sodyum intraperitoneally enjekte et. Test bir ayak çimdik yönetmek anestezi derinliği. Bir ek 10 mg/kg Fentobarbital sodyum hayvan için çimdik tepki vermek. Eğer hiçbir anestezi ameliyat için doğru seviyesidir refleks, geri çekilin.
- % 70 etanol kullanarak Karin cerrahi ücreti temizle. Saç sitesinden bir razer bıçak ile tıraş ve Iodophor ile alanı dezenfekte. Veteriner merhem kuruluk anestezi iken altında önlemek için gözlere yönetmek.
- Oftalmik makas sol tarafa bağırsak karın orta çizgi boyunca karın bir kesi 4-5 cm. hareket ile açmak için kullanın ve cerrahisi prosedürü sırasında aşırı su kaybı önlemek için tuz batırılmış gazlı bezle kapak.
- Pamuk temizleme bezi tam olarak görme alanı mide ortaya çıkarmak ve (mide yer alan) omentumun bulmak için kullanın. Omentumun distend için iyi forseps iki çift kullanın. Yırtılma gelen hasarı önlemek için dikkat ediniz.
- Hidrojel tamamen bu noktada çözdürülen. 30 adacıkları ile tüp spin 200 g ve Kaldır süpernatant x s. Hidrojel 50 µL Aspire edin, adacıkları içeren tüp ekleyin ve karışımı yavaşça kabarcıklar oluşumunu önleme resuspend. Buz üzerine boruları işlem sırasında tutmak.
- Forseps iki çift omentumun kenarları al ve yavaşça bir oluk adacık nakli ile sıvı hacmi çok küçük kapasiteli bağırsak ve mide duvar arasında forma yükseltmek için kullanın.
- İkinci kişi yordamda yardımcı olmak ve resuspended adacık-hidrojel karışımı (tüp tüm içeriğini) 200 µL pipet ucu ile Aspire, oluk içine içeriği teslim izin.
- Karışım iyi oluk içine yavaşça yükselterek veya omentumun kenarlarını düşürücü konumlandırıldığından emin olun. Tam karışımı hidrojel önce 3 dakika içinde konumlandırma vücut ısısı bir etkisi olarak dönüşür. Hidrojel kurmasından sonra omentumun greft kapsayacak şekilde katlayın.
Not: hidrojel katılaşır gibi omentumun çevreleyen gastrik duvar için uygun olacaktır. - Sonra hidrojel tamamen katılaşmış, pamuk temizleme bezi bağırsak nakli sitenin dokunmak dikkat çekici geri karın boşluğuna, yeniden konumlandırmak için kullanın.
- Sefalosporin 20 µL ekleyin (5 ~ 10 mg) enfeksiyonu önlemek için karın boşluğuna sonra 4-0 dikiş karın kapatmak için kullanın.
- Fareyi onun kafes dönmek ve her fare alıcı için tüm adımları yineleyin. Fareler sıcak tutmak ve onlar tamamen sternal recumbency korumak için yeterli kendine gelmek kadar görsel olarak izleme. Tamamen iyileştin mi kadar fareler diğer hayvanlardan ayrı tutun.
- 50 µL sülfadiyazin sodyum (0,05 mg/mL) ameliyat sonrası profilaksi olarak bir hafta boyunca her gün enjekte. Yönetmek bölgelerelidokain + buprenorfin, yani uygulamak 1-3 damla % 0.25 bölgelerelidokain topikal önce yerleştirme yara klip kesi yerinde. Yönetmek Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) mayi (IP) yolu ile.
- Sigara açlık kan şekeri düzeyini bir kan şekeri ölçüm cihazı kullanarak kuyruk-damar kan örneği üzerinden ölçmek nakilden sonra günde bir kez. Omentumun için dikim zaman adacık nakli gecikmiş bir işlevi vardır ve tamamen normal kan şekeri düzeyi 2-3 hafta boyunca ulaşamadığı.
- Histoloji için omental greft nakli sonrasında deney sonunda fare kaldırın. Histolojik protokolleri göre doku düzeltmek. Greft immunostaining veya ayirt çalışmaları için analiz edilebilir.
2. alternatif yöntem nakli için omentumun için
Not: oda sıcaklığında kullanılan bir alternatif fibrin-Trombin hidrojel membran matris hidrojel için yerine olabilir. 2 bileşenlerden bir fibrin mühürleyen protein çözüm (50 U/mL Trombin ve 10 mg/mL Fibrinojen) oluşur. Bileşenler karışık zaman onlar adacıkları yerinde tutan bir kan pıhtısı oluşturur.
- Fibrin thombin hidrojel bileşik oda sıcaklığında kullanın. Adım 1.2 olduğu gibi her fare nakli başına 450-500 adacık eşdeğerleri (IEQ) alacaksınız. CMRL-1066 orta 100 µL ile steril 1,5 mL ek-üst tüp adacıkları yerleştirin. Hemen 10 cm uzunluğunda için steril bir PE50 boru içine adacıkları nakli önce Aspire ve yavaşça santrifüj kapasitesi (30 s 200 x g) gevşek Pelet oluşturmak için.
- Hayvan yayılmış omentumun ile (adımları 1.5-1.8) belirtildiği gibi hazırlayın. Hidrojel bileşenleri (10 µL/her) mix ve omentumun yerleştirin. (Şekil 3D)
- Hemen adacıkları boru hidrojel üzerine gelen sınırdışı. Hidrojel adacıkları etrafında pıhtı oluşturur. (Şekil 3E)
- Omentumun hidrojel ve bir kese şeklinde adacıkları üzerinde kat. (Şekil 3F) 1,13 1,18 adımlara devam edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Pankreas Post-digestive durumunu Şekil 1Aile gösterilir. Arıtılmış adacıkları Şekil 1Badımında gösterilir. Dithizone boyama ve canlılığı adacıkları test Şekil 2' de gösterilmiştir. Adacık nakli ana adımları omentumun için Şekil 3' te gösterilmektedir. Kan şekeri düzeyleri alıcılarının omental nakli sonra Şekil 4' te gösterilmiştir. Greft his...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Portal ven yoluyla karaciğere adacık nakli en yaygın olarak kullanılan yöntem adacık nakli, insanlarda, ama hala portal ven trombozu ve karaciğer yağlanma17gibi verimlilik ve güvenlik endişeleri vardır. Son araştırmalar, omentumun karaciğer ama önce klinik çeviri12,14,18,19yapılacak daha fazla araştırma ihtiyacı için uygun bir alternatif olabilir göstermektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları rapor.
Teşekkürler
Bazı yazarlar bu eserin kısmen ulusal anahtar R & D Çin programı (2017YFC1103704), Sanming proje tıp Shenzhen (SZSM201412020), yüksek düzey tıbbi disiplin inşaat, Shenzhen (2016031638) için fon gelen hibe tarafından desteklenen edildi Shenzhen Vakfı Bilim ve teknoloji (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Vakfı Sağlık ve aile planlaması Komisyonu (SZXJ2017021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü> | |||
| 5 inç (12-13 cm) Makas | RWD Life Science | S12030-11 | |
| İnce Forseps | RWD Yaşam Bilimleri | F11010-13 | |
| Küçük yara klipsleri | RWD Yaşam Bilimleri | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Yaşam Bilimleri | F31044-13 | |
| 2 çift doku forseps | RWD Yaşam Bilimi | F13023-10 | |
| 4-0 İğneli sütür | Chenghe, Çin | 17094 | |
| 200 & mu; L Pipet ve uçlar | Gilson | PN11 | |
| Tek Dokunuşla ultra kolay Temel kan şekeri izleme sistemi | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| tıraş bıçağı | Philips | HC1099/15 | |
| Malzeme ve hayvanlar | |||
| Pentobarbital Sodyum | Sigmaaldrich.com | P3761 | Anestezi için |
| Hidrojel | bdbiosciences.com | 356234 | Bazal Membran Matriks |
| Fibrin-Trombin Hidrojel | Baxter.com | 1501250 | Bileşenler karıştırıldığında pıhtılaşır |
| %70 Etanol | Yingniu medikal, Anhui, Çin | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang tıbbi teknolojisi, Shangdong, Çin | 170521 | |
| Normal salin | Baxter.com | 2B1324 | |
| Sefalosporin | Lukang tıbbi, Shangdong, Çin | 150303 | |
| Sefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| kayganlaştırıcı göz merhemi | 203964 Sigmaaldrich.com | ||
| C9262 | |||
| CMRL-1066 medya | celltrans, Wenzhou, Çin | X018D1 | |
| yoğunluk gradyanı | |||
| PE50 boru | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polietilen .023 "x .038 |
| Calcein | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iyodür | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | gömme orta |
| insülin antikoru | Hücre Sinyal Teknolojisi, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoksilen boyama ortamı | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eozin boyama ortamı | Beyotime Biotech, Çin | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl / 6 | Guangdong Eyaleti Fare Tıbbi Hayvan Merkezi | / | |
| Fetal Sığır Serumu | GE Sağlık Yaşam Bilimleri | SH30084 | |
| T175 şişeleri | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Geçmeli tüpler | Axygen | MCT-150-C |
Kaynaklar
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
