Yöntem makalesi

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

DOI:

10.3791/57194

⸱

19 Mayıs 2018

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatosit benzeri hücreler (HLCs) insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) ayırt etmek hepatik metabolizma doğuştan hataları incelemek için yeni fırsatlar sağlar. Ancak, karaciğer hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir küçük moleküller tanımlaması destekleyen bir platform sağlamak için yordamı bileşikler binlerce eleme ile uyumlu bir kültür biçimi gerektirir. Burada, 96-iyi doku kültürü plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs tekrarlanabilir farklılaşma izin tamamen tanımlanmış kültür koşulları bir iletişim kuralı'nı açıklar. Ayrıca, Apolipoprotein B (APOB) düşürmek için yeteneklerini için ekran bileşikler platforma kullanarak örnek bir ailesel hiperkolesterolemi hastanın oluşturulan IPSC kaynaklı tetkikine üretilen sağlamaktayız. İlaç keşif ile uyumlu olan bir platform kullanılabilirliğini araştırmacılar roman karaciğeri etkileyen hastalıklar therapeutics tanımlamak izin vermelidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarama için kullanılabilir deneyleri gelişimi başarı nadir bir hastalık hedeflemek için kullanılan ilaçlar belirlenmesinde esas alır. Hipotez veya hedef tabanlı ekranlar (ters farmakoloji) yararlıdır, ancak hastalığın moleküler temeli detaylı bir anlayış gerektirir. Fenotipik ekranlar (klasik farmakoloji) biyokimyasal yollar ayrıntılı bir anlayış gerekir ama bunun yerine doğru hastalığın patofizyolojisi ayna modelleri geliştirilmesi üzerinde güveniyor. Hedef tabanlı yaklaşımlar için coşku rağmen fenotipik ekranları daha başarılı1olmuştur FDA onaylı ilk sınıfındaki ilaç analizleri ortaya koyuyor. Bu yöntem genel amacı bu eleme yüksek üretilen iş için bir platform kurmak için metabolik karaciğer hastalığının tedavisi için küçük moleküller tanımlamak için kullanılabilir. Birkaç vitro modelleri birincil tetkikine, hepatoma hücreleri ve karaciğer progenitör hücre2gibi tarif edilmiştir. Ancak, bu modellerin çoğu kısıtlamalar bulunmaktadır ve doğru bir şekilde kültür metabolik karaciğer eksiklikleri Patofizyoloji özetlemek yeni modeller için bir ihtiyaç. Son zamanlarda, insan pluripotent kök hücreler gen düzenleme ile kombine-si olmak teklif etmek bile nadir hastalıklar kültür ezelî belgili tanımlık lüzum erişim hastalara en nadide modellemek için bir fırsat doğrudan3. Hasta özel iPSCs kullanımı sırasında nadir karaciğer hastalıklarının tedavisi için küçük moleküller keşfetmek için bir araç kavramsal olarak makul olduğu gibi sadece bu yaklaşım4fizibilite gösteren birkaç rapor ediliyor. Ancak, son zamanlarda IPSC kaynaklı tetkikine başarıyla karaciğer metabolizması5eksiklikleri tedavisi için güvenilemez uyuşturucu tanımlamak için kullanılan bir platform kurduk.

Bu iletişim kuralı 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs ayırt ve küçük moleküller içeren bir kitaplık ekranı için onları kullanarak işlemi açıklar. Ayrıca hiperkolesterolemi metabolik karaciğer hastalığı örnek olarak kullanarak bitiş noktası analizi açıklar. Bu yaklaşım rolünü ve uygulama bağlamında bulaşıcı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı, ilaç toksisitesi ve diğer karaciğer bozuklukları, küçük moleküllerin çalışma yararlı olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. insan kültürünü Pluripotent kök hücreler indüklenen

  1. Rekombinant insan E-Cadherin Fc füzyon proteini (E-cad-Fc) veya diğer matrisler hPSC kültür için uygun kaplama 6
    1. E-cad-Fc 15 μg/mL Dulbecco'nın Phosphate-Buffered kalsiyum ve magnezyum (DPBS (+)) içeren serum fizyolojik ile oranında seyreltin.
    2. Kat 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri ile seyreltilmiş E-cad-FC 5 mL için en az 1 h. Kaldır substrat 37 ˚C, kuluçkaya ve Orta (Örneğin, mTeSR1 bundan sonra M-aracı olarak anılacaktır) ile 5 mL yerine7.
      Not: Bu protokol için kullanılan kültür orta yayımlanmış protokolleri7takip hazırlanır. Ancak, diğer birçok medya hazırlıklar tarif var veya ticari, are elde edilebilir bu yordamı ile büyük olasılıkla uyumludur.
    3. Cryopreserved iPSCs bir şişe sıvı azot almak. Kadar küçük buz kristal kalır 37 ˚C çözülme. Yavaşça hücreleri M-Orta 4 mL içeren bir steril 15 mL konik tüp pipet.
    4. 5 dk. süpernatant kaldır ve yavaşça Y-27632, selektif inhibitörü olan Rho ilişkili, kıvrılmış-coil içeren protein kinaz (ROCK) 10 µM ile desteklenmiş orta 5 mL içeren hücreleri yeniden askıya almak için de 300 x g santrifüj kapasitesi.
    5. Ve hücre 5 mL adımından 1.1.4 E-cad-Fc-kaplı 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri için transfer M-orta adım 1.1.2 den çıkarın.
  2. Kültür insan iPSCs Bakımı
    1. Çevresinde iPSCs ulaştıktan sonra % 80 confluency, kültür orta kaldırmak ve bir kez kalsiyum ile yıkayın ve magnezyum ücretsiz DPBS (-). DPBS (-) Aspire edin ve kuruyucu, sonra 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya %0.02 EDTA çözüm yeterli miktarda ekleyin.
      Not: % 80 izdiham plaka 2 x 107 hücreleri içermelidir. Hücreleri sarmak değil ve hücreleri bir farklılaşmamış morfoloji korunmasını sağlamak için önemlidir. Hücreler pluripotent kök hücre işaretçisi Tra-1-60 veya eşdeğer8ile boyama tarafından belirlenebilir.
    2. Serbest bırakmak hücrelere başlar başlamaz, %0.02 EDTA çözeltisi kaldırmak ve hücreleri serbest bırakmak için M Orta 10 mL ile çanak su basması. İPSCs dekolmanı yavaşça pipetting tarafından yardım.
      Not: Yaklaşık 3 dakika ortalama kuluçka zamanı ayırmak hücreler için ama bu her IPSC satırı için ampirik olarak belirlenecek ihtiyacı var. Hücreleri çevresinde içeren küçük kümeleri olarak piyasaya sürülmelidir küme başına 5-10 iPSCs.
    3. 1/10 temiz E-cad-Fc kaplamalı 100 mm süspansiyon doku kültürü çanak M-orta 5 mL içeren başına askıya alınan hücre / aktarın. 37 ˚C altında %4 O, kültürler kuluçkaya2/5% CO2 ve değişim orta günlük.
      Not: Her ne kadar iPSCs rutin Nanog teşvik için fizyolojik oksijen koşullarında kültürlü, iPSCs ortam oksijen kullanarak da yetiştirilir.

2. insan iPSCs 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma

Not: Bu bölümde iPSCs tarama ile uyumlu bir biçimde farklılaşma açıklanmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, ayırmak ve 20 gün içinde hepatosit benzeri hücreleri oluşturmak için insan iPSCs ikna etmek mümkündür. Bu çoğu deneyleri için uygun olmakla birlikte, kültür uzunluğu hücreleri olgunluk geliştirmek için genişletilebilir.

  1. 96-iyi doku kültürü pilakalar ve düşük büyüme faktörü membran matris kaplama
    1. Hisse senedi 2 mg/ml steril buz gibi DMEM/F12 doku kültürü orta ile matris sulandrarak hazırlayın. Matrisin 250 μL aliquots bölmek ve gerekli kadar-80 ˚C saklayın. DMEM/F12 buz 30 dk. almak için 10 mL 250 μL aliquot 2 mg/mL matris stokunun ve tezcan buza chill.
    2. Matrix yavaşça olarak 0,05 mg/mL nihai toplama yapmak için önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak karıştırarak 10 mL soğuk DMEM/F12 ile birleştirin.
    3. 100 μL seyreltilmiş matrisinin bir 96-iyi doku kültürü tabak her şey için transfer. 37 ˚C kuluçkaya, en az 1 h için %4 O2/5% CO2 matrisin atmak ve iyi 50 M-Orta μL ile değiştirin. 37 ° C'de, %4 O2/5% CO2 gerekinceye kadar saklayın.
  2. Plaka hücre farklılaşması için
    1. Hücrelerin % 80 izdiham e varana kadar 100-mm plakalar üzerinde iPSCs kültür. Plaka 2 x 107 hücreler içerdiğinden emin olun. Hücre sayıları hücre akış sitometresi veya hemasitometre belirler.
      Not: Tecrübesiyle, kalite iPSCs hücrelerinin mikroskopisi tarafından değerlendirilecektir olabilir; Ancak, hücreleri % 98'i yakın pluripotency işaretleri FACS veya immunostaining kullanılarak ölçülen TRA-1-60 epitope gibi hızlı. Bu hücreler aktif bölme kalır ve değil büyümüş önemlidir.
    2. Her 100-mm plaka iPSCs hasat için kültür orta Aspire edin ve 5 mL DPBS (-) ile durulayın. Durulama 3 mL hücre dekolmanı çözeltisi (Örneğin, accutase) ile değiştirin ve yaklaşık 2 dak 37 ° c, % 4 O2/5% CO2için kuluçkaya.
      Not: Dekolmanı hücrelerinin mikroskopisi tarafından takip etmek önemlidir. Özet accutase ile bitmedi yapmak. Hücreleri en az tedavi ile küçük kümeleri olarak serbest bırakmak için hedeftir.
    3. Ayırmak hücreleri başlar başlamaz M-orta 7 mL ekleyerek hasat. Birkaç kez pipet hücre kolonileri küçük kümeler halinde ayırmak için 3-6 hücreler (Şekil 1A).
    4. 5 dk. süpernatant kaldırmak ve yeniden 5 mL M-Orta hücre Pelet askıya iPSCs 15 mL steril santrifüj tüpü ve santrifüj 300 x g de içine toplamak.
    5. 96-şey matris kaplı plakalar üzerine hücreleri tarafından süspansiyon hücre pipetting 50 μL her kuyuya eşit olarak dağıtabilmenizi. Her 96-şey tabak ayarlamak için hücreleri, farklılaşma kurulum için yaklaşık 5 x 106 hücreler içeren yaklaşık % 80'i confluency ile iPSCs bir 100-mm tabak kullanın. Bu süreci hızlandırmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Gecede, 37 ˚C, %4 O2/5% CO2hücre kültür.
      Not: Bu hücreler eşit sayıda tekrarlanabilir saptamaları emin olmak için her kuyuya yatırılır önemlidir.
  3. Hücrelere farklılaşma teşvik
    1. 96-şey plakaları mikroskobu tarafından hücre yüzey her bireyin en az % 70'i de kapak emin olmak için incelemek. Kapsama alanı % 70'den az ise, orta ile taze orta yerine ve 37 ˚C, %4 O2/5% CO2de ek bir 24 h için kuluçkaya.
      Not: Yaygın olarak farklılaşma inducing olmadan kaplama sonra hücreler daha 48 h için kuluçka farklılaşma verimliliğini azaltır. Her ne kadar verim olabilir etkilenen. farklılaşma ortam oksijen kullanarak yapılır
    2. Gün 1 gün 2 farklılaşma, (olmadan insülin), % 2 ' B27 ile takıma RPMI kültür orta yerine 100 ng/mL aktivin A, 10 ng/mL BMP4 ve 20 ng/mL FGF2. Orta iyi başına 100 μL ekleyin ve ortam O2/5% CO2 2 gün için bir günlük orta değişiklikle 37 ˚C, kuluçkaya.
      Not: 96-şey tabak çok sayıda ile ilgili bir yardımlı pipet veya robot kullanımı gerektirir. 12 kanallı ve 96-kanal pipetler günlük orta değiştirmek için idealdir.
    3. 3. gün için günlük 5 farklılaşma Değiştir RPMI ile kültür orta %2 B27 (insülin) olmadan ve 100 ng/mL aktivin A. Kültür ile ortam O2/5% CO2 3 gün için günlük orta değiştirmek ile 37 ˚C hücreleri takıma.
    4. Taze kültür orta, tedavi her takmadan önce farklılaşma günde 5, iyi 100 μL %0.02 EDTA çözüm 30 s, o zaman kaldır ve Değiştir ile taze kültür orta ile.
      Not: Farklılaşma endoderm için verimli ise, hücre ayırt monolayer plaka için peeling eğilimli olur. %0,02 EDTA çözeltisi kısa bir tedaviyle hücre dekolmanı hafifletmeye yardımcı olur. Bu tedavi için tetkikine farklılaşma etkilemez.
    5. Gün 6-10 arasında ayırt etme için kültür B27 (insülin ile) 20 ng/mL BMP4 ve 10 ng/mL FGF2 ile desteklenmiş ve 37 ˚C, %4 O2/5% CO2 günlük orta değiştirmek ile 5 gün boyunca, kuluçkaya Orta % 2 / RPMI ile değiştirin. Bu aşamada hücreleri hepatik progenitör hücre içine ayırt etmek için neden olmaktadır.
    6. Gün 11-15 arasındaki farklılaşma için kültür B27 (insülin ile) desteklenmiş orta RPMI / %2 20 ng/mL ile HGF değiştirin. 37 ˚C, %4 O2/5% CO2 günlük orta değiştirmek ile 5 gün boyunca, kuluçkaya.
    7. Gün 16-20 arasındaki farklılaşma için bir hepatosit hücre kültür 20 ng/mL ile Oncostatin-M (OSM) takıma Orta (HKM) kültür orta yerine. Senaryo Özeti ortam O2/5% CO2 5 gün için günlük orta değiştirmek ile 37 ˚C kuluçkaya.
      Not: Bireysel wells arasındaki farklılaşma tekrarlanabilirlik verimli albümin, AFP veya orta ELISA tarafından salgılanan APOB göreli düzeyi ölçülerek belirlenebilir (bkz: 3.2).

3. küçük molekül tarama

Not: Aşağıdaki APOB düzeyini Orta ailesel hiperkolesterolemi iPSCs türetilmiş hepatosit benzeri hücre düşürmek için kullanılan bileşenleri tanımlamak için kullanılan yordamı açıklar. Açıklanan model ve kullanımı kolesterol düşürücü ilaçlar tanımlaması ile bir açıklama ayrıntılı olarak daha önce5,9. Geçerli örnek, Güney Carolina bileşik toplama (SC3) kitaplığından 1.000 bileşikler gösterildi. Her bileşik 2 μg/mL konsantrasyonu test edildi.

  1. IPSC - küçük moleküller ile türetilmiş tetkikine tedavisinde
    1. Tabak bileşikleri, 20 μg/mL bir konsantrasyon ile çalışma stoklarının % 2 DMSO ve -20 ˚C mağazasında oluşturmak için ana bileşik kitaplık sulandırmak.
    2. IPSC kaynaklı tetkikine test edilecek her bileşik izin vermek için yeterli 96-şey plakaları hazırlayın.
      Not: Taranacak bileşikler sayısı gereklidir 96-şey tabak sayısını belirleyecektir. Genel olarak, bir tek de herhangi bir kontrol örnekleri için her bileşik, artı ek kuyuları için hazırlanmalıdır. Plaka en dıştaki kuyu sık yorumu bozuk kenar efektleri olasılığını azaltmak için kaçınılmalıdır. Sayısı çoğaltır kullanmaya gerek kalmadan z-skor yöntemi kullanılarak belirlenebilir. Çoğaltır varsa, t testi kullanmak daha uygundur.
    3. Farklılaşma (gün 20, bakın 2.3.7) bitiminde, taze HCM 100 μL ile kültür orta yerine20 ng/mL ile Oncostatin-M desteklenmiştir. 37 ˚C kuluçkaya, tam olarak 24 h için %4 O2/5% CO2 taze 96-şey plaka ve -20 ˚C mağazasında içine kültür orta almak. Bu örnek APOB düzey ilaç eklenmesi önce Orta hesaplamak için kullanın.
    4. 20 ng/mL Oncostatin-M her kuyuya ile takıma taze HCM 90 μL ekleyin. Her bileşik 10 μL çalışma stoktan pipetting tarafından karıştırdıktan sonra ekleyin. Tedavi örnekleri son konsantrasyon maç ve 37 ˚C kuluçkaya wells denetlemek için % 0,2 DMSO eklemek, ortam O2/5% CO2 tam olarak 24 h için kültür orta toplamanız ve -20 ˚C. Bu örnek bileşikler ile tedaviden sonra APOB düzeyini belirlemek için kullanın.
    5. İsteğe bağlı - kalan hücreleri immunostaining, hücre canlılığı veya standart yaklaşımları kullanarak mRNA düzeylerinin analizleri için işlenebilir.
      Not: Bu ekran APOB düzeyleri üzerinde hızlı bir etkisi vardı uyuşturucu tanımlamak için tasarlanmıştır. Ancak, hastalık modeli, aşağı akım deneyleri veya ilaç etki mekanizmaları bağlı olarak, bu örnek için birden fazla gün tedavisi faydalı olabilir.
  2. ELISA tarafından APOB düzeylerini belirlemek
    1. Üreticinin iletişim kuralları takip insan APOB ELISA geliştirme seti kullanarak her iki öncesi ve sonrası uyuşturucu tedavi örneklerinden apolipoprotein B (APOB) konsantrasyonu belirlemek.
    2. Aşağıdaki çözümleri hazırlanıyor
      1. Yıkama arabellek, %0.05 oluşan ara 20 dakika sonra PBS, pH 7.4. 4 ˚C kullanmak kadar saklamak.
      2. Kuluçka arabellek, % 0.05 arası 20 ve % 0.1 sığır serum albümin (BSA) PBS, pH 7.4 içinde oluşur. 4 ˚C kullanmak kadar saklamak.
    3. PBS, pH 7.4 2 µg/ml sulandrarak APOB (mAB 20/17) antikor hazırlayın. Seyreltilmiş antikor iyi başına 100 μL ekleyin ve 4 ˚C gecede kuluçkaya.
    4. Antikor tahlil plakalar kaldırmak ve her biri de iki kez PBS, pH 7.4 200 μL yıkayın.
    5. %0,05 200 μL/iyi eklemek ara 20, % 0,1 sığır serum albümin (BSA) PBS, pH 7.4 içinde ve oda sıcaklığında 1s için titreyen bir platform üzerinde kuluçkaya.
    6. PBS, APOB aşağıdaki konsantrasyonları ile pH %7,4 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA kullanılarak bir 8-nokta standart eğri hazırlamak: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL ve 50 ng/mL.
    7. Test örnekleri 1:4 ile % 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA içinde PBS, pH 7.4 oranında seyreltin.
    8. Kuluçka arabellek ile engelleme 1 h sonra arabellek atmak ve beş kez ile %0,05 200 μL tahlil tabak yıkama PBS, pH 7.4 Ara 20.
    9. Tamamen ve 90 μL seyreltilmiş örnekleri ve APOB standartları için tahlil tabak transfer herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek çıkarın. Bir shaker 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    10. Örnek atmak ve yıkama 200 μL %0,05 ile ara 20 dakika sonra PBS, pH İyi 7.4. Yıkama toplam 5 kez tekrarlayın. MAB LDL 11-biotin seyreltilmiş 1:1,000 kuyu başına 100 μL % 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA PBS, pH 7.4 olarak ekleyin. 1s için titreyen bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya.
    11. Reaktif atın ve 5 kez de çamaşır arabellek başına 200 μL yıkayın. Streptavidin-HRP antikor kuyu başına 100 μL eklemek (1:1, 000 seyreltme kuluçka tampon kullanarak), o zaman 1s için titreyen bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya.
    12. Reaktif atmak ve yıkama 200 μL %0,05 ile ara 20 dakika sonra PBS, pH İyi 7.4. Yıkama toplam 5 kez tekrarlayın. Tamamen artık çamaşır arabellek tahlil plakalar kaldır ve Tetramethylbenzidin (TMB) substrat çözeltisi kuyu başına 100 μL ekleyin ve 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    13. TMB substrat kaldırmadan, doğrudan durmak eriyik (1N HCl) kuyu başına 100 μL ekleyin.
    14. 450 absorbans belirlemek bir plaka okuyucu kullanarak nm.
    15. Sonra dört parametre Logistic regresyon yöntemi kullanarak APOB konsantrasyonu her örnek10dakika sonra tanımlamak için kullanılan standart bir eğri kurulabilir.
    16. Öncesi uyuşturucu inceleyin: APOB sonrası uyuşturucu oranını bileşikler APOB düşürmek için potansiyeli ile tanımlamak için her örnek içinde orta düzeyde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatosit nesil - tarihlerde hücreleri: Şekil 1 insan iPSCs hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma sırasında meydana gelen değişiklikler süre açıklar. İPSCs E-Cad-Fc Tarih kültür yaklaşık 2 mm pluripotent işaretçiyi OCT4 hızlı çapı kolonileri sağlar (Şekil 1A-B). Bir E-cadherin matris üzerinde yetiştirilen hücre morfolojisi bu diğer yüzeylerde kültürlü biraz far...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli bir protein aktivitesini etkileyen nerede küçük moleküller tanımlanır temel hedef ilaç bulma, birçok varolan tarama çalışmalarının odak noktası olmuştur. Bu yaklaşım çok sayıda ilaç, ekranlar üzerinde ters bir fenotip, klasik Farmakoloji, dayalı sağlamıştır, ancak klinik olarak etkili1olmuştur ilk sınıfındaki bileşikler belirlenmesinde daha başarılı olmuştur. Bir dezavantajı fenotipik ilaç keşif için uygun hastalık modelleri kullanılabilirliğine dayanır olmasıdır. Bu hücre modelleri hastal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK55743, DK087377, DK102716 ve HG006398 S.A.D için) tarafından desteklenmiştir. Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop ve Ran Jing katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm x 20 mm steril doku kültürü kapları Corning430167
100 mm x 20 mm steril süspansiyon kültür kaplarıCorning430591
96 oyuklu doku kültürü plakası Corning3595
Anti-insan AlbüminDakoA 0001
Anti-insan FOXA2 (6C12)Novus BiyolojikH00003170-M12
Anti-insan HNF4 alfaSanta CruzSC-6556
Anti-insan Oct-3/4 antikoruSanta CruzSC-9081
Anti-insan SOX17R& DAF1924
Anti-insan TRA-1-60 FITC konjugeMilliporeFCMAB115F
Aktivin Rekombinant İnsan Proteini İnvitrojenPHC9563
B-27 Takviyesi, eksi insülin ve nbsp;Invitrogen0050129SA
B-27 Takviyesi, serum içermez İnvitrojen17504044
BMP4 Rekombinant İnsan Proteini İnvitrojenPHC9533
Hücre Ayrışma Reaktifi StemPro  Accutase InvitrogenA1110501
CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Canlılık Testi Promega7572
DPBS + (kalsiyum, magnezyum)İnvitrojen14040-133
DPBS- (kalsiyum yok, magnezyum yok)İnvitrojen14190-144
DMEM / F-12, HEPES ve nbsp;Invitrogen11330057
ELISA insan APOB ELISA geliştirme kitiMabtech3715-1H-20
Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (FGF2)İnvitrojenPHG0023
Hepatosit Kültür Ortamı (HCM Bullet Kit) LonzaCC-3198
Hepatosit Büyüme Faktörü  (HGF)İnvitrojenPHC0321
L-Glutamin İnvitrojen25030081
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler ÇözeltisiInvitrogen11140076
Oncostatin M (OSM) Rekombinant İnsan Proteini İnvitrojenPHC5015
Penisilin-Streptomisin Invitrogen15140163
Besleyici içermeyen pluripotent kök hücre ortamı: mTesR1 KÖK HÜCRE teknolojileri5850
Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi InvitrogenA1413301
RPMI 1640 Orta, HEPES Invitrogen
StemAdhere Tanımlı MatrisPrimorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA Substrat ÇözeltisiThermo Scientific 34022
Anti-TRA-1-60 FITC konjugeKırlangıç FCMAB115F
Versene (EDTA)% 0.02 Lonza17-711E
Y-27632 KAYA inhibitörüKÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ72302
hPSC (E-cad-Fc) için 22400105

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15(2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Uyar lm Pluripotent K k H crelerY ksek Kapasiteli Taramala Ke if Platformu96 Kuyucuklu Doku K lt r PlakalarTan mlanm K lt r Ko ullarApolipoprotein B DeneyiAilesel Hiperkolesterolemi ModeliHepatik Diferansiyasyon ProtokolBile ik Tarama Y ntemi

İlgili makaleler