Yöntem makalesi

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

10.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57191

⸱

6 Şubat 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.

Özet

Sepsis organ yetmezliği ve doku neden olabilir şiddetli enfeksiyon türüdür hasar. Mortalite ve morbidite oranları sepsis ile ilişkili, ancak son derece yüksek, hayır doğrudan tedavi vardır veya mekanizma organ ile ilgili ayrıntılı gerçek zamanlı olarak inceledi. Karaciğer toksinleri ve enfeksiyonlar insan vücudunda yönetir anahtar organdır. Burada, nötrofil ve karaciğer kapsüler makrofajlar (LCMs) gibi bağışıklık hücreleri hareket izlemek için fare karaciğer intravital görüntüleme sonra endotoksemi indüksiyon gerçekleştirmek amaçladık. Buna göre bir roman cerrahi yöntemi pozlama minimal invaziv cerrahi ile karaciğer için tasarlanmış. Fareler intraperitoneally ile lipopolysaccharide (LPS), bir ortak endotoksin enjekte edildi. Pozlama ve LPS tedavi LysM-yeşil flüoresan protein (GFP) fare karaciğer, o nötrofil bulduk alımı intravital görüntüleme için bizim yeni cerrahi yaklaşım kullanarak fare karaciğer bununla fosfat tamponlu göre artış serum fizyolojik tedavi karaciğer. LPS tedaviden sonra nötrofil sayısı önemli ölçüde zamanla arttı. Ayrıca, CX3Cr1-GFP fare kullanarak, biz başarıyla karaciğer ikamet makrofajlar LCMs adı görüntülenir. Bu nedenle, bağışıklık hareketlilik vivo içindekontrol etmek için yeni reaktifler etkinliğini araştırmak için hareketliliği ve nötrofil ve LCMs morfolojisi karaciğerde belirleme organ yetmezliği ve doku hasarı nedeniyle tedavi edici etkisi tanımamıza izin verebilir Sepsis lökosit etkinleştirme.

Giriş

Karaciğer önemli metabolik organ memelilerde olduğunu; enerji, hormonlar ve detoksifikasyon1için bir kontrol kulesi olarak görür. Onun önemi nedeniyle, araştırmacılar değişiklikleri karaciğerde iltihap sırasında aydınlatmak için birçok vitro ve in vivo deneyler yaptık. İntravital mikroskobu karaciğer2 canlı görüntüleri yakalamak için kullanılır. Gerçekten de,2,3,4,5,6çeşitli karaciğer görüntüleme yöntemleri olmuştur tanıttı. Ancak, daha basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşım geliştirmek ve sabitleme hedef organ ve bağışıklık hücreleri elde etmek için biz kendi çaba intravital görüntüleme için en aza indirmek araştırmacılar rehberlik eder basit bir protokol tasarlanmıştır.

Bu çalışmada, istikrarlı ve yeni görüntüleme odası ve kanama ve olası enfeksiyon en aza indirmek için kullanılabilir cerrahi tekniği tanıttı. Karaciğer daha 2 h için sağlam kaldı doğruladı. Bu yöntemle başarıyla türleri Morfoloji LCMs7 ve nötrofil septik koşul altında tanımlanan. Bu yöntem titreyen ve beklenmedik iltihabı gibi fiziksel ve biyolojik karıştırıcı faktörlerin cerrahi işlem sırasında en aza indirir bu yana, biz bu yöntemi yanıt olarak karaciğerde bağışıklık hücrelerinin akut reaksiyonlar gözlemlemek için kullanılan olabilir tahmin reaktifler LPS severim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kore kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. LysM-yeşil flüoresan protein (GFP; gfp / +) fareler8 ve CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 fare 8-12 hafta-in yaş, intravital görüntüleme için kullanılmıştır. Tüm cerrahi alet autoclaved ve % 70 alkol ile dezenfekte edildi.

1. özel tasarlanmış fare araçları destekleyici odası Imaging karaciğer

  1. Fare karaciğer odası tasarım görüntüleme
    1. Fare karaciğer (şekil 1) görüntüleme için aşağıdaki boyut TMMOB olun: iç Odası (120 mm Uzunluk × 160 mm genişlik × 30 mm yükseklik), dış Kamara (100 mm Uzunluk × 100 mm genişlik × 24 mm yükseklik), cıvata (Ф 3 mm × 30 mm yükseklik), fındık (Ф 4 mm) ve kanat şeklindeki fındık (Ф 4 mm).
    2. Kür Ajan ve elastomer 1:9 oranı temel silikon 120 g toplam yapmak için ölçmek.
    3. Sıvı silikon karışımı bir 250 mL Erlenmeyer şişeye koyun ve iyice karıştırın. Sonra bir desiccator şişeye koy ve hava kabarcıkları vakum altında yaklaşık 1 h için pompa ile kaldırın.
    4. 10 mm yükseklik gibi yüksek bir özel tasarlanmış fare odasına sıvı silikon karışımı dökün ve izin için bir kaç gün (şekil 1A) tedavi.
  2. Kapak slaytlar ve yatak sabitleme karaciğer hazırlanması
    1. Metal çerçeve üzerinde kapak cam silikon yapıştırıcı kullanarak ekleyin. 1 gündür (şekil 1B) kurumasını bekleyin.
    2. Etkili bir şekilde su daldırma lens için distile su tutmak için semipermanent su engelleme yapısı çok önemlidir. 1 mm silikon yapıştırıcı yuvarlama yapmak ve gecede sertleşmesine.
    3. Mix kür Ajan ve elastomer temel ve sonra içine 6-şey plaka bir yükseklikte, yaklaşık 8-10 mm. gerçekleştir sertleştirme işlemi 1.1.2-1.1.4 içinde açıklandığı gibi dökün.

2. LPS hazırlanması

  1. Steril 1 × fosfat tamponlu tuz (PBS) üzerinden Salmonella enterica serotip enteritidis LPS toz sulandırmak için hazırlayın. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4).
  2. PBS su banyosu 37 ° C'de ön ısı ve LPS toz şişe (25 mg) dikkatlice açın.
  3. Damlalıklı yardımların kullanılması, steril PBS (5 mL) LPS toz şişe içine dökün ve hafifçe karıştırın veya hisse senedi çözüm hazırlamak için çözüm askıya alabiliriz.
    Not: LPS toz sıvılaşmış sonra sert vortexing kabarcıklar neden olabilir. Aliquots 1.5 mL tüplerde yaparken kaybı en aza indirgemek için baloncuklar yapmaktan kaçının.
  4. −20 ° C de hisse senedi LPS çözüm depolamak ve enjeksiyon için 1 mg/mL LPS çözüm içine oranında seyreltin.
  5. 1 mg/mL LPS çözüm (20 mg/kg) 1-mL şırınga kullanarak bir sigara anestezi fare Periton enjekte. Denetim hayvan için PBS aynı hacmi enjekte.
  6. 2s için yeterli inflamatuar yanıt bekleyin.

3. kan damarları leke hazırlanması Texas-kırmızı Dextran

  1. İki 15 mL konik boru ve 10 mL steril PBS hazırlayın.
  2. Texas-kırmızı Dextran toz (25 mg) PBS 3 ml seyreltik ve iyice karıştırın. Karışımı bir boş 15 mL konik tüp aktarın.
  3. Kalan PBS (7 mL) dextran karışımı (3 mL) içeren 15 mL konik tüp aktarın.
  4. 0,45 µm şırınga filtre bir 10 mL şırınga ucunu bağlayın. Şırınga filtre iğne değiştirmeniz gerekir.
  5. Dextran karışımı (10 mL) filtre. Şırınga eşit dökülmesini önlemek için tuşuna basın.
  6. 2.5 mg/mL dextran çözüm ışık bloke 1.5 mL tüp içinde 500 µL dağıtmak ve −20 ° C. saklayın Bir kez çözdürülen, 4 ° C'de depolayın

4. cerrahi işlem

  1. Cerrahi tablo ve tüm aletleri ameliyat öncesi % 70 alkol kullanarak dezenfekte edin. Sonra karaciğer ameliyatı için araçları seti ve ısıtma yüzeyi 37 ° C (şekil 2A, B) için ayarlayın.
  2. Anestezi için 30 mg/kg tiletamine/zolazepam ve 10 mg/kg xylazine ile fareler intraperitoneally enjekte et. Bu çözümler karışık olabilir ve aynı anda enjeksiyon için PBS içinde seyreltilmiş. Anesthetization yavaşça fare ayak basarak onaylayın.  Hiçbir refleks olduğunda sonraki adıma geçin.
  3. Fare'nın retina kuruluğu önlemek için göz merhem küçük miktarda uygulayın.
  4. Vücut saç saç dökücü krem (şekil 2C) kullanarak karın çevresinde kaldırın.
  5. Texas-kırmızı Dextran eriyik (2.5 mg/mL konsantrasyonu) kuyruk ven veya bir insülin şırınga (şekil 2B) kullanarak retro-orbital enjeksiyon yolu ile 200 µL enjekte.
  6. Şu subcostal alan bir marker ile işaretleyin. Çizgi xiphoid işleminden kaburga sonuna kadar çizilmiş olması. Forseps ve makas (şekil 2E, F) ile epidermis kesti.
  7. Karın boşluğu mikro-makas ve forseps kullanarak açın ve karaciğer dikkatle bulaşmasına neden. Sol yan lob pamuk temizleme bezi (Şekil 2 g, H) kullanılarak alınması.
  8. Steril PBS 500 µL kuruluk karaciğer önlemek için karın boşluğuna dökün.
  9. Özel olarak tasarlanmış odası sağ-decubitus konumda fareyi getirin ve doku yapıştırıcı az miktarda silikon yatağa uygulayın. Pamuk temizleme bezi (şekil 2I) kullanarak karaciğer yapıştırmanız dikkatle.
    Not: karaciğer dokusu son derece kırılgan olduğundan, mekanik karaciğerinden çekmeyin. Yavaşça pamuk temizleme bezi ile tomar dışarı.
  10. Birkaç saniye sonra Karaciğer karaciğer dışarı kurutma önlemek için steril PBS 500 µL ile tekrar ıslak. Metal çerçeve üzerinde karaciğer yerleştirin ve sıkıca fındık (şekil 2J) ile düzeltmek.

5. İki fotonlu mikroskobu ile karaciğer intravital görüntüleme

  1. ZEN yazılım (Carl Zeiss) üzerine lazer açmak, dalga boyunu ayarlamak için 880 nm ve set yeşil, çalıştırın ve kırmızı kanalları. Lazer güç floresan yoğunluğu (şekil 3A) göre ayarlayın. Emisyon filtre bilgi ise şöyle: yeşil/Alexa488, 500-550 nm ve kırmızı/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Odası görüntüleme sahnesinde yerini ve 20 X su-daldırma objektif lens kapağı cam yakın yerleştirin.
  3. Silikon kauçuk ısıtıcı (şekil 3B), vücut ısısını korumak için fare cesedi altında düzeltmek.
  4. 500 µL distile su üzerinde metal çerçeve bırakın ve sonra karaciğer (şekil 3 c) yakın objektif lens çekin.
  5. Derinlik ve saati görüntüleme alanını belirlemek ve odağı ayarlayın.
  6. Kuralları görüntüleme.
  7. Uzun vadeli görüntüleme için her saat görüntüleme sırasında yarım doz tiletamine/zolazepam ve xylazine karışımı enjekte et. Vücut ısısı 37 ° C'de farelerin Bakımı sırasında bu sahne çok önemlidir. Her zaman anesthetization zaman her fare farklılık fare için göz kulak ol.
    Not: Bu yöntem cerrahi ve görüntüleme sonra kurtarma için uygun değildir. Etik fare hemen ameliyat sonrası kurban ediyoruz.
  8. Kararlı anesthetization için her 30 dakika pedal refleksleri kontrol edin.

6. veri analizi

  1. Veri analiz yazılımı Volocity açın ve sonra kütüphanede ham veri yazılım alın.
  2. Gürültü durumu uygun ve bir anlık görüntü almak için görüntüden kaldırın.
    Not: düzgün görüntü elde etmek, 'Para' veya 'Orta' filtresini kullanın. Ayrıca, karanlık ya da bulanık görüntülerin daha net yapmak için 'Kontrast geliştirme' özelliğini kullanın.
  3. Anlık görüntüler için JPEG veya TIFF dosyalarını ve AVI dosyalarını filmler için % 100 ve ihracat için düzenlenmiş öğe sığar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Basit ve çok kararlı görüntüleme odası geliştirildi. Odası alt fare vücudu ve organları kaymasını engelleyen silikon ile kaplıydı. Ayrıca, silikon elastikiyet doğru miktarda olduğundan, beklenen hasar kapak slayt (şekil 1A, C) basınç tarafından indüklenen engelleyebilir. İkinci, doku-kasa tutkal (veteriner bond)'i ayıklanan karaciğer daire şeklinde silikon yatağa düzeltmek için uygulandı. Bu yöntem kalp atışı ya da respirational hareketi nede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Karaciğer aktif olarak birçok gruplar3,10, onun işlevini önemi nedeniyle tarafından incelenmiştir. Örneğin, Heymann vd. özel kullanarak hassas bir yöntem önerdi. Bu yöntem son derece kesin olarak bulundu rağmen özel ayar sürüyor. Ancak, bizim metodoloji ile tüm yordamları karıştırıcı diğer faktörler minimize 30 dk içinde yürütülen. Kalp atışı video rahatsız edemez çünkü İkincisi, karaciğer sabitleme son derece önemlidir. Bu olgu ortadan kaldırmak için biz fareyi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Teşekkürler

Bu çalışmada bir hibe--dan Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti (MSIP; grant No 2016R1A2B4008199 Y-m tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir H.), Sağlık Bakanlığı ve refah, Güney Kore (sayı vermek: HI14C1324).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Özel tasarlanmış odaCanlı Hücre AletleriÖzel tasarlanmış boyut
Metal kapak sürgüsüCanlı Hücre AletleriÖzel tasarlanmış boyut
Kapak camıElektron Mikroskobu Bilimleri# 72204-03
Sylgard 184 Silikon elastomer kitiDow Corning
Erlenmeyer şişesiDURAN21 216 36
Hücre kültürü plakası (Düz tip)HYUNDAI Micro Co.H31006
KurutucuADARSH55204
Yüksek Q BOND SE 5 mLBJM LABYarı kalıcı baraj yapmak için
Esnek Silikon Kauçuk IsıtıcılarOmegaSRFR/SRFG SERİSİ, M1250/0800
DC güç kaynağıToyotechDP30-03A
Fosfat tamponlu tuzlu su Evyapımı
Salmonella enteria serotip enteritidis'ten lipopolisakkaritler (LPS)Sigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Yüksek berraklıkta polipropilen
konik tüp		FALCON14-959-49B
0.45 & mu; m filtre (Minisart Şırınga Filtresi)Sartorius16555k
1.5ml Mikro Tüp, AmberAxygenMCT-150-XIşığı bloke eden
1 mL şırıngaiçin Kore AşısıKV-S01
3 mL şırıngaKore AşısıKV-S03
10 mL şırıngaKore AşısıKV-S10
0.3 mL insülin şırıngasıBecton Dickinson324900
Tüy dökücü krem 100 mLVücut doğal
Pamuklu çubukABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
Isıtma plakasıCanlı Hücre AletleriPH-S-10Özel tasarlanmış boyut
DC kontrol cihazıCanlı Hücre AletleriCU-301
Mikrodeseksiyon MakasıHarvard Aparatı72-5418
MakasRobozRS-5882
ForsepsRobozRS-5137
Veteriner bağı3M1469SB
ZEN yazılımı (Black Edition)LSM 7 MP LSM 7 MPZeiss için Carl Zeiss
Programı
VolocityPerkinElmerAnaliz programı
Carl

Kaynaklar

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

L kosit MotilitesiKaraci er mm n Yan tN trofil GKaraci er Kaps l MakrofajlarLPS ile lem G rm Fare Karaci erintravital G r nt leme AnaliziFloresan MikroskopiCerrahi Karaci er EkspozisyonuSeptik ok Modeli

İlgili makaleler