Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti
Bu makalede
Özet
Özet
Protein-protein etkileşimleri keşfetmek için bizim yetenek hücredeki düzenleme bağlantılarını anlama anahtarıdır. Ancak, protein-protein etkileşimler birçok durumda tespiti önemli deneysel sorunlar ile ilişkilidir. Özellikle, sıralama reseptörleri kez deterjan duyarlı moda co-immunoprecipitation bu proteinlerin kullanılamaz yapar, membran bölmeleri Lümen içinde onların protein kargo ile etkileşim. Sıralama reseptör sortilin GLUT4 membran proteinlerinin arasındaki zayıf luminal etkileşimlerin bir örnek olarak hizmet verebilir glikoz taşıyıcı için bağlama. Burada, sortilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi doğrulamak için hızlı, basit ve ucuz bir tahlil açıklayın. Bunun için biz tasarladık ve kimyasal potansiyel sortilin bağlama epitope GLUT4 luminal kısmında karşılık gelen myc öğesini peptid sentez. Tagged ile altı histidines Sortilin memeli hücrelerinde ifade ve kobalt boncuk kullanarak hücre lysates izole. Üstündeki immobilize Sortilin peptid çözüm farklı pH değerlerinde ile inkübe ve eluted malzeme Western Blot tarafından analiz edildi. Bu tahlil diğer deterjan duyarlı protein-protein etkileşimleri çalışmaya kolayca adapte edilebilir.
Giriş
GLUT4 nerede insülin etkisi sonrası prandial kan glikoz izni1aracılık eder yağ ve kas hücrelerinde ağırlıklı olarak gösterilen bir glikoz taşıyıcı proteindir. Çok istikrarlı bir protein olmak, GLUT4 translasyon düzeyinde düzenlenir. İnsülin yokluğunda GLUT4 büyük ölçüde plazma membran (dolayısıyla düşük Bazal geçirgenliği glikoz için) gelen söz konusu değildir ve küçük insülin duyarlı veziküller (IRVs) hücre içinde ağırlıklı olarak yerelleştirilmiştir ve temsil etmek büyük olasılıkla trans-Golgi ağ (TGN) Irv donör bölüm. İnsülin yönetim, üzerine IRVs plazma zarı ile sigorta ve işleyişi siteye GLUT4 teslim. Bu glikoz alımı adiposit ve iskelet mi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. peptid işlenmesi
- Tasarım ve peptid sipariş
- Peptid istenen sırayı seçin ve myc epitope (EQKLISEED), onun ya da N - veya C-terminus gibi bir etiket ekleyin.
- Peptid suda peptid çözünürlük hesap makinesi http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php kullanarak tahmin edilen çözünürlük kontrol edin. Çözünürlük düşük ise, şarj dengeyi değiştirmek için başka bir suda çözünen etiket eklemeyi deneyin.
Not: Biz N terminus (Myc-fll-GLUT4) ilk luminal döngü (fll) için myc epitope (kalın yazı tipi) ile öğesini GLUT4, karşılık gelen peptid kullanılır: "iyi" tahmin edilen suda var EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTT....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lysates 3T3 L1 hücreleri stabil Sortilin-myc/O'nun5 ve WT 3T3 L1 hücreleri, bir negatif kontrol kullanılan transfected hazırlanmıştır. Her iki lysates kobalt boncuk pH 6 veya pH 8 ile inkübe edildi ve iyice yıkanır. Boncuk immobilize proteinler ile sonra Myc-fll-Glut4 çözümünde inkübe. Dikkatli yıkamadan sonra boncuk için bağlı proteinler 0.25 M Imidazole ile eluted. Örnekleri tabi, SDS-sayfaya degrade jel takip her ikisi de tespiti için sortilin-myc/O'nun izin Ant.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sortilin her iki sinyal plazma zarı ve hücre içi sıralama olaylar6,7dahil bir evrimsel korunmuş çok ligand protein reseptörü var. Ancak, deterjanlar için duyarlı olmak sortilin etkileşim bazı bağlama ortakları ile göründüğü gibi otantik sortilin'ın ligandlar (bazıları luminal veya integral membran proteinlerinin olan) için arama karmaşıktır. Bu nedenle, bir kolay ve protein-protein etkileşimleri, türleri çalışmak için yaygın bir yaklaşım co-immunoprecipitation, k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser DK52057 ve K.V.K. X.P için gelen NIH DK107498 kurumsal eğitim grant 2T32DK007201 NIH üzerinden tarafından desteklenen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Proteaz inhibitörü kokteyli | Sigma | P8849 | histidin etiket proteini |
| Fosfat Tamponlu Salin'in saflaştırılmasında kullanım için | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1 mL İnsülin Şırınga U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Test Kiti | Pierce | 23228 | |
| Yıkama tamponu | Boston BioProducts | BP-234 | His-tag protein saflaştırması için |
| HisPur Kobalt Reçine | Thermo Scientific | 89964 | |
| Trisin numune Tamponu | Bio-Rad | SDS ile 161-0739 | , bMerkaptaetanol Elution eklenmelidir |
| Tampon Boston BioProducts | BP-236 | 250mM İmidazol | |
| Mini-Protean Tris-Tricine prekast jeller ile His-tag protein saflaştırması için% 10-20 & nbsp; | Bio-Rad | 456-3115 | Peptit ve küçük protein |
| Tris/Trisin/SDS çalışma tamponunun ayrılması için | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Tamponu | Boston BioProducts | BP-190 | 20 metanol Nitroselüloz |
| membran ekleyin & nbsp; 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Sığır Serumu Albümin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antikor | Hücre Sinyalizasyonu | 2272 | Tavşan |
| Peptit | Genscipt | Siparişi özelleştirmek | |
| Precision Plus Protein Çift renk Standartları | BioRad | 161-0374 |
Kaynaklar
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
