Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Summary

Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Abstract

Protein-protein etkileşimleri keşfetmek için bizim yetenek hücredeki düzenleme bağlantılarını anlama anahtarıdır. Ancak, protein-protein etkileşimler birçok durumda tespiti önemli deneysel sorunlar ile ilişkilidir. Özellikle, sıralama reseptörleri kez deterjan duyarlı moda co-immunoprecipitation bu proteinlerin kullanılamaz yapar, membran bölmeleri Lümen içinde onların protein kargo ile etkileşim. Sıralama reseptör sortilin GLUT4 membran proteinlerinin arasındaki zayıf luminal etkileşimlerin bir örnek olarak hizmet verebilir glikoz taşıyıcı için bağlama. Burada, sortilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi doğrulamak için hızlı, basit ve ucuz bir tahlil açıklayın. Bunun için biz tasarladık ve kimyasal potansiyel sortilin bağlama epitope GLUT4 luminal kısmında karşılık gelen myc öğesini peptid sentez. Tagged ile altı histidines Sortilin memeli hücrelerinde ifade ve kobalt boncuk kullanarak hücre lysates izole. Üstündeki immobilize Sortilin peptid çözüm farklı pH değerlerinde ile inkübe ve eluted malzeme Western Blot tarafından analiz edildi. Bu tahlil diğer deterjan duyarlı protein-protein etkileşimleri çalışmaya kolayca adapte edilebilir.

Introduction

GLUT4 nerede insülin etkisi sonrası prandial kan glikoz izni¹aracılık eder yağ ve kas hücrelerinde ağırlıklı olarak gösterilen bir glikoz taşıyıcı proteindir. Çok istikrarlı bir protein olmak, GLUT4 translasyon düzeyinde düzenlenir. İnsülin yokluğunda GLUT4 büyük ölçüde plazma membran (dolayısıyla düşük Bazal geçirgenliği glikoz için) gelen söz konusu değildir ve küçük insülin duyarlı veziküller (IRVs) hücre içinde ağırlıklı olarak yerelleştirilmiştir ve temsil etmek büyük olasılıkla trans-Golgi ağ (TGN) Irv donör bölüm. İnsülin yönetim, üzerine IRVs plazma zarı ile sigorta ve işleyişi siteye GLUT4 teslim. Bu glikoz alımı adiposit ve iskelet mi....

Protocol

1. peptid işlenmesi

1. Tasarım ve peptid sipariş
   1. Peptid istenen sırayı seçin ve myc epitope (EQKLISEED), onun ya da N - veya C-terminus gibi bir etiket ekleyin.
   2. Peptid suda peptid çözünürlük hesap makinesi http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php kullanarak tahmin edilen çözünürlük kontrol edin. Çözünürlük düşük ise, şarj dengeyi değiştirmek için başka bir suda çözünen etiket eklemeyi deneyin.
      Not: Biz N terminus (Myc-fll-GLUT4) ilk luminal döngü (fll) için myc epitope (kalın yazı tipi) ile öğesini GLUT4, karşılık gelen peptid kullanılır: "iyi" tahmin edilen suda var EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTT....

Results

Lysates 3T3 L1 hücreleri stabil Sortilin-myc/O'nun⁵ ve WT 3T3 L1 hücreleri, bir negatif kontrol kullanılan transfected hazırlanmıştır. Her iki lysates kobalt boncuk pH 6 veya pH 8 ile inkübe edildi ve iyice yıkanır. Boncuk immobilize proteinler ile sonra Myc-fll-Glut4 çözümünde inkübe. Dikkatli yıkamadan sonra boncuk için bağlı proteinler 0.25 M Imidazole ile eluted. Örnekleri tabi, SDS-sayfaya degrade jel takip her ikisi de tespiti için sortilin-myc/O'nun izin Ant.......

Discussion

Sortilin her iki sinyal plazma zarı ve hücre içi sıralama olaylar^6,7dahil bir evrimsel korunmuş çok ligand protein reseptörü var. Ancak, deterjanlar için duyarlı olmak sortilin etkileşim bazı bağlama ortakları ile göründüğü gibi otantik sortilin'ın ligandlar (bazıları luminal veya integral membran proteinlerinin olan) için arama karmaşıktır. Bu nedenle, bir kolay ve protein-protein etkileşimleri, türleri çalışmak için yaygın bir yaklaşım co-immunoprecipitation, k.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Proteaz inhibitörü kokteyli	Sigma	P8849	histidin etiket proteini
Fosfat Tamponlu Salin'in saflaştırılmasında kullanım için	Corning	21-040-CV	PBS
1 mL İnsülin Şırınga U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Protein Test Kiti	Pierce	23228
Yıkama tamponu	Boston BioProducts	BP-234	His-tag protein saflaştırması için
HisPur Kobalt Reçine	Thermo Scientific	89964
Trisin numune Tamponu	Bio-Rad	SDS ile 161-0739	, bMerkaptaetanol Elution eklenmelidir
	Tampon Boston BioProducts	BP-236	250mM İmidazol
Mini-Protean Tris-Tricine prekast jeller ile His-tag protein saflaştırması için% 10-20 & nbsp;	Bio-Rad	456-3115	Peptit ve küçük protein
Tris/Trisin/SDS çalışma tamponunun ayrılması için	Bio-Rad	161-0744
Transfer Tamponu	Boston BioProducts	BP-190	20 metanol Nitroselüloz
membran ekleyin & nbsp; 0.45 mm	Bio-Rad	1620115
Sığır Serumu Albümin	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc antikor	Hücre Sinyalizasyonu	2272	Tavşan
Peptit	Genscipt		Siparişi özelleştirmek
Precision Plus Protein Çift renk Standartları	BioRad	161-0374