Method Article

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polisakkarit kapsülü Cryptococcus neoformans, birincil virülans faktörü olduğunu ve onun büyüklüğü zorlanma virülans ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kapsül çapı ölçümleri fenotipik test ve tedavi edici etkinliği ölçmek için kullanılır. Burada kapsül indüksiyon için standart bir yol sunulmaktadır ve boyama ve çapı ölçmek için iki yöntem karşılaştırılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptococcus neoformans polisakkarit kapsülü birincil virülans faktörü olduğunu ve en sık bu patojenik Maya yönlerini okudu. Kapsül boyutu çok suşları arasında değişebilir, stresli ya da düşük besin koşulları tanıttığında hızla büyümeye yeteneğine sahiptir ve olumlu zorlanma virülans ile ilişkili. Bu nedenlerden dolayı kapsül C. neoformans araştırmacılar büyük ilgi boyutudur. C. neoformans kapsül büyüme fenotipik test sırasında farklı tedaviler suşları Maya veya boyutu farklılıkları üzerinde etkileri anlamak için indüklenen olduğu. Burada biz boyama ve kapsül Çap ölçüm kapsül indüksiyon ve karşılaştırma iki yöntemden kabul edilen standart yöntemlerden birini tarif: (i) çini mürekkebi, konvansiyonel ışık mikroskobu ile birlikte ve (ii) ile birlikte boyama kullanılan negatif bir leke kapsül confocal mikroskobu tarafından takip ve hücre duvarı floresan boyalar. Son olarak, biz nasıl Hindistan mürekkep lekeli örneklerinden kapsül çap ölçümü-ebilmek var olmak göstermek sayısal görüntü analizi kullanarak otomatik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeyrek milyon insan her yıl etkileyen ve her yıl daha fazla 180.000 ölümle sonuçlanan, Cryptococcus neoformans patojen, hücre içi mantar ve Kriptokokkoz1,2, hastalığının olduğunu 3. zor hit antiretroviral tedavi, hazır erişim onları akut hastalık4,5,6duyarlı hale sahip olmayan HIV pozitif hastaların yoksul ülkelerde vardır. CDC verileri alt ve Sahra Afrika, C. neoformans tüberküloz daha fazla insan her yıl ve daha fazla her ay herhangi bir Ebola salgını kayıt1daha öldürdüğünü gösteriyor. Maruz kalma en yaygın yol çevre7olağan hale kabuktan sporlar teneffüs edilmesi oluşur. Akciğerlere girdikten sonra C. neoformans başarı enfekte bireylerin içinde katkıda birkaç virülans faktörleri vardır. Acapsular suşları öldürücü8değildir olarak polisakkarit kapsülü mikrop'ın birincil virülans faktörü olarak kabul edilir.

Cryptococcal kapsül üç ilke bileşenlerini yapılır: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) ve mannoproteins (MPs)9. MPs kapsül görece küçük bir hücre duvarı ilişkili bileşeni olmakla birlikte, bunlar immunojenik ve çoğunlukla pro-inflamatuar yanıt9,10yükseltebilirsiniz. Buna ek olarak, kapsül toplu GXM ve GalXM yapmak (> ağırlıkça % 90'ı) ve immünsupresif etkileri11var. İmmunomodulatory etkileri yanı sıra, kapsül vivo içinde hızlı genişleme ana bilgisayar Fagositik hücreleri (Yani, nötrofiller ve makrofajlar)12tarafından yenmesi için mekanik bir engel oluşturur. C. neoformans kapsül ve onun sentez karmaşık olmakla birlikte, genel olarak, artan kapsül çapı artan virülans6,13,14ile ilişkilidir. Bu göz önüne alındığında, hızlı ve doğru kapsül ölçümleri ölçmek muktedir C. neoformans araştırmacılar için önemlidir.

C. neoformans hücre ve onun polisakkarit kapsülü dinamik yapıları ve zaman15üzerinde değişiklikler göstermektedir. Kapsül yoğunluğu, boyutu ve derleme değişiklikler ana bilgisayar ortamı16,17,18değiştirebilirsiniz. Düşük demir veya besin düzeyleri, serum, insan fizyolojik pH ve artan CO2 kapsül büyüme16,18,19,20başlatmak için bilinir. Ayrıca, araştırmacılar21,22ana bilgisayar üzerinde bir avantaj- C. neoformans için kredi immunoreactivity önemli farklılıkların kaynaklanan enfeksiyon sırasında yapısal değişiklikler göstermiştir. C. neoformans kapsül mimarisini çeşitli şekillerde analiz etti çünkü bu bilinir. Elektron mikroskobu, örneğin, kapsül bir dış, daha geçirgen katman23altında iç bir elektron yoğun tabaka ile heterojen bir matris olduğunu ortaya koymuştur. Işık saçılma ve optik cımbız kullanımını daha da onun makromoleküllerin özellikleri24aydınlatmak araştırmacılar sağladı. Her iki statik ve dinamik ışık saçılma ölçüm sonuçlarını analiz, polisakkarit kapsülü karmaşık bir dallanma yapısı23olduğunu biliyoruz. Optik cımbız yapısına Sertlik test gibi onun antikor reaktivitesi24değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, şimdiye kadar en sık istihdam C. neoformans kapsül boyutu ölçüm analizidir.

Kapsül boyutu ölçmek için araştırmacılar ne-meli var olmak basit bir ölçüm kullanın: kapsül doğrusal çapını. Digital mikroskoplar birden fazla C. neoformans hücre (genellikle yüzlerce) çini mürekkebi veya floresan boyalar ile lekeli görüntülerini yakalamak için kullanılır. Her hücre vücut ve çevresindeki kapsül boyutu ölçülür. Veriler derlenmektedir ve kapsül ortalama çapı tüm cep telefonu çapı (hücre vücut + kapsül) üzerinden cep gövde çapı çıkarılarak hesaplanır. Şu ana kadar bu ölçümler el ile yapılmıştır. Genel olarak doğru olsa da, bu yöntem araştırmacılar için dezavantajları vardır. Büyük veri kümeleri gün almak ya da el ile çözümlemek için hafta. Ve bu ölçümler el ile yapılır çünkü, öznellik ve insan hatası sonucu etkileyebilir.

Otomatik hesaplama görüntü analizi biyolojik görüntüleri 25,26,27daha hızlı ve daha güvenilir analizini sağlayan moleküler hücre biyolojisi, birçok alanda araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kesin görüntü analizi teknikleri ne çoğu zaman karmaşık ve büyük veri kümeleri üzerinden nicel bilgi benim gereklidir. Ancak, bazı ölçümler, C. neoformans kapsül, özellikle ölçüm otomatikleştirmek zor olmuştur. Doğru bir şekilde hücre duvarı ve genellikle tarafından faz kontrast mikroskobu görüntüsü zaman karanlık bir halka olarak görünen, kapsül, arasındaki arabirimi tanımlayan basit bir eşik kullanarak çözmek zahmetli olabilir. Ayrıca, C. neoformans hücre kültüründe birlikte yığın eğilimindedir ve hücrelerinin doğru segmentasyon doğru ölçümler için gereklidir.

Bu projenin amacı (i) C. neoformans, (ii) karşılaştırın ve kontrast çini mürekkebi kapsül indüksiyon için standart iletişim kuralları göstermek için yapıldı ve floresan boyama çapı ölçümleri, kapsül ilgilidir (III) geliştirmek basit, Hindistan mürekkep lekeli bir görüntü analiz yazılımı ve (iv) kullanarak hücreleri görüntülerini kullanarak kapsül çapı ölçmek için hesaplama yöntemleri faydaları ve kısıtlamaları el ile kapsül Çap ölçüm ve yazılım Otomasyon kullanarak değerlendirmek. Biz bu iki boyama yöntemleri, hücre duvarı ve kapsül etiketleme floresan bulmak, daha uzun sürmesine iken, sağlanan deneyler arasında en tutarlı sonuçlar. Ancak, her iki yöntem başarılı bir şekilde ayırt etmek için bize etkin laboratuar ve klinik C. neoformans arasında farklı sergilenmesi suşları boyutları kapsül. Ayrıca, Hindistan mürekkep lekeli görüntüler üzerinden kapsül çap ölçümü otomatikleştirmek ve bu kapsül manuel ölçüm bir alternatif bulundu ki başardık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: C. neoformans seviye 2 (BSL-2) patojen ve bu modülle çalışmanın araştırmacılar gerekli önlemleri almalıdır. Ayrıntılı yordamlar nasıl için güvenli bir şekilde BSL-2 patojenler ile İş Merkezi hastalık kontrolü için (CDC) bulunabilir üzerinde web sitesi, ama tüm kişiler C. neoformans temas geliyor düzgün işlemede eğitimli unutmayın patojenik ajanlar ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE), genellikle lateks veya nitril eldiven giymek gerekir. Ayrıca, santrifüjler rotorları Kloroformu örnekleri ve hemen bir % 10 çamaşır suyu çözüm28kullanarak temizleyelim herhangi bir sızıntıları önlemek için kapalı olmalıdır.

1. kapsül indüksiyon

Not: Tüm adımları oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilmesi gerekiyor.

  1. C. neoformans Maya pepton dekstroz (YPD) suyu (pH 6,5 +/-0.2) içinde kültür ve 37 ° C'de log fazı (yaklaşık 18-36 h) onlar kadar sallayarak ile kuluçkaya.
  2. 870 x g 21 ° C'de 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayın.
  3. Hücreleri saymak ve 2 x 105 hücreleri/2 mL Dulbecco'nın en az temel medya (DMEM), resuspend için bir hemasitometre (veya bir otomatik hücre sayaç) kullanın.
  4. Kapsül ikna etmek için 37 ° C ve % 5 CO2 18 h için kuluçkaya.
    Not: Medya besin yokluğu ve CO2 varlığı ile birlikte C. neoformans kapsül büyüme uyarır.
  5. Sonrası kuluçka, hasat hücreleri (yukarıdaki gibi) centrifuging ve tüm ama 5-10 µL süpernatant kaldırma. Aynı zamanda, karşılık gelen bir un indüklenen hücre örneği ölçülecek her zorlanma için hasat. Bunlar negatif denetimleri kullanın.
    Not: Hücre topakları çok küçük olacaktır ve görmek zor olabilir. Süpernatant alıyorum dikkatli olun.
  6. Hindistan mürekkep (Kısım 2.1) veya floresan boyalar (Bölüm 2.2) ile leke.

2. boyama

  1. Sadece çini mürekkebi ile boyama
    1. Çini Mürekkebi ile Maya leke için Pelet kalan süpernatant içinde resuspend ve 4μL ekleyin (yaklaşık yarısı) hücre süspansiyon ve çini mürekkebi bir cam mikroskop slayt üzerine 4μL. Yavaşça karıştırın ve köpük önlemek.
    2. 13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve kenarları örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) ile mühür.
  2. Sadece floresan boyalar ile boyama
    1. Maya ile floresan bir boya lekesi için 50 µL PBS % 1 sığır serum albumin (BSA) ile hücre Pelet resuspend.
    2. Kültür Calcofluor beyaz (CFW) eşit bir birimdeki kuluçkaya (1 µg/mL) ve kapsül mAb 18B7 AlexaFluor488 için Birleşik ( Tablo malzemelerigörmek) (AF488) (10 µg/mL) 37 ° C'de 30 dk
    3. 870 x g 21 ° C sonrası kuluçka, 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
    4. Hücre Pelet 10 µL PBS % 1 sığır serum albumin (BSA) ile resuspend.
    5. Hücre süspansiyon üzerine cam mikroskop kaymak 8 µL pipet.
    6. 13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve kenarları örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) ile mühür.
  3. Çini Mürekkebi ve floresan boyalar ile boyama
    1. Daha doğrudan bu floresan boyalar boyama çini mürekkebi etkinliğini karşılaştırmak için her iki tür leke ile aynı hücre nüfus co leke. Bunu yapmak için önce hücreleri floresan kapsül ve hücre duvar boyası, adımları 2.2.1 - 2.2.3 göre kuluçkaya.
    2. Ardından, eşit miktarlarda (4 µL) fluorescently lekeli hücre süspansiyon ve çini mürekkebi bir cam slayt üzerine pipet. Hafifçe karıştırın.
    3. 13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) kenarları mühür.

3. görüntü edinme/mikroskobu

  1. Hücreleri Imaging çini mürekkebi ile lekeli.
    1. Standart bir ışık mikroskobu (100 X büyütme) kullanarak görüntüleri elde etmek.
    2. Koşul başına 50 hücreleri en az görüntü.
      Not: Alan başına hücre sayısı değişiklik gösterir, bu da kabul edilebilir. Bu önemli, ancak, bu örtüşen hücreleri en azından bu (el ile ve otomatik yazılım ile) ölçmek zor olarak tutulur. Bu deneyler için görüntüleri 16 bit bir derinlikte hücreleri küçük hareketlerle kaynaklanan bulanıklık en aza indirerek görüntü kontrastı en üst düzeye çıkarmak için optimize pozlama süreleri ile elde.
  2. Hücreleri Imaging ile floresan boyalar lekeli
    1. Hücreleri tarafından floresan mikroskopi olabilir görüntü için düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop açın ve kullanılan fluorophores için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında seçin (CFW ve AF488 heyecan 405nm ve 488 nm ışık, sırasıyla kullanarak). Floresan mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek.
    2. Koşul başına 50 hücreleri en az görüntü.
      Not: Alan başına hücre sayısı değişiklik gösterir, bu da kabul edilebilir. Bu önemli, ancak, bu örtüşen hücreleri en azından bu (el ile ve otomatik yazılım ile) ölçmek zor olarak tutulur.
    3. Bir z-yığın görüntü serisi hücrelerin belirli bir alan içindeki her hücre için maksimum kapsül çapı elde emin olmak için kazanmak.
      1. Mikroskop kontrol yazılımı "z-yığın" çubuğunda "z-yığın" Denetim Masası'nı açın ve sonra panelin sol üst köşesine "İlk/son" seçeneğini tıklatın.
      2. Mikroskop odak fine-odak denetimde bir tek Maya hücre ve kapsüller için tüm geçerli görüş alanı içinde en geniş amacı aşağıda ve "İlk ayarla"'ı tıklatın bir seviyede kullanın.
      3. Yukarıda aynı hücreyi ve kapsül hücre vücudun en geniş noktası odak fine-odak denetime tüm geçerli görüş alanı içindeki hücreleri ve "Son Set"'ı tıklatın.
      4. Sonra "Deney başlamak" z-yığın geçerli pozisyon için elde etmek için "Satın alma" sekmesinde tıklatın. Z-yığın görüntüleri en az 50 hücre elde kadar birden fazla pozisyonlarda işlemi yineleyin.
        Not: Bu deneyler için 1.0 için confocal iğne deliği kuruldu AU ve çakışan bir z-serisi 0.7 µM kapsayan 10-20 dilim seçili konumlarda elde. AU = havadar adet.
    4. Ardından, her z fiş serisi uygun görüntü analiz yazılımı kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) dönüştürün.
      Not: MIPs her uçak yığılmış resim29en büyük yoğunlukta proje. MIPS oluşturma bir en fazla hücre ve kapsül çapı yakalanan 3-b yığın içinde karşılık gelen resimleri bir 2-B temsil üretmek izin verir.
  3. Hücreleri Imaging çini mürekkebi ve floresan boyalar ile lekeli
    1. Widefield (40 X büyütme) veya confocal mikroskop kullanarak görüntüleri (63 X veya 100 X büyütme). Çini Mürekkebi ve floresan boyalar ile lekeli hücreler için bir bilgisayar kontrollü sahne ve yağı daldırma amacı ile donatılmış bir widefield mikroskop kullanarak çekim.
      Not: Mikroskop kullanımda bir görüntüleme yazılımı CFW kullanarak kontrol edilmelidir. 340-380 nm uyarma filtreden heyecanlı ve ışık yayılan Floresans 400 nm dikroik ayna dan yansıyan bir 435-485 nm bariyer filtresi ile tespit edilmelidir. AF488 floresan 465-495 nm uyarma filtreden heyecanlı ve verilmiş ışık 505-nm dikroik ayna dan yansıyan bir 515-555 nm bariyer filtresi ile tespit edilebilir.
    2. Resim Boyama her yöntem için koşul başına 50 hücreleri en az.

4. el ile ölçüm-in kapsül

  1. Çini Mürekkebi veya floresan lekeleri ile lekeli hücre için bir hücre ölçüm yazılımı el ile ölçü kapsül ve hücre çapı için kullanın (bkz. Tablo malzeme). Bunu yapmak için "Dosya" gidin > "Görüntü aç" > "Ölçü" ve tüm cep telefonu (Toplam çap) en geniş anlamı ile düz bir çizgi çizmek için kullanabilirsiniz imleç.
  2. Ardından, "Ölçü" yeniden tıklatın ve hücre vücut (hücre gövde çapı) düz bir çizgi çizin.
    Not: Ölçüler otomatik kaydedilen-hücreleri.
  3. Tüm hücreleri (en az 50/grup) için bu işlemi yineleyin.
  4. Bir kez onlar ölçülür görüntüleri kaydetmek için "Dosya"'ı tıklatın > "Farklı Kaydet" ve görüntüleri uygun şekilde adlandırın.
  5. Yeni ölçülen dosyaları seçin ve verileri bir elektronik tablo yazılımı için verin.
  6. Ortalama kapsül çap eşitliği kullanarak hesaplar: ([Toplam çapı] - [hücre gövde çapı]).

5. otomatik ölçüm kapsül

Not: başarılı otomatik ölçüm için 16-bit görüntüleri yüksek karşıtlık kullanın ve bir uygun görüntü analiz yazılımı ile birlikte düzgün odaklı ( Tablo malzemelerigörmek). C. neoformans kapsül ölçüm için Imaging zaman, hücre duvarı ve kapsül arasında sınır karanlık yüzüğe odaklanmak önemlidir. Bu doğru hücre ve kapsül betimlemek için yazılım sağlar.

  1. Ters çevir ve tüm çini mürekkebi hücre görüntüleri uygun bir görüntü düzenleme yazılımı kullanarak lekeli bir kopyasını oluşturun (bkz. Tablo malzeme). Bunu yapmak için "Dosya" tıklayın > Hindistan mürekkep lekeli görüntüleri açın ve sonra "kontrol" için "açık" + "I" görüntü ters çevirmek için. "Dosya" > "Ters görüntü kaydetmek için farklı kaydet".
  2. Hem özgün ve ters almak için "Dosya" görüntü içine belgili tanımlık bilgisayar yazılımı tıklatın > "Alma sırası" > "Yük görüntü" > "Tanımla sıra (el ile)" > "Boyutlar (kanal)" > "Al" > "Uygula".
    Not: C. neoformans hücre organları ve kapsül belirlenebilir ve özel algoritmalar 'yemek tarifleri' yazılımı dahil - olarak anılacaktır - kullanarak maskeli.
  3. Algılamak ve hücre vücut maske ters görüntü 'Koloni Analyzer (floresan)' tarifi kullanın, sonra "Uygula"'ı tıklatın. Ters görüntü C. neoformans Hücre kenarlığını tanımlama karanlık halka çevreleyen kapsül parlak olur.
  4. 'Koloni Analyzer (floresan)' tarifi ters görüntü onların kapsül C. neoformans hücre vücutlarından segmentlere ayırmak, o zaman tıkırtı "Uygula" için kullanın. Bu sayım maskesi oluşturur. Bu sayım maskesi "Hücre beden" yeniden adlandırın "sayım maskesi" etiketli sekmesini sağ tıklatarak.
    Not: Tarifi birden fazla görüntü adımları işleme oluşur: arka plan kaldırma, nesne algılama, nesne ayırma ve alt filtreleme.
  5. Ardından, 'Hücre çoğalması' tarifi üzerinde orijinal görüntü tespit ve kapsül maske kullanmak ve "Uygula"'ı tıklatın. Bu sayım maskesi oluşturur. Bu sayım maskesi "Kapsül" yeniden adlandırın "sayım maskesi" etiketli sekmesini sağ tıklatarak.
  6. Tarifi, 'Kapsülü Bölüm' kullanarak oluşturmak birbirinden bitişik kapsül bölümlemek için orijinal görüntü üzerine yeni bir maske. Bunu yapmak için tarifi açılan menüden "Kapsül bölümü"'yi tıklatın. Kapsül bölüm kutusunda kapsül bölge için şimdi yeniden adlandırılan sayım maskesi "Kapsül" (5.5) seçin. Şimdi yeniden adlandırılan sayım maskesi "Hücre beden" Kripto hücreleri (5,4) seçin. Giriş kanalı ve "Partitioned Kapsül oluşturma maskesi. için"Orijinal"seçin "Uygula'yı tıklatın
    Not: Tarifi hücre ve hücre ve kapsül ve alan ölçüleri Merkezi algılama maskeler geçerken en uzun ve en kısa eksen ortalama olarak tanımlanan kapsül çapı oluşturur. Bu yazılım elektronik tablo sekmesinde altında bulunan çıkış bulmak. Tüm resimler (en az 50 hücreler/grubu) için bu işlemi yineleyin. Tarifi'nın parametreleri algılama bireysel görüntülerin optimize etmek için ayarlanmış veya birden fazla görüntü toplu tespiti için en iyi duruma getirilmiş olabilir. Ek ölçümler hücre ve kapsül'ın Morfoloji kapsamlı karakterizasyonu için reçete tarafından hesaplanır.
  7. Verileri daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo yazılım için verin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsül: indüksiyon, hücre boyama, görüntü ve ölçüm teknikleri, biz üç soy-in çizgisiyle C. neoformans: ortak, iyi karakterize laboratuvar zorlanma, H99S30ve iki klinik olarak izole soyu daha önce Bilinmeyen kapsül çapı, B18 ve B5231.

İş akışı kapsül indüksiyon, boyama ve çini mürekkebi kullanarak resim alma şekil 1Aile gösterilir. Görüntüleri ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

On yıl için kapsül mycologists ve klinisyenler C. neoformans ve Kriptokokkoz patojen büyük virülans faktörü olarak rolü nedeniyle ilgi için araştırma önemli bir odak noktası olmuştur. Mikroskopi için kullanılması kapsül boyutu suşları arasında farklılıklar ölçmek ve farklı gelişim altında koşullar patojen ve yanıtları (örneğin, farklı çevre koşulları, çeşitli uyaranlara hakkında önemli bilgiler sağlar potansiyel ilaç tedavileri, vb) burada, biz C. neoformanskapsüle büyümesini teşvik iç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, Hoyin Lai, otomatik görüntü analiz yazılımı, Aivia yayımladığı DRVision, ürün yöneticisidir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz moleküler Biosciences (MOBI) doktora programı ve Biyoloji bölümü Middle Tennessee Devlet Üniversitesi (MTSU) adlı bu çalışma için finansman sağlamak için teşekkür ederiz. Proje aynı zamanda kısmen D.E.N. için MTSU Vakfı tarafından verilen bir özel projeler hibe tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kapsül İndüksiyonu
C. neoformans hücreleriKlinik laboratuvar suşu H99S, Dr. John Perfect'in (Duke Üniversitesi) nazik bir hediyesiydi. Klinik suşlar, B18 ve B52, Dr. Greg Bisson'un (Pennsylania Üniversitesi) nazik hediyeleriydi.
Maya Pepton Dekstroz Suyu (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Bu, laboratuvarda standart tarif (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) kullanılarak
yapılır.DMEM/L-glutaminli yüksek glikoz, sodyum piruvat içermezGE Yaşam BilimleriSH30022.01
6 oyuklu plakalarFalconCL5335-5EA
Çalkalama inkübatörüThermo Scientific MaxQ6000
CO2 inkübatörüFisher ScientificIsotemp
SantrifüjThermo ScientificLegend XTR
Boyama< / güçlü >
Mikrosantrifüj Termo BilimselEfsane Mikro 21R
Hindistan mürekkebiFisher Scientific14-910-56
Calcofluor beyazıSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 Alexafluor 488'e konjuge fare anti-GXM antikoruDr. Arturo Casadevall'dan (Johns Hopkins Üniversitesi) nazik bir hediye 
%1 Sığır Serum Albümini (BSA)PBS, %1 BSA eklenmiş ve filtre sterilize edilmiş yukarıda listelenen tarifin aynısıdır (satır 4).
Sığır Serumu AlbüminSigma-AldrichA9418
Superfrost mikroskop slaytlarıFisher Scientific12-550-143
Cam lamellerCorning2855-18# 1.5 kalınlık
Şeffaf oje veya diğer toksik olmayan dolgu macunu
< güçlü > Görüntü Edinme  < / güçlü >
Daldırma yağıCargille 16484
Daldırma yağ objektifli ışık mikroskobuZeissZeiss Axio A1 Planlı - NEOFLUAR 100x yağa daldırma NA 1.30 objektif
Işık mikroskobu kameraZeissZeiss Axiocam ErCD kamera
Yağa daldırma objektifli konfokalmikroskop ZeissLSM 700 lazer tarama Konfokal Plan-Apochromat 63X NA 1.4 yağa daldırma DIC M27 objektif ile donatılmıştır. nbsp;
Konfokal mikroskop yazılımıZen 2009
Konfokal mikroskop kamerası,Intensilight epifloresan aydınlatıcılı Nikon Nikon Ti-Eclipse (Nikon), CoolSNAP MYO mikroskop kamerası (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 yağa daldırma objektifi (Nikon) ve 1.5x büyütme değiştirici.
Geniş alan görüntüleme yazılımıNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Görüntü düzenleme yazılımıPhotoshop (Adobe)
Manuel ölçüm için mikroskop yazılımıAxiovision (Carl Zeiss)
Otomatik ölçüm için görüntü analiz yazılımıAivia (DRVision Teknolojiler)
Elektronik tablo yazılımıExcel (Microsoft)
içeren

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640(2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261(2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

Related Articles