Method Article

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

DOI:

10.3791/57188

⸱

May 31st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreler (DC) onların hücre zarı işaretleyicileri, geçiş desen ve dağıtım ve antijen sunumu ve T hücre harekete geçirmek kapasiteleri farklı türdeş olmayan hücre popülasyonlarının vardır. Deneysel tümör modellerin çoğu aşıları DC milyonlarca gerektiren bu yana, dalak ve kemik iliği yaygın olarak izole edilmiştir. Ancak, bu DC önemli ölçüde farklı kan ve tümör verdikleri yanıtlara DC bağışıklık kompleksleri (IC) ve muhtemelen diğer Syk birleştiğinde lektin reseptörleri. Önemlisi, DC duyarlılığını tehlike ilişkili moleküllerin göz önüne alındığında, endotoxins veya crosslink harekete geçirmek reseptörleri birinde yalıtma, adım adım yol gösteren antikor varlığı neden DC astar içinde ve böylece Parametreler etkiler ya da en azından Dozaj, onları harekete geçirmek için gerekli. Bu nedenle, burada biz onların erken harekete geçirmek kaçınırken kan ve tümör oluşmuş MoDC izole için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir protokol ile tümör IC MoDC harekete geçirmek ve onların daha sonraki analizler için sağlanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onların keşif beri dendritik hücreler (DC) kapsamlı bir araştırma T hücre farklılaşması1eğriltmek için benzersiz yetenekleri nedeniyle bir odak noktası olmuştur. Son birkaç on yıl içinde bir kapsamlı bir araştırma çaba tümör ilerleme ve bağışıklık 2sırasında çeşitli DC alt kümeleri ve işlevleri tanımlamak araştırmıştır. DCs onların örüntü tanıma reseptörleri, doku dağıtım, birbirinden farklı türdeş olmayan hücre popülasyonlarının oluşan ve göçmen ve antijen sunumu yetenekleri3,4,5. Diğer DC alt kümeleri için karşılaştırıldığında, monosit kaynaklı DC (MoDC) tümörleri içinde çok daha bol ve döngüye girmesini kolayca oluşturulabilir veya tümör infiltre monosit6,7. Bu nedenle, onların göreceli yaygınlık yararlanmak isteyen birçok klinik T hücre bağışıklık 8,9temin için otolog MoDC vivo içinde ve ex vivo manipülasyon temel alır.

Benzer şekilde, DC-esaslı aşı deneysel tümör modelleri 2-3 seri enjeksiyon, 5-7 gün arayla 1-2 x 10 gerektirir harekete geçirmek DC geniş puls tümör antijenleri ile6 . Bu nedenle, bu sayıda DC elde etmek için çoğu fare çalışmalar öncelikle 7-9 gün (IL-4 Fare ayarlarında gerekli değildir) kemik iliği (BM) GM-CSF kara filmin tarih öncesi gelen kültürlü MoDC kullandım10,11. Yine de, bu GM-CSF nakavt fareler var genel olarak normal DC yuvası 12,13ve o kültürü, elde edilen karışık nüfus göz önüne alındığında14 bu DC fizyolojik alaka soru içine çağrıldı.

Alternatif olarak, DC dalak hücrelerden rutin olarak izole olabilir. Ancak, DC oluşturan yaklaşık 0,3-%0,8 Toplam dalak hücre (yaklaşık 7 x 105 ' te DC/dalak kaynaklanan) ve bu hücreler, sadece CD103+ DC ve MoDC lenfoid organlar için geçiş. Dalak DC nüfusu15,16yaklaşık % 10-15 MoDCs oluşturan beri çoğu yalıtım protokolleri yaklaşık 1 x 10-5 MoDC dalak verim. MoDC genişleme GM-CSF, dalak MoDC17100-fold bir artış sonuçlanan salgılar transfected B16 hücreleri enjekte edilerek elde edilebilir. Bu yordamı insanlar ve elde edilen mümkün değil ancak, DC aşı geliştirmek için MoDC kullanımı sınırlı vardır MoDC zaten çok aktif.

Yeterli adet DC elde etmek ek olarak, otolog kanser hücrelerine karşı etkili DC aşı geliştirmek için başka bir sorun tam olarak DC etkinleştirmek için yeterli tehlike sinyalleri tümör ortamda eksikliği içerir. İndüksiyon co-stimulatory sinyal genellikle örüntü tanıma reseptörleri (PRR) veya c tipi lektin sinyal yolları18,19,20,21aktivasyonu ile elde edilir. DC etkinleştirmek için başka bir yaklaşım yeteneklerini antijenleri yüzey Fcγ reseptörleri (FcγR) ile etkileşimleri aracılığıyla almak için kullanır. Gerçekten de, bir dizi önemli el yazmaları göstermiştir MoDC enjeksiyon BM öncüleri harekete geçirmek ile gelen tümör-IC IgG ki tümör büyüme profilaktik ayarlarında engelleyebilir ve kurulan tümörler22,23 ortadan kaldırılması için yol açabilir .

İki son gazetelerde Carmi BMDC ve dalak DC aksine, MoDC kan ve tümör ek uyaranlara karşı IgG IC yanıt veremiyor keşfetti. Bu FcγR24,25sinyal düzenleyen Tirozin fosfatazlar yüksek hücre içi düzeyde varlığı nedeniyle bulundu. DC'de kritik bir denetim noktası tanımlayarak, bu eser başarılı DC-esaslı aşı için gereksinimleri önemli bir içgörü sağladı. Sinyal ve muhtemelen benzer bir fosforilasyon çağlayan kullanan diğer lektin reseptörleri sinyal FcγR etkinleştirmek ek bir çekim gücü gereksinimini böylece DC astar onların yalıtım sırasında kaçınmak gereğini vurgular.

Bu nedenle, mevcut protokol MoDC yalıtım kan ve belirgin BM ve dalak DC farklı, tümör açıklar ve önlemler işlemi sırasında dikkate değer vurgulamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare MoDC yalıtım için aşağıdaki protokolleri bakın, henüz genel ilkeleri diğer DC alt kümeleri hücreleri için de geçerli olabilir. 12 - 16-hafta-yaşlı C57Bl/6j fareler bir Amerikan Derneği Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı-akredite hayvan tesisi için muhafaza. Tüm iletişim kuralları Stanford Üniversitesi ve Tel-Aviv Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. yalıtım tümör monosit kaynaklı DC ilişkili

  1. Laminar akış başlıklı tümörler CO2 ötenazi fareler kaldırmak ve fetal Sığır serum (FBS) olmadan RPMI orta tümör yer.
    Not: Fareler tıraş ve onları potansiyel contaminations kürk üzerinden en aza indirmek için tümörleri, kaldırmadan önce % 70 etanol ile sprey için önerilir. Daha büyük tümörler genellikle kırılgan ve hücre ölümü geçmesi eğilimli daha az DC beri tümör 25-40 mm2 geçmediği emin olun. Daha büyük adet DC gerekiyorsa, her fare tümör hücreleri birden çok site ile enjekte edilebilir.
  2. Steril bir laminar başlık altında küçük parçalar halinde (yaklaşık 1 x 1 mm2) cerrahi makas kullanarak tümör doğrayın.
    1. 5 mL Hank'in de içeren bir 30 mL steril düz-alt tüp manyetik heyecan çubuklarla içine bir fare tüm tümör parçalardan dengeli tuz solüsyonu (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV ve 0.01 mg/mL DNaz ekleyin ben.
      Dikkat: Myeloid hücrelerin glikozilasyon, kararlı duruma altında bile yoluyla enerji üretmek. Bu nedenle, 10-15 dk kadar az glukoz açlık olarak glikoz (örneğin HBSS, RPMI ve DMEM) içeren tek kullanım medya hücre ölümü ve Apoptozis 24 h sadece düşük endotoksin collagenase IV, collagenase gram-pozitif tarafından üretilen kullanım içinde neden olur bakteri (Clostridium histolyticum).
  3. Yaklaşık 200-400 rpm 37 oC kuluçka 20-30 dk için manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın.
  4. 5 mL tam medya ekleyin ve şiddetle yeniden askıya.
  5. Hücreleri bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. 4 oC 400 rcf hücreleri cips için 5-10 dakika için santrifüj kapasitesi.
    Dikkat: bazı tümör nekrotizan ve hücre artıkları veya hücre dışı matriks nispeten büyük miktarda içerir enzimatik sindirim, doğrudan aşağıdaki hücreleri izole girişiminde bulunmaz. Hücreler yalnızca hücreleri elde etmek için % 15 yoğunluk gradient medyada geçerlidir.
  6. Yoğunluk gradient orta 9 mL 10 x PBS osmolalite ayarlamak için ve % 100 Percoll hisse senedi çözüm elde etmek için 1 mL ile askıya alma. Mix 1.5 mL yoğunluk gradient orta çözüm 8,5 mL HBSS ile stok ve kuvvetle tümör türetilmiş hücre Pelet ile karıştırın. Yavaşça DMEM 2 mL % 15 yoğunluk gradient orta ve oda sıcaklığında 20 dakika için 400 rcf, santrifüj üst katman. Hücreleri bir Pelet tüpün dibinde oluşturacak gibi supernatants atın.
    1. Pelleted hücreleri iki kez onları 10 mL %2 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve 10 mM EDTA (yalıtım arabellek) ve santrifüj 4 oC 400 rcf 5-10dk için hücreleri cips için içeren HBSS yeniden askıya tarafından yıkayın.
    2. Trypan ışık mikroskop altında mavi kullanarak bir hemasitometre üzerinde hücreleri hesaplama.
  7. 1 x 108 hücrelerde yeniden askıya 1 mL yalıtım tampon ve onları 4 oC ile CD11b 30 μL, kuluçkaya+ Birleşik 15dk için manyetik boncuklar.
    Uyarı: Bu DC etkinleştirmek ve hücre ölümüne neden gibi boncuk, CD11c Birleşik kullanmaktan kaçının. FcγRII ve FcγRIII anti-CD16/32 antikorlar ile engelleme girişiminde bulunmaz. Antikorlar engelleme FcγR ligate ve harita kinaz güçlü fosforilasyon teşvik ve DC Başbakan.
    1. 4oC. 5-10 dakika için 400 rcf, yalıtım arabellek ve santrifüj hücre 9 mL ekleyerek fazla ilişkisiz boncuk kaldırmak
  8. Süpernatant Aspire edin ve 1 mL yalıtım arabellek hücrelerde yeniden askıya alma. Hücreleri alışım manyetik sütun üzerinde geçerlidir. Sütun iki kez yalıtım arabellek 3 mL ile yıkayın.
    1. Sütunu mıknatıs kaldırın. Yalıtım arabellek sütuna 6 mL pipet ve pistonu iterek bir steril toplama tüp manyetik olarak etiketli hücrelere dışarı floş. 4 oC. 5-10 dakika için 400 rcf santrifüj hücreleri
    2. Senaryo Özeti 100 μL başına 1 x 107 hücre yeniden askıya alma ve leke aşağıdaki fluorophore Birleşik antikorlar ile: hiza negatif (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI ve Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
  9. Hücreleri yan dağılım (SSC) kullanarak küçük hücreler çoğunluğuna göre sıralamak ve ileri dağılım (FSC) ve kültür tam orta 5 ng/mL ile GM-CSF desteklenmiştir. 1 saat 3 7 hücreleri kuluçkaya makrofajlar plaka uygun izni vermesi için oC. O zaman, transferi gevşek ve yeni bir kültür tabak yapışık olmayan hücrelere.
    Not: Fare MoDC CD11b tanımlanır+/CD11c+/MHCIIMerhaba/Ly6Clo/int 7,26,27. Tümör modelleri arasında ve bazı modellerde (örneğin LMP) ifade Ly6C önemli ölçüde değişebilir MoDCs tamamen Ly6C ifade eksikliği. Genel olarak, bir 100 mm3 B16F10 tümör genellikle yaklaşık 4-5 x 106 toplam hücreleri sonuçlanan DC, 5 x 104 içerir. Bu hücrelerin % 10-15 bağışıklık hücreleri ve % 8-10 MoDC. DC sayıları artan tümör birden çok site ile farelere enjekte edilerek elde edilebilir. Sıralama yalnızca küçük SSC/FCS hücreleri, işaretleri CD11c ve Ly6C gibi diğer myeloid hücre olarak ifade edebilir.
    İsteğe bağlı: tümör infiltre monosit Ly6CMerhaba ifade ve MHCII için negatif olan küçük SSC/FSC hücreler olarak sıralayın. Daha sonra monosit vitro 50 ng/DC elde etmek için mL GM-CSF ile kültür.

2. izolasyon monosit kaynaklı DC'den periferik kan

Not: Olgun MoDCs fare kanıyla nispeten nadir olduğundan, aşağıdaki protokol için onların türetme vitro sıralanmış monosit anlamına gelir.

  1. Monosit kan düzeylerini artırmak için fare ile % 4 isoflurane anestezi ve subkutan enjekte (SC) GM-CSF 50 μL PBS içinde 1 μg ile.
  2. 1-2 h sonra CO2kullanarak fare kurban.
    Dikkat: Bu iç kanama neden olur gibi fareler tarafından servikal yerinden çıkması, kurban değil.
  3. Hemen euthanization sonra fareyi % 70 etanol ile sprey ve steril laminar akış başlık altında cerrahi makas kullanarak kalp kapakları deri kaldırmak. Etanol makasla temiz ve kalbin sağ atrium kesti. Yavaş yavaş, 20 mM EDTA bir 10 mL şırınga ve 25-G iğne kullanarak HBSS ile sağ ventrikül kalbine sifonu çek.
    1. Kan ile steril enjektör heparan sülfat ve EDTA içeren bir steril tüpe plevral boşluğundan toplamak. Kalp karaciğer ve haline akciğerleri pembe veya beyaz kadar temizlemek devam edin.
  4. 15 dakika oda sıcaklığında 400 rcf adlı bir yoğunluk degrade mediumand santrifüj kan düşük tut ile uygulanır.
    Uyarı: Kullanım yoğunluğu endotoksin-Alerjik degrade Orta (genellikle az 0,12 EU mL başına).
    1. Mononükleer hücreler yeni bir tüp içine toplamak. Hücreleri 10 ml %2 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve 10 mM EDTA (yalıtım arabellek) ve sonra 4 ocentrifuging içeren HBSS C 400 rcf hücreleri cips için 5-10 dakika için yeniden askıya tarafından yıkayın.
      Uyarı: en az 1 g/M glikoz içeren medya kullanın.
  5. CD11b pozitif seçim için 1 x 108 hücre 1 mL yalıtım arabelleği yeniden askıya almak ve onları CD11b Birleşik manyetik boncuklar 4 oc de 15 dakika 50 μL ile kuluçkaya
    1. Aşırı boncuk yalıtım arabelleği 9 mL ekleme ve 5-10 dk 4 oC. aspiratı az için 400 rcf adlı supernatants centrifuging yıkama ve 1 mL yalıtım arabellek hücrelerde yeniden askıya alma. Hücreleri alışım manyetik sütun üretici yönergelerine göre uygulayın.
    2. Sütunu mıknatıs kaldırın, yalıtım arabellek sütuna 6 mL pipet ve pistonu iterek bir steril toplama tüp manyetik olarak etiketli hücrelere dışarı floş. Senaryo Özeti için 5-10 dk 4 oC. yıkama az 400 rcf santrifüj kapasitesi iki kez ile 3 mL yalıtım arabellek sütun.
    3. 1 x 107 hücreler/100 μL yalıtım arabellek ve aşağıdaki fluorophore Birleşik antikorlar ile leke hücreleri yeniden askıya alma: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII ve 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 hücreler.
  6. Hücreleri küçük yan dağılım (SSC) ve küçük ileri dağılım (FSC) hücreleri çoğunluğuna göre sıralayın.
    Not: Fare inflamatuar monosit genellikle CD115 tanımlanan+/MHCIIlo/neg/Ly6CMerhabave monosit devriye CD115 tanımlanan+/MHCIIlo/neg/Ly6Cnegatif 4,5. İki alt kümeleri arasında hiçbir ayrım gerekli olan nerede durumlarda, SSClo/FCSlo/CD115 toplam+/MHCIIlo hücre sıralanır. Naif ve tümörü taşıyan fareler içeren yaklaşık 5-8 x 104 MoDC 1 mL kan ve ilâ başına 4-5 x 105 MoDC şu GM-CSF enjeksiyon. Biri, yaklaşık % 70'i inflamatuar monosit vardır ve % 30 monosit devriye.
  7. 1 x 106 hücre/mL 20 ng/mL ile GM-CSF takıma tam bir medya bir konsantrasyon hücreleri plaka. 1 gün sonra yapışık olmayan ve gevşek yapışık hücreleri transfer için bir yeni plaka ve kültür için ek bir 4-5 gün.
    Dikkat: DC medya pyruvate ile takıma değil.

3. bağışıklık kompleksleri tümör IgG hazırlanması

  1. 75 cm2 kültür şişesi % 70 izdiham tam DMEM medyada için kültür tümör hücreleri.
    1. 2 mL % 0.25 tripsin/EDTA aşırı trypsinization önlemek için hafif bir mikroskop altında kültür şişesi ve monitör hücre morfolojisi hücrelerden ayırmak için ekleyin.
    2. 8 mL (başına tripsin 2 mL) tam kültür ortamının tripsin sindirim inhibe ve, 4 oC, hücreleri cips için 5-10 dakika için 400 rcf santrifüj kapasitesi için ekleyin.
      Not: ticari bir PCR kiti kullanarak Mycoplasma için tümör hücreleri kontrol ettiğinizden emin olun. Ayagin Gram-negatif bakteri ve mantar endotoxins Limulus Amebocyte Lysate (LAL) kullanarak varlığı için test tahlil28). Serum 0,22 mikron filtre ve 9 kod Federal Düzenlemeler virüsler için test gerekir. Ayrıca, test Kültür Medya ve serumlar 37 oC. günde 2 için 100-200 μL LB agar veya et suyu ve kültür üzerine bırakarak
    3. Yıkama hücreleri tekrar Aspire edin onları yeniden 10 mL PBS ve 400 rcf, santrifüj 5-10 dakika süreyle askıya tripsin ve serum kalır dan süpernatant ve yıkama 2 kez daha tekrarlayın.
  2. Arabelleğe alınan % 1.8 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika hücrelerde düzeltmek.
    1. Hücreleri onları 10 mL PBS ve 5-10dk için 4 oC 400 rcf, santrifüj yeniden askıya tarafından yıkayın.
    2. Aspire edin supernatants ve tekrar iki kez daha yıkayın.
      İsteğe bağlı: tümör alımını deneyleri için hücreleri onları 37 oC 1 mikron carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) içeren PBS, 5 min için kuluçka etiketli. CFSE sonra buz 10 min için komple medya ile söndürülür. Hücreleri PBS %2 serum içeren kalan boya kaldırmak için kapsamlı bir şekilde yıkanmalıdır.
  3. FACS arabellek (PBS takıma % 2 FCS ile + 5 mM EDTA) ve anti-CD16/32 0.5 μg/mL hücrelerinde potansiyel non-spesifik protein-protein etkileşimleri engellemek için yeniden askıya alma. Bir U-şekil 96 kuyu/plaka 100 μL başına 1 x 105 hücre bir konsantrasyon, plaka.
    1. Tümör-bağlama antikorların 5 μg - 5 ng/1 x 105 hücreleri arasında değişen farklı dilutions eklemek. Plaka 15-20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
      Not: IgG antikorlar saf 20-24 hafta yaşlı kadın fareler üzerinde protein A sütunları, serum açıklanan24olarak yalıtılmış.
  4. PBS 150 μL ekleyip 5-10 dk 4 oC 400 rcf plaka centrifuging hücreleri yıkayın.
    1. Supernatants atmak ve yıkama iki kez tekrarlayın. 100 μL FACS arabellek fluorophore Birleşik ikincil antikor içeren hücrelerde yeniden askıya alma. Plaka 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    2. Yıkama hücreleri 200 μL FACS arabelleği ekleyerek ve 5-10 dakika süreyle 400 rcf plaka centrifuging supernatants atın ve yıkama yineleyin.
    3. Tümör bağlama akış sitometresi tarafından analiz ve hücreleri kat için gerekli en az konsantrasyonu belirlemek.
      Not: ortalama floresans yoğunluğu (MFI) tarafından lekeli tümör hücrelerinin en az beş üzerinde izotip kontrol artırmayın antikorlar sonraki fonksiyonel deneyleri kullanılmamalıdır.

4. MoDC IC tümör IgG ile aktivasyonu

  1. 3.1 3.4.3 aracılığıyla bölümlerde açıklandığı gibi tümör hücreleri en az düzeyde IgG konsantrasyon ile kat
    1. MoDC IC, tümör ile aktive önce bir gün GM-CSF içerir MoDC kültür ortamı değiştirin. Bunu yapmak için yavaşça medya Aspire edin ve hücreleri bir kez önceden ısıtılmış tam kültür medya ile yıkayın.
      Not: İzole olgun tümör ilişkili MoDC en az 2-3 h (veya hatta bir gecede) sıralama sonra GM-CSF olmadan tam medya ve onları IC ile aktive önce kültürlü.
    2. Tümör alımını analizleri, CFSE etiketli tümör IC MoDC için bir oranı 1:5 (IC:MoDC) ekleyin ve gecede 12-16 saat 1 ml 1 x 106 DC başına komple medya için kuluçkaya.
    3. FACS analizleri MoDC harekete geçirmek deneyler için 1:1 (IC:MoDC) oranında tümör-BM ekleyin ve gecede 12-16 saat için kuluçkaya.
      Not: Oldukça iyi, olumlu bir denetimini eklemek için tavsiye edilir hangi MoDC içinde 1 μg/mL ile LPS veya diğer TLR agonistler teşvik vardır.
    4. Gecede harekete geçirmek, takip Aspire supernatants ve yıkama hafifçe üç kez hücreleri yalıtım arabellek veya 10 mM EDTA HBSS.
    5. DC plaka ayırmak için 2-3 dk 1 ml HBSS 10 mM EDTA içeren hücreleri kuluçkaya ve dinç pipetting hücreler bağlantısını kesin.
    6. Senaryo Özeti 400 rcf santrifüj kapasitesi ve 1 x 106 DC ' 90 μL PBS % 2 FCS, 5 mM EDTA (FACS arabellek) ve antikorlar engelleme 0.5 μg takıma yeniden askıya alma. 5-10dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    7. Hücreleri antikorları karışıma boyama 10 μL ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    8. Hücreleri ve 5-10dk için 4 oC 400 rcf, santrifüj 2 mL FACS arabellek ekleyin.
  2. Hücreleri 200 μL FACS arabelleği yeniden askıya alma.
    1. 0,5 - eklemek DAPI 1 μg/mL 1-2 dk analizleri ölü hücreleri dışlamak için örnekleri, çalıştırmadan önce. MoDC bu 10-15 dk içinde almak gibi DAPI, aşırı kuluçkaya değil.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz başlangıçta tümör hücreleri bağlamak için saf syngeneic ve allojenik fareler gelen antikorlar kapasitesine göre. Bu amaçla, B16F10 ve LMP tümör hücre hatları paraformaldehyde içinde sabit ve kapsamlı bir şekilde yıkanmış. B16F10 C57Bl/6 farelerde akciğer Metastazlari üzerinden aslında izole bir melanom hücre çizgi var. LMP olduğunu KrasG12D izole bir pankreas tümörü hücre / + LSI-Trp53R172H / + ve Pdx-1-Cre fare ve giderek 129F1 farelerde büyür. IC elde etmek için tümör hücreleri başı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler telkih için gerekli DC çok sayıda göz önüne alındığında (yaklaşık 2-4 x 106 DC bir fare başına), farelerde stratejileri yalıtım DC BM ve onların ex vivo harekete geçirmek tarafından takip dalak dayalı aşılamanın en. Ancak, saldırılara tümör DC in vivodalak ve BM DC etkinleştirmek için aynı koşullar kullanarak, etkinleştirmek kez etkili bağışıklık üretiminde başarısız oldu. İki sonraki yayınlarda Karmi ve ark. Onlar doğal olarak yüksek iç Tirozin fosfataz düzeyleri ayı ve prim...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması ve onlar ifşa etmek hiçbir şey olduğunu bildirin.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepKök Hücre Teknolojileri07820
CD45 Mikro BoncuklarMiltenyi130-052-301
EasySep Monosit İzolasyon KitiKök Hücre Teknolojileri19861
Kollajenaz IVSigmaC9697-50MGEndotoksin için her lotu test edin
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Endotoksin için her lotu test edin
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biyoefsane105017
APC/CY7-Ly-C6Biyoefsane108423
PE/CY7-CD15Biyoefsane135523

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165(2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte derived Dendritic CellsImmune Complex ActivationTumor Cell IsolationBlood Cell IsolationMagnetic Bead SeparationDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisCD11b Cell SelectionCFSE labeled Tumor ComplexDendritic Cell Activation

Related Articles