Method Article

Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

DOI:

10.3791/57183

⸱

April 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kağıt vitro hemangioblastomas (HBs) ve HBs rolü klasik tümör angiogenez bulunmaktadır olup olmadığını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam sunar. Sonuçları HB-neovaskülarizasyon karmaşıklığı vurgulamak ve bu sık görülen angiogenez HB neovaskülarizasyon sadece tamamlayıcı bir mekanizma olduğunu göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Von Hippel-Lindau (VHL) Tümör baskılayıcı gen inactivation insan merkezi sinir sistemi (MSS) içinde hemangioblastomas (HBs) gelişiminde önemli bir rol oynar. Ancak, saytolojik kökeni ve (neovaskülarizasyon dahil) HBs evrimsel süreci tartışmalı kalır ve anti-angiogenez VHL-HBs, klasik HB angiogenez üzerinde dayalı için klinik çalışmalarda hayal kırıklığı yaratan sonuçlar doğurmuştur. Anti-damar tedavi başarılı klinik çevrilmesi için bir diğer önemli engel vasküler Bu tümör neovaskülarizasyon kapsamlı bir anlayış eksikliğidir. Bu makalede, biz vitro HBs yanı sıra HBs rolü klasik tümör angiogenez bulunmaktadır olup olmadığını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam mevcut. Bu yordamla, araştırmacılar doğru HB neovaskülarizasyon karmaşıklığı anlamak ve bu sık görülen HBs angiogenez işlevini tanımlamak. Bu protokoller tümörleri tedavi anti-anjiogenik tedavi HBs için optimizasyon gelecekte çevirileri yardım için veya yüksek çevirim potansiyele sahip en umut verici Anti-damar tedavi tümör, değerlendirmek için kullanılabilir. Sonuçlar HB neovaskülarizasyon karmaşıklığı vurgulamak ve bu ortak form angiogenez HB neovaskülarizasyon sadece tamamlayıcı bir mekanizma olduğunu göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemangioblastomas (HBs) sadece insan sinir sistemi içinde (CNS) bulunan iyi huylu damar tümör vardır. Onlar von Hippel-Lindau (VHL) hastalığı veya sporadik lezyonlar olan hastalarda geliştirmek. VHL-HBs sık nüks nedeniyle cerrahi tedavi ile tedavi etmek zordur ve bu genetik neden çoklu lezyonlar1bozukluk. Ne kadar VHL Tümör baskılayıcı gen inactivation VHL-HBs tumorigenesis kök neden olarak, saytolojik kökeni (neovaskülarizasyon dahil olmak üzere) ve HBs evrimsel süreci büyük ölçüde tartışmalı2kalır. Bu nedenle, HB-neovasküler biyolojik mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını VHL-HBs için en umut verici Anti-vasküler stratejileri içine yararlı anlayışlar sağlayabilir.

Son araştırmalar HB-neovaskülarizasyon embryologic vasculogenesis3,4,5' e benzer olduğunu ileri sürdü. Klasik vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)-vasküler endotel kökenli ve fonksiyon kaybı VHL tarafından tahrik aracılı angiogenez sonuçlandı içinde yayılması ve olmuştur neovasküler oluşumu meydan6. 1965 yılında, Cancilla ve bulundu, Zimmerman elektron mikroskobu, HBs7endotel kökenli kullanarak. Daha sonra stromal hücreler vasoformative öğesi8' den türetilen bulundu. 1982 yılında, Jurco ve ark. stromal hücreler endotel kökenli9olduğunu buldum. Bu nedenle, biz insan vasküler endotel hücreleri HB-neovaskülarizasyon10orijinal hücrelerdir onaylanmadığına karar. VHL hasta ameliyat elde edilen HB hücrelerden birincil kültürler kullanmak daha iyi olsa da, önceki araştırma birincil kültürler HB kararlı değil ve hücre hatları kurulan3olamazdı göstermiştir. Ayrıca, HB-vasküler malzemeler10,11ataları içerdiğinden 3D çevre birincil kültürlerde HB-neovaskülarizasyon saytolojik kökeni teşhis değil. Bu nedenle, endotel hücrelerinin ilkel ve klasik model olarak insan vasküler endotel hücreleri (HUVEC) HBs için alternatif bir hücresel model hizmet verebilir.

Küresel çimlenme tahlil doku Mühendisliği12,13' te yeni bir modeldir. Bu yazıda, tahlil çimlenme küresel kullanarak 3D coculture kollajen tabanlı sistem vitro ile klasik tümör angiogenez HBs yanı sıra HBs rolü var olup olmadığını değerlendirmek için genel bir amacı da geliştirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem onaylı yönergeleri ve araştırma Etik Komitesi, Huashan Hastanesi, Bund'a Üniversitesi düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirildi. Karşılık gelen standart güvenlik önlemleri her adımda takip edildi. Şematik bir sunu için şekil 1' e bakınız.

1. hücre kültür ve plazmid yapı

  1. Rutin olarak Dulbecco içinde insan göbek damar endotel hücre (HUVEC) kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 birim/mL penisilin ve streptomisin oksijen %5 100 µg/mL takıma değiştiren'ın korumak CO2 kuluçka 37 ° C'de
  2. ShRNA parçası sentezi için Özet PLKO.1 plazmid ile APAI ve EcoRI. Oligonükleotid serisini VHL shRNA vektör CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14olduğundan emin olun.
  3. Sonra 20 µΜ sistem oligo, ters oligo 5 µL, 10 NF'leri arabellek x 5 µL ve (Toplam 50 µL birimdir) GKD2O birlikte 35 µL ileri 5 µL ile karıştırın. 4 dk ve yavaş yavaş aşağı oda sıcaklığına serin için 98 ° C'de karışımı bir kaç saat içinde ısı.
  4. Tavlanmış oligos ve PLKO.1 plazmid T4 ligaz 4 ° C'de birlikte gece için ligate. 16 h sonra 5 µL 25 µL yetkili DH5α hücrelere ligasyonu karışımı ekleyin. Sonra başarıyla ve birleştirilmiş plazmid ekran ve sıralama tarafından eklenen parça doğrulayın.

2. lentivirus paket ve enfeksiyon

  1. Toplamda, PLKO.1-shVHL veya PLKO.1-shScramble vektör 10 µg, plazmid psPAX2 ambalaj 7.5 µg ve zarf plazmid pMD2.G 500 µL fetal sığır serum (FBS) 25 min için olmadan DMEM medyanın içinde 2,5 µg karıştırın.
  2. 7 mLDMEM FBS olmadan yukarıda hazırlanan çözüm ekleyin.
  3. Kültür 293FT 10 cm çapında doku kültürü yemekleri FBS olmadan DMEM hücrelerde. 293 FT hücreleri hücre sayaç 1 x 107 olduğundan emin olun.
  4. Yukarıda transfection için 293 FT hücreleri Orta olarak hazırlanan çözeltinin 1 mL ekleyin.
    Not: 293FT hücre kültürünü 293F hücre satırından türetilir ve stabil SV40 büyük T antijen ifade eder. Bu nedenle, lentiviral üretim için uygun bir ev sahipliği yapmaktadır.
  5. % 10 içeren DMEM ile Kültür orta yerine FBS 6 h sonra.
  6. Bir pipet 48 h transfection sonra medya toplamak.
    Not: % 10 içeren DMEM virüs var FBS. Ortamdaki ölü hücreleri float. Steril 0,45 µm membran ölü hücreleri ve kirleri filtre uygulamak için kullanın. Genel olarak, enfeksiyon (MOI) çokluğu denetlemek için gerek yoktur. Bu bir istikrarlı hücreleri çizgi oluşturmaktır. Son adımda, başarılı enfeksiyonu olmadan tüm canlı hücreler tarafından puromisindir ölecek. ShScramble grup ve HUVEC hücreleri kontrol grubu vardır. Tüm HUVEC hücreleri 72 h tarafından kullanılan puromisindir konsantrasyon ile ölmek emin olun. Her şey aynı sayıda hücre vardır.
  7. Lentiviral medya için 72 h HUVEC hücrelerde kültür. Daha sonra puromisindir HUVEC hücre 2 µg/mL 24 h kullanım HUVEC hücreleri kontrol grubu olarak herhangi bir tedavi için bir konsantrasyon, medya ekleyin. Tüm bu zamana kadar hücreleri die kontrol emin olun.
    Not: Canlı hücreler VHL devirme hücreleri ve shSramble hücreleri istikrarlı hücre kültürünü temsil eder. Kaplama 5.000/96-şey levha iyi yoğunluğudur.

3. nesil endotel hücre pulcuklarının

  1. HUVECs hücre trypsinize ve % 10 DMEM orta resuspend FBS. Hücre 10 cm kültür tabak içinde ılımlı sayısı ile 1 mL typsin-EDTA ekleyin.
  2. 1 × 103 hücreleri/iyi bir hücre yoğunluğuna, 3D bir yuvarlak alt 96-şey plaka hücrelerde tohum. Küresel askıya almak için 0.50 µL küresel ağırlayacak iyi kullanın. Üreticinin yönergelerini izleyerek bir hücre sayaç sistemi kullanarak hücreleri saymak.
  3. 37 ° C ve 72 h için sürekli olarak % 5 CO2 hücreleri kuluçkaya. Bu koşullar altında askıya alınan hücrelerin hücre pulcuklarının otomatik olarak oluşturmak emin olun. Kültür orta yarısı 36 h sonra değiştirin.

4. vitro angiogenez tahlil

  1. Jel çözüm 4 ° C'de erimek ve ile indirimli serum orta seyreltme oranı 1:5 oranında seyreltin.
  2. Bir micropipette ile DMEM kültür ortamdan pulcuklarının emmek. Yıkandıktan sonra düşük serum orta 5 mL ile pulcuklarının askıya pulcuklarının yavaşça ve dikkatli seyreltilmiş jel. Hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
  3. Karışık sıvı 300 µL bir 15-şey tabak içinde embed. 37 ° C ve 1 h için % 5 CO2 kuluçka sonra 400 µL düşük serum orta her şey için ekleyin. Buharlaşma engellemek için oksijen bir ortam oluşturmak için kuyu etrafında steril su doldurun.
  4. Bundan sonra kültür plaka 37 ° c için 1 h %100 nem oranı, % 5 CO2 .
  5. Dikkatle eski orta Aspire edin ve düşük serum orta % 1 endotel hücre büyüme takviyeleri her iyi ile 600 µL tarafından değiştirin.
  6. 12 saat veya 24 saat sonra bir ters ışık mikroskobu altında görüntü almak (40 *).

5. veri analizi

  1. Filiz uzunluğu veri (Tablo reçetesi) elde etmek için çevrimiçi görüntü analiz platformu için resim yüklemek.
  2. Web sayfasında, e-posta ile bir hesap oluşturun.
  3. O zaman Resim Yükle düğmesini tıklatarak yüklemek.
  4. Sonuç karşıdan yükle düğmesini tıklatarak karşıdan yükleyin.
    Not: Yazılım işlenmiş görüntü ve veri oluşturur. Beş bölümden verileri içeren: toplu Filiz uzunluğu, ortalama Filiz uzunluğu, Filiz uzunluğu, Filiz alanı ve küresel alan standart sapması. İşlenmiş görüntüde her parametre tanımlama işlenen görüntünün içinde kolaylaştırmak için farklı bir renkte ana hatlarıyla: kırmızı temsil lahanası iskelet, lahanası sayısı sarı, Filiz yapısı, beyaz Filiz end ve turuncu küresel mavi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orijinal görüntüleri ters ışık mikroskobu tarafından alınır. Kontrol grubu ve VHL grup tipik görüntüleri Şekil 2' deki-A1 ve Şekil 2-A2. Kontrol grubu çimlenme uzunluğu VHL grup kısadır.

Görüntüleri yükledikten sonra online platformu doğrudan çözümleme sonuçlarını sağlar. Çıktı iki bölümden oluşur: işlenmiş görüntü ve karşılık gelen ana...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda, birden çok alanı vasküler Biyoloji Araştırma anjiogenik endotel15çalışma tarafından teşvik. Bu makalede, geliştirdiğimiz bir endotel küresel roman aday molekülleri tanımlamak için işlenmiş endotel hücrelerindeki fonksiyon kaybı VHL Gene'in kaynaklandığı damar oluşumu çalışmaya deneysel bir model olarak teknik çimlenme anjiogenik cascade. Bizim bilgi en iyi şekilde endogenic değiştirilmiş endotel hücreleri anjiogenik etkilerini incelemek için ilk rapor bu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser hibe Shanghai komite bilim ve Teknoloji (15411951800, 15410723200) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Prof. YuMei Wen ve Prof. Chao Zhao patojen mikroorganizma bölümü Bund'a Üniversitesi Teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
insan göbek damarı endotel hücresiFudan IBS Hücre MerkeziFDCC-HXN180
dulbecco' s modifiye kartal' S Orta Gibco11995040
fetal sığır serumuGibco 
PLKO.1-puro vektörAddgene# 8453
paketleme plazmidi psPAX2 Addgene# 12260
zarf plazmidi pMD2.GAddgene# 12259
3D yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakalarS-BioMS-9096M
matrigelBD Biosciences354234
Opti-MEM ortamıGibco31985-070azaltılmış serum ortamı 
15 oyuklu plakaIbidi81501Jeldeki hava kabarcıkları, &mu'nun dengelenmesiyle azaltılabilir; – İnkübatör içinde kullanmadan önce slayt anjiyogenezi gece boyunca
endotel hücre büyüme takviyeleriSciencell#1052
10 cm'lik kültür kabıCorningScipu000813
PuromycinGibcoA1113802
typsin-EDTAGibco25200056
Otomatik Hücre Sayıcı Sistemi  BioTech
Görüntü Analiz yazılımı Winmasishttp://mywim.wimasis.com 
26400044

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
  2. Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
  3. Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
  4. Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102(2014).
  5. Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
  6. Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
  7. Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
  8. Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
  9. Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
  10. Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
  11. Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
  12. Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
  13. Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
  14. Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
  15. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  16. D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).
  17. Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
  18. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
  19. Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019(2014).
  20. Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
  21. Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
  22. Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
  23. Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
  24. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
  25. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemangioblastoma NeovascularizationSpheroid Sprouting AssayVHL Gene SilencingEndothelial Cell CultureLentiviral Vector TransfectionHUVEC Cell LineSprout Length AnalysisIn Vitro AngiogenesisTumor VasculogenesisCapillary Formation Assay

Related Articles