Yöntem makalesi

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

DOI:

10.3791/57179

⸱

7 Mart 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri keşfetmek için bizim yetenek hücredeki düzenleme bağlantılarını anlama anahtarıdır. Ancak, protein-protein etkileşimler birçok durumda tespiti önemli deneysel sorunlar ile ilişkilidir. Özellikle, sıralama reseptörleri kez deterjan duyarlı moda co-immunoprecipitation bu proteinlerin kullanılamaz yapar, membran bölmeleri Lümen içinde onların protein kargo ile etkileşim. Sıralama reseptör sortilin GLUT4 membran proteinlerinin arasındaki zayıf luminal etkileşimlerin bir örnek olarak hizmet verebilir glikoz taşıyıcı için bağlama. Burada, sortilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi doğrulamak için hızlı, basit ve ucuz bir tahlil açıklayın. Bunun için biz tasarladık ve kimyasal potansiyel sortilin bağlama epitope GLUT4 luminal kısmında karşılık gelen myc öğesini peptid sentez. Tagged ile altı histidines Sortilin memeli hücrelerinde ifade ve kobalt boncuk kullanarak hücre lysates izole. Üstündeki immobilize Sortilin peptid çözüm farklı pH değerlerinde ile inkübe ve eluted malzeme Western Blot tarafından analiz edildi. Bu tahlil diğer deterjan duyarlı protein-protein etkileşimleri çalışmaya kolayca adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GLUT4 nerede insülin etkisi sonrası prandial kan glikoz izni1aracılık eder yağ ve kas hücrelerinde ağırlıklı olarak gösterilen bir glikoz taşıyıcı proteindir. Çok istikrarlı bir protein olmak, GLUT4 translasyon düzeyinde düzenlenir. İnsülin yokluğunda GLUT4 büyük ölçüde plazma membran (dolayısıyla düşük Bazal geçirgenliği glikoz için) gelen söz konusu değildir ve küçük insülin duyarlı veziküller (IRVs) hücre içinde ağırlıklı olarak yerelleştirilmiştir ve temsil etmek büyük olasılıkla trans-Golgi ağ (TGN) Irv donör bölüm. İnsülin yönetim, üzerine IRVs plazma zarı ile sigorta ve işleyişi siteye GLUT4 teslim. Bu glikoz alımı adiposit ve iskelet miyositler kandan 10'a 40-fold yükselir böylece bu glikoz, plazma membran geçirgenliği artar. İnsülin çekilme sonra GLUT4 erken/sıralama endosomes içselleştirilmiş ve IRVs yeniden kurulan nerede TGN alındı. Her iki sıralama adımlar GLUT4 yolu, Yani çevresel erken endosomes tarafından ulaşım perinükleer TGN için ve IRVs oluşumu üzerinde membranlar Vps10p aile üyesi tarafından bir türü temsil eden sortilin, etkin TGN donör ben transmembran protein ve sıralama reseptör. Bir modeline göre sortilin bir transmembran iskele protein çalışır: GLUT4 endosomes ve TGN Lümen bağlar ve onun C-terminus2, retromer veya clathrin adaptörler donör membran aracılığıyla sitoplazmik tarafına acemi 3. bu GLUT4 dağıtım GLUT4 hücre içi bölmeleri arasında translocate veziküler taşıyıcıları içine kolaylaştırır.

Sortilin sitoplazmik kuyruk retromer ve çeşitli adaptör proteinler ile etkileşim iyi belgelenmiş oldu. Ancak, sortilin GLUT4 (ve onun diğer protein ligandlar birkaç) bağlantısını kanıtlamak için zor oldu. Özellikle, co-immunoprecipitate sortilin ve GLUT4 girişimlerini muhtemelen bu iki proteinler arasındaki etkileşimi deterjan duyarlı olması nedeniyle başarılı olmamıştır. Ayrıca, bir tipik taşıyıcı protein olarak GLUT4 12 transmembran etki alanları ve 6 luminal döngüler hangi herhangi bir bileşimini potansiyel bir sortilin bağlama site temsil edebilir vardır. Aynı zamanda, membran geçirgen DSP ve etkileşim ile Maya iki hibrid sistemde cross-linking önemli ortak yerelleştirme hücresinde, gibi dolaylı kanıtların büyük bir vücut önermek o sortilin GLUT4 için bağlayabilirsiniz. Ayrıca, ikinci yaklaşımı mutagenesis tarama alanin ile bir arada kullanarak, biz daha önce sortilin Vps10p etki öncelikle GLUT4 ilk luminal döngüsünü için bağlar belirledik. Ancak, böyle bir etkileşim memeli hücreleri olarak kanıtı kayıp olmuştur. Burada, asidik ortamda benzer O'nun öğesini sortilin kobalt reçine kullanarak ve kimyasal olarak sentezlenmiş peptid GLUT4 ilk luminal döngü pH 6 ve pH 8 karşılık gelen ile etkileşim kurabilir gösterdi transfected 3T3-L1 hücreleri izole ettim endosomal Lümen ve TGN membranlar nötr ortam Lümen içinde. Hiçbir peptid bağlama denetimi deneylerde nerede sigara transfected hücrelerden hazırlanan özü aynı boncuk dolu olduğunu tespit edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. peptid işlenmesi

  1. Tasarım ve peptid sipariş
    1. Peptid istenen sırayı seçin ve myc epitope (EQKLISEED), onun ya da N - veya C-terminus gibi bir etiket ekleyin.
    2. Peptid suda peptid çözünürlük hesap makinesi http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php kullanarak tahmin edilen çözünürlük kontrol edin. Çözünürlük düşük ise, şarj dengeyi değiştirmek için başka bir suda çözünen etiket eklemeyi deneyin.
      Not: Biz N terminus (Myc-fll-GLUT4) ilk luminal döngü (fll) için myc epitope (kalın yazı tipi) ile öğesini GLUT4, karşılık gelen peptid kullanılır: "iyi" tahmin edilen suda var EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA .
    3. En az % 75 ile özel peptid sipariş saflık tahlil için yeterli olan ve çözünürlük testi için sağlayıcınıza danışın. Sipariş peptid eriterek ile beklenmedik sorunlar durumunda en az iki aliquots ayrı.
      Not: Myc-fll-GLUT4 iki aliquots emri verildi. Ultrasaf suda bildirilen onun ≤10 mg/mL'dir.
  2. Peptid eriterek
    Not: En iyi solvent ultrasaf su var. Peptid suda çözünür olmak görünmüyorsa yönergeler için http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html bakın.
    1. 100 x peptid ultrasaf su veya 100 μg/mL konsantrasyonu ile seçim, arabellek çalışma çözüm hazırlamak.
    2. 50-100 µL aliquots belgili tanımlık eriyik ayırmak ve onları-20 ° C'de depolayın

2. hücre işleme

  1. Hücre kültürü
    1. Vahşi türü (WT) hücreleri bir negatif kontrol ve altı histidines (HISP) ile öğesini hedef protein ifade hücreleri olarak kullanın.
      Not: Biz 3T3 L1 ön adiposit stabil Sortilin-myc/O'nun5ile transfected kullanılır.
    2. Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) yüksek şeker % 10 buzağı sığır serum ile desteklenmiş, hücrelerin büyümesine glutamin (2 mM) ve penisilin/streptomisin (5 μg/mL) % 10 CO237 ° C'de.
    3. Dört 10 cm yemekleri hücre oturup iki tane HISP ile transfect ve diğer iki denetim plazmid (WT) ile transfect. 48 h transfection sonra hücrelerin % 80-90 confluency ulaştırılması gerekmektedir.
  2. Hücre Lysates hazırlanması
    1. Lizis arabellek (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM Imidazole, % 0.5 Triton X-100 ve proteaz inhibitörü EDTA kokteyl O'nun öğesini proteinler, pH 7.4 yalıtımı için) hazırlamak ve 4'te tutmak ° c
    2. Hücreleri üç kez 10 mL 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ° C'de yıkama
    3. Bulaşıkları buza koy ve 500 µL lizis arabelleği her yemek için ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücre lysates hasat.
    4. Lysate her yemeğin farklı 1,5 mL tüp içine yerleştirin. Tüpler WT-pH6, WT-pH8, HISP-pH6, HISP-pH8 olarak etiketleyin.
    5. Hücre lysates bir şırınga ile 26 G iğne ile beş kez yukarı ve aşağı, tam lizis için geçmek.
    6. Hücre lysates, 16.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
    7. Supernatants yeni aynı şekilde etiketlenmiş tüpler aktarın.
    8. Protein konsantrasyonu BCA Protein tahlil seti veya diğer seti kullanarak analiz.
    9. Lizis arabellek kullanarak, tüm dört lysates protein konsantrasyonu eşitlemek.
    10. Bir küçük (ca. 20 µL) aliquot, her lysate ayrı ve olası kontrol deneyleri ve/veya sorun çekim için-20 ° C'de tutun.

3. HisPur kobalt boncuk için O'nun öğesini proteinlerin bağlama

  1. Piyasada bulunan yıkama arabellek kullanın veya bir (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8) hazırlamak ve 4 ° C'de tutmak
  2. Yıkama hazırlamak pH 6 tarafından tittering yıkama tampon pH 8 ile birlikte tut HCl. bu 4 ° C'de tampon
  3. Yavaşça homojen süspansiyon yapmak kobalt boncuk şişe girdap.
  4. Kobalt boncuk süspansiyon 40 µL yukarıdaki gibi işaretlenmiş dört 1,5 mL tüpler içine (Adım 2.2.4) dağıtmak.
  5. 1 mL lizis arabellek her tüp için ekleyin ve 5 s. aspiratı süpernatant için 1000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi ve 40 μL lizis arabelleği için kapatılan boncuk ekleyin.
  6. Hücre lysates karşılık gelen borular için ekleyin.
  7. Tüpler için 90 dk 4 ° c 20 d/d tüp rotator üzerinde kuluçkaya.
  8. Tüpler santrifüj kapasitesi 1000 x g 5 s ve süpernatant toplamak için. 4 ° C'de süpernatant tutmak
  9. PH 8 veya pH 6 yıkama arabellek 500 µL karşılık gelen borular için ekleyin ve boncuk hafifçe yeniden askıya alma.
  10. 1000 x g 5 s ve atmak için de tüpler santrifüj kapasitesi supernatants.
  11. Adım 3,9 ve 3.10 için dört kez tekrarlayın.

4. peptid üstündeki immobilize O'nun öğesini Protein için bağlama

  1. Peptid (1.2.1. adım) 100 x çalışma çözümü kullanarak 1 çalışma çözümler pH 6 veya pH 8 yıkama arabellek (her iki 100 µL aliquots, 1 µg/mL) x hazırlamak.
  2. 1 x peptid çözeltinin 100 μL karşılık gelen pH ile yıkanmış boncuk ekleyin.
  3. Boncuk 20 rpm bir tüp rotator üzerinde 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
  4. 1000 x g 5 için de tüpler santrifüj kapasitesi s, süpernatant toplamak ve -20 ° C'de tutmak
  5. Adım 3,9 ve 3.10 için dört kez tekrarlayın.
    Not: olası arka plan azaltmak için aşağıdaki adımları adımları 4.4 & 4.5 yerini alabilir.
  6. Onları olduğu gibi adım 2.2.4 etiket ve sütunları koleksiyon tüplerde yer 30 mikron gözenekleri dört mikro sütunlarla alın.
  7. Sütunlara kuluçka karışımı adım 4.3, tamamlanması aktardıktan sonra çözüm yerçekimi tarafından geçmesine izin verin. -20 ° C'de aracılığıyla akış devam
  8. Yıkama tamponunun pH 6 veya pH 8 karşılık gelen sütunları aracılığıyla ile 500 µL yerçekimi tarafından geçmek. Aracılığıyla akış atmak.
  9. Adımı yineleyin 4,8 dört kez.
  10. Son yıkama sonra santrifüj kapasitesi 1000 x g 15 sütun s.

5. elüsyon kobalt boncuk üzerinden

  1. Kullanım ticari Tricine örnek arabellek (200 mM Tris-HCl, % 40 gliserol, % 2 SDS, %0,04 Coomassie mavi, pH 6.8) ve β-mercaptoethanol % 2 son konsantrasyonu ekleyin.
  2. Tricine örnek arabelleği (β-mercaptoethanol ile) 40 µL yıkanmış boncuk ve girdap örnek ekleyin.
  3. Örnekleri 100 ° C'de 10 dakika için ısı girdap örnekleri daha ve 1000 x g 5 için de tüpler santrifüj kapasitesi s.
    Not: elüsyon olası nonspesifik bağlama azaltmak için aşağıdaki adımları adımları 5.1-5,3 yerini alabilir.
  4. 40 μL elüsyon Imidazole arabelleği (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0.25 M imidazole) yıkanmış için eklemek boncuk, girdap ve tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
  5. 3000 x g 30 de tüpler santrifüj kapasitesi s, süpernatant (eluted örnekleri) toplamak ve yeni etiketli tüpler için transfer.
  6. Tricine örnek arabelleği 40 μL her tüp eklemek, örnekleri 10 dk 100 ° C, girdap ve santrifüj için ısı tüpler 1000 x g 5 için de s.
    Not: mikro sütun kullanılıyorsa, elüsyon arabellek için yıkanmış boncuklar, eklemek için 20 dk kuluçkaya ve 8.000 x g 2 min için de Santrifüjü tarafından elüsyon toplamak.
    Not: Elektroforez gerçekleştirilir kadar örnekleri-20 ° C'de tutulabilir.

6. Elektroforez ve Western Blot

Not: Örnekleri SDS-sayfa ve sonraki Western Blot tarafından ayrılması için hazırsınız demektir. Jel Elektroforez (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) aşağıdaki değişiklikler ile protokolünden izleyin.

  1. Piyasada bulunan 10-%20 Tricine degrade jelleri kullanın.
  2. Üzerinde jel, eluted örnekleri 20 µL ve lysates (Adım 2.2.10) 20 µL yük. Sorun çekim için bu 20 µL ilişkisiz malzeme (Adım 3.8) yüklemek için tavsiye edilir ve 10 ng peptid; yükleme önce bu örnekler için Tricine örnek arabellek eşit miktarda ekleyin.
  3. Elektroforez ticari Tris/Tricine/SDS arabellek (100 mM Tris, 100 mM Tricine ve % 0.1 SDS, pH 8.3) çalıştıran içinde yerine getirir.
  4. Malzeme % 20 metanol ile desteklenen Aktarım arabellek (25 mM Tris Bankası, 192 mM glisin, pH 8.4) kullanarak 0,45 µm nitroselüloz membran üzerine jel transfer.
  5. Membran ile % 3 blok sığır Serum Albumin (BSA) oda sıcaklığında 1 h için. Önceden lekeli molekül ağırlığı işaretçileri kılavuz olarak kullanarak, membran yatay kesme, HISP karşı antikor ile üst kısmında leke ve alt kısmında bir antikor myc öğesini peptid tanımlamak için myc epitope karşı ile leke.
    Not: HISP ve Myc-fll-GLUT4 bir anti-myc antikor ile tespit edilebilir beri bizim durumda, membran kesme gerekli değildir.

7. analiz sonuçları

  1. Bir görüntü istasyonu veya ImageJ programı kullanarak tüm Western blot sinyalleri yoğunluğunu ölçmek.
  2. Myc öğesini peptid HISP sinyalini her iki pH değerlerinde karşı gelen sinyal normalleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lysates 3T3 L1 hücreleri stabil Sortilin-myc/O'nun5 ve WT 3T3 L1 hücreleri, bir negatif kontrol kullanılan transfected hazırlanmıştır. Her iki lysates kobalt boncuk pH 6 veya pH 8 ile inkübe edildi ve iyice yıkanır. Boncuk immobilize proteinler ile sonra Myc-fll-Glut4 çözümünde inkübe. Dikkatli yıkamadan sonra boncuk için bağlı proteinler 0.25 M Imidazole ile eluted. Örnekleri tabi, SDS-sayfaya degrade jel takip her ikisi de tespiti için sortilin-myc/O'nun izin Ant...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sortilin her iki sinyal plazma zarı ve hücre içi sıralama olaylar6,7dahil bir evrimsel korunmuş çok ligand protein reseptörü var. Ancak, deterjanlar için duyarlı olmak sortilin etkileşim bazı bağlama ortakları ile göründüğü gibi otantik sortilin'ın ligandlar (bazıları luminal veya integral membran proteinlerinin olan) için arama karmaşıktır. Bu nedenle, bir kolay ve protein-protein etkileşimleri, türleri çalışmak için yaygın bir yaklaşım co-immunoprecipitation, k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser DK52057 ve K.V.K. X.P için gelen NIH DK107498 kurumsal eğitim grant 2T32DK007201 NIH üzerinden tarafından desteklenen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Proteaz inhibitörü kokteyliSigmaP8849histidin etiket proteini
Fosfat Tamponlu Salin'in saflaştırılmasında kullanım için Corning21-040-CVPBS
1 mL İnsülin Şırınga U-100BD32965226G x 1/2
BCA Protein Test KitiPierce23228
Yıkama tamponuBoston BioProductsBP-234His-tag protein saflaştırması için
HisPur Kobalt ReçineThermo Scientific89964
Trisin numune TamponuBio-RadSDS ile 161-0739, bMerkaptaetanol Elution eklenmelidir
  Tampon Boston BioProductsBP-236250mM İmidazol
Mini-Protean Tris-Tricine prekast jeller ile His-tag protein saflaştırması için% 10-20 & nbsp;Bio-Rad456-3115Peptit ve küçük protein
Tris/Trisin/SDS çalışma tamponunun ayrılması için Bio-Rad161-0744
Transfer TamponuBoston BioProductsBP-19020 metanol Nitroselüloz
membran ekleyin & nbsp; 0.45 mmBio-Rad1620115
Sığır Serumu AlbüminSigmaA9647BSA
Anti Myc antikorHücre Sinyalizasyonu2272Tavşan
PeptitGensciptSiparişi özelleştirmek
Precision Plus Protein Çift renk StandartlarıBioRad161-0374
, %

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
  2. Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
  3. Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
  4. Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
  5. Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
  6. Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
  7. Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
  8. Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
  9. Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
  10. Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
  11. Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Histidin Etiketli ProteinMyc Etiketli PeptitKobalt BoncuklarWestern BlottingpH a Ba l Ba lanmaSortilin GLUT4 Etkile imiPeptit SenteziH cre Lizat Haz rlama

İlgili makaleler