Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için
Bu makalede
Özet
Özet
Hepatosit benzeri hücreler (HLCs) insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) ayırt etmek hepatik metabolizma doğuştan hataları incelemek için yeni fırsatlar sağlar. Ancak, karaciğer hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir küçük moleküller tanımlaması destekleyen bir platform sağlamak için yordamı bileşikler binlerce eleme ile uyumlu bir kültür biçimi gerektirir. Burada, 96-iyi doku kültürü plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs tekrarlanabilir farklılaşma izin tamamen tanımlanmış kültür koşulları bir iletişim kuralı'nı açıklar. Ayrıca, Apolipoprotein B (APOB) düşürmek için yeteneklerini için ekran bileşikler platforma kullanarak örnek bir ailesel hiperkolesterolemi hastanın oluşturulan IPSC kaynaklı tetkikine üretilen sağlamaktayız. İlaç keşif ile uyumlu olan bir platform kullanılabilirliğini araştırmacılar roman karaciğeri etkileyen hastalıklar therapeutics tanımlamak izin vermelidir.
Giriş
Tarama için kullanılabilir deneyleri gelişimi başarı nadir bir hastalık hedeflemek için kullanılan ilaçlar belirlenmesinde esas alır. Hipotez veya hedef tabanlı ekranlar (ters farmakoloji) yararlıdır, ancak hastalığın moleküler temeli detaylı bir anlayış gerektirir. Fenotipik ekranlar (klasik farmakoloji) biyokimyasal yollar ayrıntılı bir anlayış gerekir ama bunun yerine doğru hastalığın patofizyolojisi ayna modelleri geliştirilmesi üzerinde güveniyor. Hedef tabanlı yaklaşımlar için coşku rağmen fenotipik ekranları daha başarılı1olmuştur FDA onaylı ilk sınıfındaki ilaç analizleri ortaya koyuyor. Bu yöntem genel amacı bu eleme yüksek üretilen iş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. insan kültürünü Pluripotent kök hücreler indüklenen
-
Rekombinant insan E-Cadherin Fc füzyon proteini (E-cad-Fc) veya diğer matrisler hPSC kültür için uygun kaplama 6
- E-cad-Fc 15 μg/mL Dulbecco'nın Phosphate-Buffered kalsiyum ve magnezyum (DPBS (+)) içeren serum fizyolojik ile oranında seyreltin.
- Kat 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri ile seyreltilmiş E-cad-FC 5 mL için en az 1 h. Kaldır substrat 37 ˚C, kuluçkaya ve Orta (Örneğin, mTeSR1 bundan sonra M-aracı olarak anılacaktır) ile 5 mL yerine7.
Not: Bu protokol için kullanılan kültür ort....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hepatosit nesil - tarihlerde hücreleri: Şekil 1 insan iPSCs hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma sırasında meydana gelen değişiklikler süre açıklar. İPSCs E-Cad-Fc Tarih kültür yaklaşık 2 mm pluripotent işaretçiyi OCT4 hızlı çapı kolonileri sağlar (Şekil 1A-B). Bir E-cadherin matris üzerinde yetiştirilen hücre morfolojisi bu diğer yüzeylerde kültürlü biraz far.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Belirli bir protein aktivitesini etkileyen nerede küçük moleküller tanımlanır temel hedef ilaç bulma, birçok varolan tarama çalışmalarının odak noktası olmuştur. Bu yaklaşım çok sayıda ilaç, ekranlar üzerinde ters bir fenotip, klasik Farmakoloji, dayalı sağlamıştır, ancak klinik olarak etkili1olmuştur ilk sınıfındaki bileşikler belirlenmesinde daha başarılı olmuştur. Bir dezavantajı fenotipik ilaç keşif için uygun hastalık modelleri kullanılabilirliğine dayanır olmasıdır. Bu hücre modelleri hastal.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Teşekkürler
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK55743, DK087377, DK102716 ve HG006398 S.A.D için) tarafından desteklenmiştir. Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop ve Ran Jing katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100 mm x 20 mm steril doku kültürü kapları | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm steril süspansiyon kültür kapları | Corning | 430591 | |
| 96 oyuklu doku kültürü plakası | Corning | 3595 | |
| Anti-insan Albümin | Dako | A 0001 | |
| Anti-insan FOXA2 (6C12) | Novus Biyolojik | H00003170-M12 | |
| Anti-insan HNF4 alfa | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-insan Oct-3/4 antikoru | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-insan SOX17 | R& D | AF1924 | |
| Anti-insan TRA-1-60 FITC konjuge | Millipore | FCMAB115F | |
| Aktivin Rekombinant İnsan Proteini | İnvitrojen | PHC9563 | |
| B-27 Takviyesi, eksi insülin ve nbsp; | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Takviyesi, serum içermez | İnvitrojen | 17504044 | |
| BMP4 Rekombinant İnsan Proteini | İnvitrojen | PHC9533 | |
| Hücre Ayrışma Reaktifi StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Canlılık Testi | Promega | 7572 | |
| DPBS + (kalsiyum, magnezyum) | İnvitrojen | 14040-133 | |
| DPBS- (kalsiyum yok, magnezyum yok) | İnvitrojen | 14190-144 | |
| DMEM / F-12, HEPES ve nbsp; | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA insan APOB ELISA geliştirme kiti | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (FGF2) | İnvitrojen | PHG0023 | |
| Hepatosit Kültür Ortamı (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF) | İnvitrojen | PHC0321 | |
| L-Glutamin | İnvitrojen | 25030081 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Rekombinant İnsan Proteini | İnvitrojen | PHC5015 | |
| Penisilin-Streptomisin | Invitrogen | 15140163 | |
| Besleyici içermeyen pluripotent kök hücre ortamı: mTesR1 | KÖK HÜCRE teknolojileri | 5850 | |
| Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Orta, HEPES | Invitrogen | ||
| StemAdhere Tanımlı Matris | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrat Çözeltisi | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC konjuge | Kırlangıç FCMAB115F | ||
| Versene (EDTA)% 0.02 | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 KAYA inhibitörü | KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ | 72302 |
Kaynaklar
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (20....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
