Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

8.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57182

⸱

28 Şubat 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Bu makalede

Özet

Çevre zenginleştirme (EE) yaşam tarzı, stres ve hastalık arasındaki bağlantıları altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılan bir hayvan konut ortamdır. Bu iletişim kuralı özellikle hayvan mortalite etkisi olabilir microbiota biyolojik çeşitlilik değişiklikleri tanımlamak için iki nokta üst üste tumorigenesis ve EE bir fare modelini kullanan bir yordam açıklanır.

Özet

Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda insan hastalık geliştirmeye yönelik an enriched çevre yaşayan yararlı etkileri gösterildiği. Farelerde, çevre zenginleştirme (EE) fare bağışıklık sistemini harekete geçirerek tumorigenesis azaltır veya geliştirilmiş microbiome çeşitlilik, tümör microenvironment dahil yara onarım yanıt uyararak tümörü taşıyan hayvan hayatta kalma etkiler. Burada olması koşuluyla bir fare kolon tümörü modelindeki microbiome çevre zenginleştirme biyoçeşitlilik üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ayrıntılı bir yönerge. Hayvancılık ve hayvan genotip ve fare koloni entegrasyonu için konuları ile ilgili önlemler açıklanmıştır, tümü sonuçta mikrobiyal biyolojik çeşitlilik etkiler. Bu önlemler heeding daha fazla tek tip microbiome aktarımına izin vermek ve sonuç olarak çalışma bulguları yıkmak tedavi olmayan bağımlı etkileri hafifletmek. Ayrıca, bu yordam, 16S rDNA sıralama gelen uzun vadeli çevre zenginleştirme takip distal kolon toplanan dışkı izole DNA kullanarak microbiota değişiklikleri karakterizedir. Gut microbiota dengesizlik iltihabi bağırsak hastalığı ve kolon kanseri, aynı zamanda obezite ve diyabet diğerleri arasında patogenezi ile ilişkilidir. Önemlisi, bu iletişim kuralı için EE ve microbiome analiz microbiome patogenezinde rol insan hastalık özetlemek nerede sağlam fare modelleri mevcut hastalıkların çeşitli eğitim için yararlı olabilir.

Giriş

Çevre zenginleştirme (EE) çalışmalar sosyal stimülasyon (büyük konut kafesleri, hayvanların büyük gruplar), bilişsel stimülasyon (kulübe, tünel, iç içe geçmiş malzeme, platformlar) ve fiziksel aktivite (koşularda etkiler için karmaşık konut parametrelerini kullanmak tekerlekler). EE hastalığı başlatma ve fare modelleri, berberlik indüklenen alopesi, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere geniş bir dizi kullanarak ilerleme artmış aktivite ve geliştirilmiş sosyal ve Bilişsel etkileşimleri etkileri anlamak için birçok labs tarafından kullanıldığında vardır, Rett sendromu ve birkaç tümör ve sindirim rahatsızlıkları modelleri1,2,3,4,5,6.

Birkaç fare modelleri iki nokta üstüste tumorigenesis farelerde incelemek için geliştirilmiştir. Belki de en iyi tanımlanmış modeli ApcMin faredir. ApcMin fare 19907William Dove laboratuvarda geliştirilen ve yaygın olarak insan kolorektal kanseri ile ilişkili APC gen mutasyonlar bir fare modeli olarak kullanılmıştır. Aksine insanlar öncelikle APC mutasyonlar, ApcMin fareler barındıran küçük bağırsak tümörleri, kolon tümörleri çok nadir görülmesi ile geliştirmek. Ancak, bir Tcf4Het alleli Tcf4, bir tek knockin nakavt heterozigoz mutasyon ile büyük ölçüde ApcMin alleli8ile birleştirildiğinde iki nokta üstüste tumorigenesis artırır. Son zamanlarda, bu fare modeli kolon tumorigenesis kolon tumorigenesis6EE etkilerini belirlemek için kullanılır. İçinde Bice ve ark. çalışma, fizyolojik ve fenotipik EE üzerine etkileri kadın ve erkek dört farklı fare satırlarının (vahşi-tipi (WT), Tcf4Het / + Apc+/ +, Tcf4+/ + ApcMin / +, ve Tcf4 Het / + APCMin / +)) tanımlı değil. Belki de en ilginç bulgu EE önemli ölçüde hem erkek hem de dişi kolon tümörü taşıyan hayvanların ömrü artar oldu. Bu EE en az azaltabilir gösterdi bazı belirtilerin iki nokta üstüste tumorigenesis ile ilişkili ve hayvan sağlığını geliştirmek. Dikkat çekici, erkeklerde geliştirilmiş bu ömrü sınırlı tumorigenesis doğrudan bir sonucu değildir ve bunun yerine yanıt geliştirilmiş microbiome biyolojik çeşitlilik6dahil olmak üzere, şifa bir tümör yara inisiyasyon bağlıydı.

Birkaç EE belirli çalışmaları ile ilginç sonuçları yayınlanmıştır. Ancak, bir teknik açıdan önemli sonuçlar diğer laboratuvarlar için çevrilebilir değildir. Aynı EE metodolojileri farklı laboratuvarlar arasında Bakımı olan bir inanılmaz derecede karmaşık bir sorun, sadece zenginleştirme aygıtlar ve kullanılan, konut nedeniyle ama aynı zamanda yatak takımları, gıda, havalandırma, üreme, genetik, etkinlik oda ve hayvan iletişim kuralı gereksinimleri, diğerleri arasında9,10,11. Bir hayvan Tümleştirme, nerede hayvanlar stabil fare koloni, bu nedenle genetik arka plan ve diyet kompozisyon tedavi sigara ilgili etkileri önlemek için normalleştirme tümleştirilmelidir örnektir. Ayrıca, birçok EE çalışma microbiome hastalığı ve ortak fare yetiştiriciliği uygulamaları gut microbiome10,12bileşimi etkileyebilir yol önemi gerçekleşme öncesinde tamamlanmıştır.

EE üreme stratejisi ve hayvan yerleştirme-stres artırabilir değilse düzgün gerçekleştirilen. EE çalışmalar çok sayıda erkek ve dişi hayvanlar ve birden çok genotip kullanmak beri deneysel hayvan gereksinimini birleştirilmek üzere birkaç çöp verilen zor kurulabilir. Bu nedenle, bir üreme ve strateji Sütten kesme geliştirilmiştir farklı çöp üzerinden doğru genotip Emzikteki hayvanların birleştirme izin vermek için. Bunun için birincil mantığı çöp arasında microbiota normalize etmek ve deneysel çevreye hayvanlar taşındığında stresi azaltmak için yapıldı. Microbiome Barajı10' dan gönderilmiş. Kolonisi mikrobiyal çeşitliliği sağlamak için kadın Jackson Labs satın alınan ve bir ay önce9,10,12deneme başladı koloni entegre. Daha fazla microbiome biyolojik çeşitlilik hayvanlar arasında normalize etmek, kadın üreme önce co barındırılıyor. Islahı, yetiştirme sırasında ortak konut ve kaçmak için yetenek Hemşirelik pups stres düzeyleri anne bakım13,14muhtemelen microbiome normalleştirme sürdürmek, geliştirilmiş. EE sigara önlemek için microbiome üzerindeki etkileri ile ilgili, tüm deneysel hayvan bu ortak konut bir deneysel kafes içine farklı çöp üzerinden birkaç erkek birleştirirken oluştu mücadele ve ek stres engelledi. Son olarak, tüm genotip hayvanların eşit sayıda kafeslerde dahil edilmiştir. Bu geliştirilmiş microbiota biyolojik çeşitlilik için fırsat genotip arasında sağlanan ve coprophagia (dışkı tüketmeye hayvanın eğilim) veya olası genotip özgü davranış farklılıkları genel bir çalışma. kaldırıldı

Bu iletişim kuralı microbiome araştırma, daha fazla tek tip microbiome nüfus etkinleştirmek için microbiota normalleştirme microbiota iletim ve hayvan koloni Tümleştirme dahil olmak üzere bilinen yönleri dahil etmek için önceki EE çalışmalarda genişletir bir strateji sağlar deneysel hayvan arasında. Bu önlemler heeding çalışma bulguları yıkmak yeteneği olmayan tedavi ilgili microbiota farklılıklar nedeniyle önemlidir. EE sigara ortadan kaldırarak microbiota değişiklikleri araştırmacılar özellikle microbiota kompozisyon hastalığı gelişme ve ilerleme sırasında EE rolü tanımlamak sağlayacaktır ilgili.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Utah Üniversitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. deneysel tasarım ve EE ve denetim kafes kurulumu

Not: Başvuru için deneysel tasarım anahattı gösterilmiştir (şekil 1).

  1. Denetimi (NE) ve EE kafesleri ayarlayın (Şekil 2).
    1. Doğu kafesleri ayarlamak için zenginleştirme aygıtları eksikliği autoclaved geleneksel kontrol kafesleri (Tablo 1) kullanın.
    2. İçin büyük kafes, salmastra ve tünel (Tablo reçetesi) kapsayacak kadar büyük kafes başına bir delik.
    3. Yavru yetiştirme ve EE kafesleri ayarlamak için iki büyük autoclaved kafesleri sterilize salmastra güvenli tünel ve kat alanı (Tablo 1) artırmak için 2 steril platformları ile bağlayın. EE deneyler için sterilize çalıştıran tekerlekler, tünel, igloolarda, kulübe, gezinme topları ve malzeme EE kafes içinde iç içe geçirme sağlar.
    4. EE ve NE kafesleri eşit havalandırma sağlamak için havalandırılmış bir rafa yerleştirin.
      Not: 2 platformları (Tablo 1) ile iki büyük kafes izin en fazla 12 hamile dişiler yavru Kur15 yetiştirme başına ( Tablo malzemelerigörmek, adım 3.2 belge ve Tablo 2).
    5. Fareler ışınlanmış ad libitum standart chow ve autoclaved ters osmoz su besleme.
    6. Fareler steril odada malzemeler ile sağlar.
      Not: Boş kafesleri ve kafesler hayvanlar ile tüm manipülasyonlar hood kontaminasyonu önlemek için yapmanız gerekir. Büyük kafes kafesin manipülasyonu için belgili tanımlık kafes yapışkanlı bir film ile delik kapağı.
  2. Hayvan ıslahı için hazırlayın. Çiftleşme öncesi 2 hafta boyunca bir tek büyük kafes (Tablo 1) ev 15 2 - ay yaşlı kadın grup. Ayrı ayrı Evi 2 - aylık littermate erkek çiftleşme öncesi 2 hafta boyunca.
    Not: Kadın üreme için sayısını deneme ve hayvanların gerekli sayıda bağlıdır. Bu çalışmada, 15 kadın 12 takılı kadın, elde etmek için en fazla olduğu kullanılmıştır 1.1.2 (Tablo 2) içinde açıklanan Kur yetiştirme yavru içinde izin verilen numara.
  3. Üremek için hayvanlar, efendim ve dam başına 2 kadın 1 erkek birleştirin. Sabah ilk kontrol hayvanlar gece boyunca şeklindeki görsel bir işaret olabilir vajinal fişler için olmalıdır.
    Not: Ev kadın ve erkek her erkek takılı kadar birlikte. Harici ise vajinal bir fiş görsel olarak, tespit edilebilir.
    1. İçselleştirilmiş fişler algılamak için bir sonda vajinal açılış içine eklenir ve vajinal fiş varsa, sonda değil kolayca eklenir (16; 4.3.6 bölümüne bakın).
      Not: Çiftleşme gece oluştu bu yana bir fiş yarım gün algılanan sabah kaydedin.
    2. Sonra kadın vajinal prizler, onları büyük bir yavru kafesi şeklindeki diğer kadın (kurulum adım 1.1.2 zenginleştirme cihazlar olmadan) ile grup konut için yetiştirme aktarın.
    3. Değiştir yeni eşleşmemiş grup yer alan kadın dişilerle çiftleşme için şeklindeki ve bir 7 günlük süre içinde en fazla sayıdaki çöp için çiftleşme devam edin.
      Not: Bütün hayvanlar birbirlerinin 7 gün içinde teslim tarihi olmalıdır.
  4. Hamile kadın grup böylece tüm çöp içinde bir büyük yavru yetiştirme kafesi (kurulum adım 1.1.2 zenginleştirme cihazlar olmadan) yetiştirilir konut içinde doğum izin.
    1. Yavru numaraları ve birthdates takip ve Genotipleme pups yaş 7 gün başlar.
      1. Yavrular kendi ayak yaş13,17belirtmek için bir sayı kodu ile 7 gün, dövme.
      2. Ayak % 70 etanol ile temiz ve yavaşça ayak17 ' ye paralel cilt yüzeyi içine mürekkep içeren bir mikro-dövme aygıtını takın (bkz. Tablo malzeme).
      3. Doku Genotipleme makastan ile 7 - gün eski ventilasyon dokudan küçük bir parça incising tarafından en çok kuyruk ipuçlarını toplamak.
    2. Dokusundan genomik DNA izole etmek ve 18' açıklandığı gibi geleneksel bir gösteriş meraklısı yöntemi kullanarak PCR gerçekleştirin.
    3. 14-21 gün anneler ile büyük kafesler içine sekste ayrı hayvanlara.
      Not: Büyük yavrular kendi besleme edebiliyoruz ve daha genç pups eski kadar kendi beslemek için yeterli hemşire devam emin olun.
    4. 21-28 gün, erkek ve dişi hayvanlar ayrı olarak ND veya EE ortamlar, kafes (Şekil 2A) her genotip eşit oranlarda tutmak emin içine genotip tarafından dağıtın.
      Not: IACUC (Tablo 2) tarafından izin verilen maksimum sayıyı hayvanlar her ND veya EE kafes içinde izin verilen toplam sayısı dayalı olun. Kuzey kafesleri en az 5 hayvanlar (Tablo 2) var. Sosyal uyarılması, hiç az 20 ve alan kısıtlamalar ile için EE kafeslerde en fazla 41 hayvanlar EE kafes (Tablo 2) izin verilmelidir.

2. dışkı toplama 16 hafta-in yaş

  1. 1-2 gün kurban önce dışkı toplama başlar ve ayrı ayrı dışkı steril araçlarını kullanarak diseksiyon sırasında kurban gününde toplamak.
    Not: Aynı zamanda 1-2 gün kala koleksiyon toplama dışkı bir örnek yok dışkı toplanması sırasında mevcut olma olasılığını nedeniyle kayıplarını önlemek için yardımcı olabilir.
    1. Toplamak canlı hayvanlardan, dikkatle scruff üzerinde temiz bir kafes hayvan tabure için. Steril microfuge tüp steril forseps kullanarak dışkı toplamak.
      Not: Hayvanlar genellikle hızlı dışkı koleksiyonuna bir steril microfuge tüp doğrudan izin veren immobilize zaman dışkı ortadan kaldırır. İmmobilize zaman hemen bir hayvan dışkılama değil, temiz bir kafesin içine yerleştirin ve hayvan (genellikle en fazla 1 saat) arınmak bekleyin.
    2. Dışkı kurban gününde toplamak.
      1. Hayvan ötenazi için belgili tanımlık hayvan içinde isoflurane ıslatılmış bir pamuk ile küçük bir kap içeren bir Sırça fanus yerleştirin. Bir kez nefes kesilmesi (genellikle 2 dakika sonra) gözlenen, hayvan colon diseksiyonu izin vermek için sırtını yatıyordu.
      2. % 70 etanol fare karın için geçerlidir.
      3. Üretral açılış anterior cilt Forseps ile Asansör ve göğüs kafesi erişene dek ventral orta çizgi kesmek için makas kullanın ve her bacak doğru ilk kesi Bankası kesim. Geri pas cilt ve aynı desende Periton duvarından kesmek için makas kullanın.
      4. Forseps teşrih ve distal kolon rektum üzerinden ayırmak için anüs, distal kolon kavramak için kullanın. İki nokta üst üste dikey Forseps ile kablolarıylaberaber, iki nokta üst üste serbest bırakmak için bıçaklanmasından ile kesmek için makas kullanın.
      5. Hemen altında çekum kolon kesme ve filtre kağıt üzerinde yatıyordu. Forseps eklenecek açık makas bir tarafı izin vermek için Lümen açılış kolon boru üst kaldırmak için kullanın. Boyuna, distal ve proksimal splay açık kolon uzunlamasına kesilmiş.
      6. Dışkı distal kolon steril forseps kullanarak bir steril microfuge tüp içine toplamak.
  2. Dışkı microfuge tüp-80 ˚C, bakteriyel DNA izolasyon zamana kadar saklayın.
    Not: Kurban, dışkı, ek olarak günde diğer örnekleri tam kan, serum, plazma, normal gibi tümör doku toplamak ve kolon ve ince bağırsak, microsomes, yağ dokusu, vb. çalışmada tanımlanan adres sorular için.

3. genomik DNA izolasyonu dışkı

Not: Bir tabure patojen algılama protokol sonrası dışkı mikrobiyal DNA izole etmek için ticari bir kit kullanmaktadır. Örnekleri-80 ˚C dondurucu ve kuru buz deposu için doğrudan Tartım sırasında kaldırın.

  1. Dışkı ilâ 220 mg oda sıcaklığında (RT) dışkı lizis arabelleği 1.4 mL içeren bir temiz microfuge tüp transferi ( Tablo malzemelerigörmek).
  2. Girdap örnek iyice katılar (Şekil 2B) homojenize için 1 dakika için. Süspansiyon (gram-pozitif bakteriler de dahil olmak üzere) tüm bakterileri parçalayıcı 5 min için 95 ˚C için ısı.
  3. Girdap örnekleri 15 s ve sonra 20.000 x g dışkı katı cips için 1 dakika için de santrifüj için. 2-mL microfuge Tube transfer süpernatant. PCR inhibitörleri, tablet eriyene kadar girdap emmek için her örnek için bir tablet ekleyin ve RT, Örnek 1 dk. için kuluçkaya.
  4. 20.000 x g 3 dk da örneğine santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni bir microfuge tüp aktarın. 20.000 x g İndinavir K 3 dk. Aliquot 15 μL için (20 mg/mL stok) yeni 1.5 mL microfuge tüpüne santrifüj kapasitesi. 200 μL örnek İndinavir K. içeren tüpe pipet
  5. Guanidinium klorür lizis tampon tüp, girdap 15 ait 200 μL eklemek s ( Tablo malzemelerigörmek) ve örneği için 10 dk. eklemek 200 μL etanol (96-%100) tüpler için 70 ˚C'kuluçkaya ve mix de vortexing tarafından.
  6. Yer bir silika spin sütun 2 mL toplama tüp içinde temel ve örnekleri sütun için geçerlidir. 20.000 x g, 1 dk santrifüj kapağı kapatın.
  7. Sütun için yeni bir 2 mL toplama tüp nakletmek ve 500 μL yıkama arabelleği 1 sütun, sütun ve 20.000 x g. Transfer sütun için yeni bir 2 mL toplama tüp, 1 dk santrifüj kap ve yıkama arabelleğinin 2 500 μL sütuna eklemek eklemek , kap ve 3 dakika 20.000 x g, santrifüj kapatın.
  8. Kapalı kap ile sütun için yeni bir 2 mL toplama tüp aktarmak ve kalan yıkama arabellek kaldırmak için 20.000 x g de ek bir 1 dk santrifüj kapasitesi. Sütun bir 1.5 mL microfuge tüp etiketli aktarmak ve 200 μL membran için EDTA içeren elüsyon arabelleği ekleyerek örnek elute (bkz. Tablo malzeme).
  9. Kapağı kapatın ve 1 dk. santrifüj Örnek 1 dk az 20.000 x g. atma sütun için RT kuluçkaya.

4. DNA toplama belirlenmesi ve PCR için numune hazırlama

Not: Bir yer ve her örnek içinde genomik DNA konsantrasyonu belirlemek için piyasada bulunan dsDNA floresan tahlil kullanmak ( Tablo malzemelerigörmek). Floresan boya özellikle çift iplikçikli DNA bağlamanız gerekir.

  1. Her örnek (199 µL dsDNA ana karışımı her örneğinin 1 µL) ve bir 1:50 1: 200 seyreltme hazırlamak seyreltme standartları. Bir yer dsDNA ayarı kullanarak analiz.
    Not: DNA PCR'yüksek hacimli inhibitör olabilir, bu nedenle, birimin kullanılan DNA PCR son hacmi % 10'dan fazla olmamalıdır. Sadece floresan boya bağlı DNA kirletici son hesaplanan DNA toplama için olası katkısını ortadan kaldırarak belli gibi bir yer örneğinde, DNA'ın hassas ölçüm sağlar. Bu düzeyde doğru Nefelometri bir aşağı akım sıralama uygulama için önemlidir.
  2. 5 ng/μL 10 mM Tris, pH 8,5 çalışma şablon stokları her örneği yapmak için uygun hacmi ile seyreltilmiş PCR Şablonlar hazırlayın.
  3. -20 ° C'de mağaza örnekleri

5. tasarım astar 16S için istenen V bölgeleri

  1. Seçime bağlı olarak istenen V 16S rRNA bölgeleri yükseltmek için tasarım astar.
  2. Ribozomal veritabanı projesi19, maç, sonda ile astar için çeşitli kültürlenebilen yaklaşık isabet oranı belirlemek için analiz.
    Not: V1-V3 bölgeler için kullanılan geçerli çalışma hangi pozisyon 8 V1 bölgesi içinde ve hangi pozisyonda 533 V3 bölgesi içinde bağlar 533 ters21, bind astar Bosshard ileri20, yayınladı. Astar dizin oluşturma için çıkıntı bağdaştırıcısı sıralamaları eklemeniz gerekir.
  3. Astar tasarlarken, Kütüphane hazırlık22 (Tablo 3) sıralama 16S metagenomics için tavsiye edilen şekilde bağdaştırıcı dizileri her astar 5' ucunda içerir.
  4. Bu büyük astar kartuş arıtma ile sentez. Rendelenmiş astar sulandırmak ve hisse senedi 1 mikron için 10 mM Tris, pH 8,5 çalışan bir PCR oranında seyreltin.

6. Amplicon V Region(s) çıkıntı bağdaştırıcısı serileri ile yükseltmek için PCR 22 bağlı

  1. Amplicon kadar PCR reaksiyon mix Tablo 4' te açıklandığı gibi ayarlayın.
  2. Yapışkan bir açık PCR plaka mühür tabağa yerleştirin ve Tablo 5' te parametreleri kullanarak PCR amplicon çalıştırın.
  3. (İsteğe bağlı) Bir özel jel veya amplicon boyutta nicel ölçüm sağlar yüksek hassasiyet DNA tahlil PCR ürünleri amplicon çalıştırma ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: 550 amplicon boyutudur bu çalışmada elde bp (şekil 3A).

7. PCR manyetik Temizleme'yi kullanarak 22 boncuk

  1. Amplicon PCR plaka hızlı bir şekilde 1000 x g yoğunlaşma toplamak 1 dk santrifüj kapasitesi.
    Not: PCR tüp şeritler PCR tabak yerine kirlenme en aza indirmek için kullanılabilir. Tüp kapakları atmak ve asla yeniden kullanabilirsiniz.
  2. Eşit olarak onları dağıtmak ve manyetik, 20 μL eklemek için manyetik boncuk boncuk her amplicon PCR, girdap sonra pipette birimin tümü yukarı ve aşağı yavaş yavaş 10 kat.
  3. RT 5 dk. yer PCR plaka 2 min için manyetik bir stand kadar manyetik boncuklar toplanır ve süpernatant açıktır kuluçkaya. Kaldırmak ve süpernatant atın.
  4. Yıkama boncuk PCR plaka üzerinde manyetik ise 200 μL taze % 80 etanol ile stand ve 30 için kuluçkaya RT s manyetik stand. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.
  5. Yıkama için ikinci kez tekrarlayın. Şimdi, iyi pipet ucu herhangi bir kalıntı etanol kuyulardan kaldırmak ve 10 dakikadır kurutma hava izin vermek için kullanın.
  6. PCR plaka manyetik standından kaldırın ve her şey için 10 mM Tris pH 8,5 52,5 μL ekleyin. Pipet yukarı ve boncuk askıya almak ve 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya 10 kat aşağı.
  7. PCR plaka manyetik boncuklar toplamak ve 50 μL in süpernatant temiz bir PCR plakasına aktarmak için manyetik stand aktarın. Yapışkan bir açık PCR plaka mühür tabağa yerleştirin ve -20 ˚C bir hafta kadar saklayın.

8. dizin PCR için bir plaka düzeni hazırlanması

Not: V1-V3 kütüphane oluşturmak için ikinci bir PCR ile dizin gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Varsayılan dizin oluşturma şeması (şekil 3B ve 23) her örnek için benzersiz Çift dizin kombinasyonlarını eşlenecek kullanıldı.

  1. Her örnek 2 dizin astar benzersiz bir kombinasyonu olduğundan emin olun (örneğin, ikili dizin oluşturma).

9. dizin açıklanan 22 adaptörü dizileri için Barkod eklemek PCR gerçekleştirmek.

  1. PCR amplicons (temiz amplicons) 2.5 μL yeni 96 iyi plaka ve dizin oluşturma içinde yardım etmek için bir dizin plaka klasiği yerde aktarın.
  2. Dizin 1 düzenlemek ve hazır plaka grafik (Resim 3B) örnekte olduğu gibi 2 astar dizin.
    Not: Görsel yardımlar astar karışmalarının önlemek için sağlanmıştır: dizin 2 astar tüpler olması gereken beyaz kapaklar ve net çözüm, dizin 1 astar tüpler turuncu kapaklar ve sarı çözüm varken.
  3. PCR karışımı tepki dizin Tablo 6' da açıklandığı gibi bir araya getirin. Aşağı yukarı 10 kez pipetting karıştırın. Bir yapışkan açık PCR plaka mühür ile kapak ve 1 dk. için oda sıcaklığında 1000 x g de toplamak için santrifüj kapasitesi.
  4. Tablo 7' parametreleri kullanarak PCR dizini çalıştırın.

10. son PCR Kütüphane arındırmak

Not: Bu PCR temizlik yukarıda adım 7 için aynıdır ve manyetik boncuklar PCR temiz-yukarıya PCR22dizinin gerçekleştirmek için kullanır.

  1. Adım 10 1000 x g yoğunlaşma toplamak 1 dk için de hızlı bir şekilde PCR tabaktan santrifüj kapasitesi.
  2. Eşit olarak onları dağıtmak, o zaman, manyetik 20 μL eklemek için manyetik boncuk boncuk her amplicon PCR, girdap sonra karışımı yavaş yavaş 10 kat yukarı ve aşağı tüm birimi pipette.
  3. RT 5 min için kuluçkaya.
  4. Yer PCR plaka 2 manyetik boncuklar toplanan ve süpernatant olana min için manyetik bir stand açıktır. Kaldırmak ve süpernatant atın.
  5. Yıkama boncuk PCR plaka üzerinde manyetik ise 200 μL taze % 80 etanol ile stand ve 30 için kuluçkaya s manyetik stand oda sıcaklığında. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.
  6. Yıkama için ikinci kez tekrarlayın.
  7. İkinci yıkama iyi pipet ucu herhangi bir kalıntı etanol kuyulardan kaldırmak ve 10 dakikadır kurutma hava izin vermek için kullanın.
  8. PCR plaka manyetik standından kaldırın ve her şey için 10 mM Tris pH 8,5 52,5 μL ekleyin. Pipet yukarı ve boncuk askıya almak ve 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya 10 kat aşağı.
  9. PCR plaka manyetik boncuklar toplamak ve 50 μL in süpernatant temiz bir PCR plakasına aktarmak için manyetik stand aktarın. Yapışkan bir açık PCR plaka mühür tabağa yerleştirin ve -20 ˚C bir hafta kadar saklayın.
  10. (İsteğe bağlı) Bir özel jel veya amplicon boyutta nicel ölçüm sağlar yüksek hassasiyet DNA tahlil dizin PCR ürünleri çalıştırma ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Bu çalışmada elde son dizin oluşturulmuş Kütüphane boyutu 668 yapıldı bp (şekil 3C-D).

11. ölçmek, normalleştirme ve sıralama için dizin oluşturulmuş kitaplıklar havuz

  1. Bir yer ve bir dsDNA floresan tahlil kiti ile her örneğinin DNA konsantrasyonu belirlemek (tablo malzemeleri görmek).
    1. 1: 200 seyreltme (1 µL karışımında arabellek ve reaktif içeren 199 µL dsDNA ana, her örneğinin) örneğinin dizin oluşturulmuş örnekleri ve standartları (190 µL dsDNA ana mix ve standart 10 µL) her biri için hazır olun. Bir yer dsDNA ayarı kullanarak analiz.
  2. DNA toplama hesaplama kütüphaneleri ortalama Kütüphane boyutu hesaplayarak normalleştirmek. Bunu bağdaştırıcısı uzunlukları, dizin uzunlukları ve V amplicon büyüklük--dan astar toplayarak ve gerçek boyutu (şekil 3C, bkz: 22) hesaplanan boyuta benzer olduğundan emin olmak için özel jel tarafından ürünleri görüntüleyin.
    1. Alternatif olarak, nicel ölçüm DNA bütünlük, amplicon boyutu ve konsantrasyon (malzemeler tablo, şekil 3D) sağlayan bir yüksek hassasiyet DNA tahlil kullanmaktadır.
      Not: Bu çalışmada, ortalama Kütüphane boyutu tabanlı bağdaştırıcısı uzunlukları, dizin uzunlukları ve V1-V3 amplicon büyüklük--dan astar özetleme hesaplanır. Ortalama boyutu 668 yapıldı bp.
    2. Tablo 8' formülü kullanarak örnekleri konsantrasyonları normalleştirilmiş.
  3. Seyreltik örnekleri 4 nM ve havuzu 5 μL sıralama için tek bir tüp içine her 4-nM örnekten.

12. sıra yeni nesil Sekanslama sistemi kullanarak kitaplığı ve verileri ayrıştırmak

  1. Kütüphanede sıra.
    Not: Bu çalışma için Utah Üniversitesi Yüksek üretilen iş genomik çekirdek Kütüphane denatürasyon ve ( 6,22içinde açıklandığı gibi) örnek sıralama yapılır.
  2. Verileri ayrıştırmak.
    Not: Havuza alınan örnekler veri ayırmak için dizin okuma tespit ve ( 22içinde açıklandığı gibi) ayrılmış.
  3. FASTQ dosyaları oluşturmak ve bu sonraki veri analizi için kullanmaktadır.

13. 16S Amplicon Kütüphane sıralanmış verileri çözümlemek

Not: Bu adımı Bice ve arkiçinde açıklandığı gibi gerçekleştirilir., 20176.

  1. (Bkz: Malzemeler tablo; serbestçe kullanılabilir veri çözümleme araçları'nı yüklemek 24).
  2. Demultiplexed fastq dosyaları (25,26' açıklandığı gibi) sıralanmış verileri topla. Tüm unassembled dizileri atmak.
  3. Protokolü ( 27açıklandığı gibi) malzeme çekme bir de novo açık taksonomik birimi (OTU) takip çözümlemesi.
    1. SampleID tarafından bir tek fastq dosyasına dizileri ve % 97'si veya daha büyük benzerlik OTUs, içine grup sıralarıyla 28içinde açıklandığı gibi bin. 150 ve yüzde 75 %'kimlik29,30en az sıra uzunluğu ile küme çekirdek temsilcisi dizileri hizalayın. Taksonomi açıklanan28atayın.
      Not: Örnekleri binned ve ardından taksonomik atama ve OTU tablo inşaat3231, analiz.
    2. Açıklayıcı adlar ve örnek kimliği için bağlantı ve eşleme dosyası33,34doğrulamak için örnekleri özelliklerini tanımlayan bir eşleme dosyası oluşturun.
    3. OTUs bir eşleme dosyası35kullanarak örnek açıklamaları için bağlantılar bir OTU ağ olun.
    4. Taksonomi özetleri göreli bereket açısından takson ile araziler36özetleyerek hesaplamak.
    5. Alfa örnekleri örnekleri için uygun tek tip sıralama derinlikte çeşitliliğini keşfedin. Alfa çeşitlilik için uygun derinliği tanımlamak için 37içinde açıklandığı gibi biome özetlemek-table komutunu kullanarak her örnekte gözlenen toplam sayıları özetler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çeşitli çalışmalarda zihin-beden tıp pratiği sağlık sonuçları geliştirir göstermiştir. Benzer şekilde, farelerde, çevre zenginleştirme geliştirilmiş ömrü ve tümör yara onarım6dahil sonuçları geliştirir. Bu nedenle, bir EE yordamı ilk microbiome (şekil 1) deney inisiyasyon önce normalleştirme sırasında bu fenotip microbiota rolünü tanımlama amacı ile geliştirilmiştir. Önemlisi, tüm üreme hayvan ıslahı başlamasından önce en az bir ay içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yordam, normal veya tümör hayvan taşıyan çevre zenginleştirme takip dışkı izole microbiota analizi için verir. Çünkü bunlar farklı cinsiyette ve genotip birçok hayvan elde etmek üreme dahil büyük deneyler, microbiome deney başlamasından önce hayvanlar arasında normalleştirme önemlidir sigara-EE önlemek için microbiome üzerindeki etkileri ile ilgili biyolojik çeşitlilik.

NE ve EE koşullar arasında tutarlılık sağlamak için üreme süreci tüm fareler başlangıçta aynı mikroplar maruz var ve bu ne...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar-si olmak hayır çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

B. Dalley'in Utah Üniversitesi Biyoistatistik temel istatistik tavsiye ve erişim için Ulusal Kanser Enstitüsü Ödülü P30 CA042014 tarafından desteklenen bu teknik çekirdek Utah Üniversitesi genomik çekirdek Kütüphane sıralama ve K. Boucher için teşekkür ediyoruz. Açıklanan proje Ulusal Kanser Enstitüsü hibe P01 CA073992 ve K01 CA128891 ve avcı kanser Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Teklad Diets/Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XStandart ışınlanmış yemek, Harlan Labs ile işbirliği içinde Dr. Mario Capecchi tarafından formüle edilmiştir.
Cell-Sorb Plus yatak takımıFangman Specialties82010Kullanmadan önce otoklav.
Neonatlar İçin AIMS Dövme SistemiAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Aramis Mikro Dövme Kiti de dahil olmak üzere diğer hayvan sınıfı dövme sistemleri ve mürekkepleri benzer sonuçlarla kullanılabilir.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Fare Mikro İzolatör Sistemi Kafes, AllerZone filtre üstü ve modüler diyet dağıtım sistemi ile tamamlandıLaboratuvar Ürünleri82120ZFHer EE kafesi, # 82120ZF, 82100ZF ve 82101ZF kataloglarının her birinden bir tane ve ayrıca 82109ZF'den iki tane gerektirir. Yiyecekler sadece bir tarafta.
Zyfone One Cage 2100 Ömür Zenginleştirme Cihazı LaboratuvarÜrünleri82109ZFHer EE kafesi, # 82120ZF, 82100ZF ve 82101ZF kataloglarının her birinden bir tane ve ayrıca 82109ZF'den iki tane gerektirir. Yiyecekler sadece bir tarafta.
Zyfone Bir Kafes 2100 Kafes 13-7/8" Uzunluk X 19-1/16" Genişlik X 7-3/4" Derinlik LaboratuvarÜrünleri82100ZFHer EE kafesi, # 82120ZF, 82100ZF ve 82101ZF kataloglarının her birinden bir tane ve ayrıca 82109ZF'den iki tane gerektirir. Yiyecekler sadece bir tarafta.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mikro İzolatör filtre üstüLab Ürünleri82101ZFHer EE kafesi, # 82120ZF, 82100ZF ve 82101ZF kataloglarının her birinden bir tane ve ayrıca 82109ZF'den iki tane gerektirir. Yiyecekler sadece bir tarafta.
TünelBio-ServK3323 veya K3332Kafesleri birbirine bağlayın ve zenginleştirme için kullanın
Tüneli kafeslere bağlamak için GrommetUtah Üniversitesi Makine Atölyesitarafından üretilmiştir n/aMalzemenin çiğnemeye karşı dayanıklı ve otoklavlanabilir olduğundan emin olun
Hızlı paletli tekerlekBio-ServK3250 veya K3251Fare iglosu ve zemin ile kullanın
Fare IglooBio-ServK3328, K3570 veya K3327Hızlı paletli tekerlek ve zemin
Fare Igloo zeminBio-ServK3244Fare Igloo ve Hızlı
Geçiş Fare KulübesiBio-ServK3272, K3102 veya K3271
Tarama TopuBio-ServK3330 veya K3329
Biyo-kulübeBio-ServK3352Barınma ve yuvalama için kullanılan odun hamuru kulübesi
Yapışkan film VWR60941-072Farelerin kaçmasını önlemek için büyük kafeste delinmiş deliği geçici olarak kapatmak için kullanın
Laminer Akışlı Havalandırmalı RafTechniplastBio-C36Bu çalışmada kullandığımız kabin şu anda tedarik edilmemektedir. Bio-C36 buna çok benzer.
1.5 mL Mikrofüj Tüpü- RNAse ve DNAse içermezHerhangi bir tedarikçi
QIAamp DNA Dışkı MiniKitQiagen51504Bu kit, 50 DNA preparatı için reaktif sağlar. dışkı lizis tamponu = ASL; Guanidinyum Klorür Lizis Tamponu = AL; Guanidinyum Klorür = AW1 ile Tampon 1'i Yıkayın; Yıkama Tamponu 2= AW2; EDTA = AE Su Banyosu ile Elüsyon Tamponu
(95 dereceye kadar ısıtma kapasitesine sahip)Herhangi bir tedarikçiDışkı örneklerinin hücreleri parçalamak için 94 derece inkübasyonu için.
Su banyosu (70 dereceye kadar ısıtabilir)Dışkı örneklerinin 70 derece inkübasyonu içinherhangi bir tedarikçi
Etanol (200 kanıt)Sigma AldrichE7023
Florometre: QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA geniş Aralıklı Test KitiThermoFisher ScientificQ32850
EB Tamponu veya 10 mM Tris pH 8.5Qiagen19086
Deneye özel primerlerHerhangi Bir Tedarikçi
PCR sınıfı suHerhangi bir tedarikçi
2X KAPA HiFi HotStart Hazır Karışım Kapa BiosystemsKK2601(1.25 mL, 100 rxns'ye izin verir).
Teşhis jellerini çalıştırmak için agarozHerhangi bir tedarikçi
TapeStation Yüksek Hassasiyetli D1000 Ekran Bant İzlemeAgilent5067-5583TapeStation veya Biyoanalizör cihazları, kütüphane kalitesini analiz etmek için Kurumsal Genomik Çekirdeklerde yaygındır. Alternatif olarak, bir Biyoanalizör DNA1000 Çip (Agilent, 5067-1504) kullanılabilir.
Agencourt AMPure XP Manyetik BoncuklarBeckman CoulterA63880PCR temizliği için macentik boncuklar - 5 mL, 250 PCR reaksiyonunu temizler
Manyetik standYaşam TeknolojileriAM10027
Kütüphanesi Hazırlama KılavuzuIlluminaIllumina. 16S Metagenomik Dizileme Kütüphanesi Hazırlığı: Illumina MiSeq Sistemi için 16S ribozomal RNA Gen Amplikonlarının hazırlanması. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Benzersiz Çift İndekslemeIlluminaIllumina Deney Yöneticisi YazılımıÜcretsiz olarak şu adreste mevcuttur: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 İndeks KitiIlluminaFC-131-1002Amplikonlara barkod eklemek için kullanılır
MicroAmp Optik 96 kuyulu reaksiyon plakasıUygulamalı Biyosistemler/ThermoFisherN8010560
TruSeq İndeks Plakası FikstürüIlluminaFC-130-1005
Yapışkanlı şeffaf plaka contasıUygulamalı Biyosistemler /ThermoFisher4360954Uygulamalı Biyosistemler/ThermoFisher Microamp v3
reaktifleri ve çift 300 bp okuma ile MiSeq ile yapışkan film dizilimiIlluminaMS-102-3003
PhiX Kontrol KitiIlluminaFC-110-3001
Proteinaz K (600 mAU/ml)Qiagen1913120 mg/ml proteinaz K'ye eşdeğerdir. QiaAmp kiti ile birlikte verilir
Veri Analiz AraçlarıQiimeQIIME yazılım AraçlarıKurulum, sisteminize göre farklılık gösterebilir ve QIIME web sitesinde çeşitli seçenekler açıklanmaktadır (http://qiime.org/install/install.html). Bu çalışma için MacQIIME 1.9.1 yazılım paketi kullanılmıştır (Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Step 13.2QiimeFastQ Birleştirme yöntemi ( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   Bu çalışma için http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html çoklu birleştirme eşleştirilmiş uçlar kullanılmıştır. Aronesty, E. ea-utils: Biyolojik dizileme verilerini işlemek için komut satırı araçları. İfade Analizi, Durham, NC. (2011).
Adım 13.3.QiimeDe-Novo OTU toplama protokolühttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Adım 13.3.1.kullanarak Taksonomik Birimleri (OTU'lar) açın. BLAST'tan daha hızlı büyüklük sıralarını arayın ve kümeleyin. Biyoinformatik. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/biyoinformatik/BTQ461 (2010).
Adım 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST: dizileri bir şablon hizalamasına hizalamak için esnek bir araç. Biyoinformatik. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/biyoinformatik/BTP636 (2010). 
Adım 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, kimera tarafından kontrol edilmiş bir 16S rRNA gen veritabanı ve ARB ile uyumlu çalışma tezgahı. Uygulama Çevresi Mikrobiyol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Bu çalışmada Greengenes sürüm 13_8 kullanılmıştır
13.3.1. Not: QiimeÇoklu Bölünmüş Kitaplıklarhttp://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Not: QiimePick de novo OTUs scripthttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
Adım 13.2.2.QiimeBir eşleme dosyası oluşturunhttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Adım 13.2.2.Qiime: Bir eşleme dosyasını http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html doğrulayın.
Adım 13.3.3.Qiime: OTU'yu örnek açıklamaya eşleme dosyasınahttp://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Adım 13.3.4.QiimeTaksonları çizimler aracılığıyla özetleyinhttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Adım 13.3.5.QiimeBiyom Özet tablosuhttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  Bu çalışmada, tüm örnekler 20.000 OTU'ya kadar nadirleştirildi ve ardından QIIME'de alfa nadirleştirme komut dosyası kullanılarak analiz edildi.
ile kullanım ile kullanım  Amplikon Amplifikasyonu için tarafından derlenmiştir. Uclust Edgar, R.C.

Kaynaklar

  1. Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
  2. Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
  3. Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome--Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
  4. Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811(2013).
  5. Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
  6. Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
  7. Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
  8. Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
  9. Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
  10. Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
  11. Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
  12. Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
  13. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
  14. Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25(2009).
  15. National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , National Academies Press. Washington, D.C. 220(2011).
  16. Silver, L. M. Mouse genetics : concepts and applications. , Oxford University Press. New York. (1995).
  17. Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
  18. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  19. Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
  20. Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, Pt 4 1263-1266 (2002).
  21. Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743(2012).
  22. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina. , Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  23. Illumina Experiment Manager. Illumina. , Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017).
  24. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  25. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , Durham, NC. (2011).
  26. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Paired Ends Script. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html (2017).
  27. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De-Novo OTU Picking Protocol. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html (2017).
  28. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
  30. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  31. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Split Libraries Fastq Script. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html (2017).
  32. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De Novo Otus Script. QIIME. , http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html (2017).
  33. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Links to Sample Identification. QIIME. , Available from: http://qiime.org/documentation/file_formats.html (2017).
  34. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Validation of Mapping File. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html (2017).
  35. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Link of OTUs to Sample Description Using Mapping File. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html (2017).
  36. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Summarize Taxa Through Plots. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html (2017).
  37. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Biome Summarize Table Command. QIIME. , Available from: http://qiime.org/documentation/summarizing_biom_tables.html (2017).
  38. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  39. Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
  40. Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
  41. Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849(2014).
  42. Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Tümör Modeli16S rDNA SekanslamaMikrobiyal DNA İzolasyonuDışkı ToplamaTümörijenezBağırsak MikrobiyotasıHayvan Bakımı
Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.