Method Article

Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

DOI:

10.3791/57199

⸱

February 6th, 2018

 ,  ,  , 
1Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Astbury Biostructure Laboratory, University of Leeds

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 1/30/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Matthew G. Iadaza

to:

Matthew G. Iadanza

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negatif leke EM makromoleküllerin yapısı görselleştirme için güçlü bir tekniktir, ancak farklı boyama teknikleri bir örnek bağımlı şekilde değişen sonuçlar üretebilir. Burada birkaç negatif boyama yaklaşım zorlu sistemleri görselleştirme mücadele için ilk bir iş akışı sağlamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negatif leke elektron mikroskobu (EM) nispeten basit ve hızlı gözlem oluştururlar ve makromoleküllerin kompleksleri kullanımı ile leke reaktif arttırmak karşıtlık sağlar. ~ 18-20 maksimum çözünürlükte sınırlı olmasına rağmen olumsuz Å, leke EM biyolojik sorunlar çeşitli için yararlıdır ve cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) için örnekleri değerlendirmek için hızlı bir yol sağlar. Negatif leke iş akışı basit yöntemdir; örnek bir substrat adsorbe, sonra bir leke uygulanan, deyimiyle ve elektron yoğun leke parçacıklar katıştırıldığı ince bir tabaka üretmek için kurutulmuş. Ancak, bireysel örnekleri boyama koşulları değişen altında belirgin farklı şekilde davranabilir. Bu yüzey hazırlama teknikleri, reaktifler ve yıkama ve kurutma teknikleri kılavuz boyama negatif, büyük bir çeşitlilik gelişmesine neden olmuştur. Tek tek her örnek için en uygun teknik belirleme bir harf tarafından ayrı ayrı yapmanız gerekir ve bir microscopist yüksek kalitede negatif leke sonuçlar elde etmek için farklı teknikler erişiminizin olması gerekir. İki farklı yüzey hazırlama yöntemleri ve üç farklı kurutma teknikleri için detaylı protokoller sağlanır ve belirgin farklı sonuçlar yöntemine bağlı olarak gösteren bir örnek bir örnek gösterilir. Buna ek olarak, bazı ortak negatif boyama reaktifler ve Lanthanide tabanlı iki roman lekeleri hazırlanması her kullanılmasıyla ilgili tartışma ile tanımlanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çözünürlük son dikkat rağmen güçlü bir teknik ve elektron microscopists araç önemli bir bileşenini EM kalır Devrimi cryo-elektron mikroskobu1 (cryo-EM), negatif önemli gelişmeler sonucunda leke. Negatif boyama hızlı değerlendirme örneği daha önce cryo-grid koşulları2en iyi duruma getirme için en iyi yöntem kalıyor. Yüksek karşıtlık ve negatif lekeli örnekleri kılavuz hazırlanması hızını örnek saflık, konsantrasyon, heterojen ve konformasyon esneklik3değerlendirmek için ideal yapar. Bazı örnekler daha iyi sonuçlar verir ve biyolojik olarak bilgilendirici modellerinden tekniği'nın çözünürlük ~ 18 Å çözünürlük4,5,6, sınırlı olmak rağmen olumsuz leke rekonstrüksiyonlar dan sonuçlandı cryo-EM nedenleri7çeşitli daha leke içinde.

Negatif leke EM, parçacık ilgi bir EM ızgara yüzeyine adsorbe ve elektron yoğun leke bileşik amorf bir matris tarafından saran. Yüksek bir göreli karşıtlık arka plan ve faiz, parçacık çevreleyen leke8' den daha az elektron yoğun olan parçacık ile arasında üretilmektedir. Parçacıklar aydınlık bölgelerde düşük Elektron Saçılım güçlerini göreli olarak daha fazla elektron scatters ve daha koyu görünür yoğun çevreleyen leke nedeniyle görünür. Leke herhangi bir çatlak nüfuz ve düzensiz kontrast ayrıntı9üretmek gibi parçacıkların substructural özellikleri sonuç görüntüleri ayrıntılı inceleme sonucuna.

Negatif boyama işlemi üzerinde örnek parçacıklar yakalanan bir destek substrat hazırlanması ve kurutulmuş leke desteklenen tabakası ile başlar. En sık kullanılan destek substrat şekilsiz karbon, bazen polivinil (örneğin Formvar) veya nitroselüloz (örneğin Kolloidon) polimer ince bir tabaka tarafından desteklenen bir katmandır. Bu yüzeylerde veya ticari olarak satın şirket içinde aşağıda açıklanan protokoller kullanılarak hazırlanan.

Destek substrat hazırlanır sonra örnek uygulanabilir ve kapalı fazla çözüm deyimiyle. Örnekleri negatif boyama için uygun bir tampon askıya. Fosfat tampon ve bu örnek karanlık kristal precipitates çıkmasına neden olabilir yüksek tuz konsantrasyonları kullanımını önlemek en iyisidir. Ayrıca leke kaliteli4etkiler azalan bakiyeli ajanları, deterjanlar, sukroz, gliserol ve nükleotid yüksek konsantrasyonları da kaçınılmalıdır. Su ile EM kılavuzunun yüzey yıkama arabellek oluşturma değiştirilemez veya daha uygun bir tampon boyama önce ve sonra adsorpsiyon azaltabilir arabellek oluşumu eserler ile ilgili ve genellikle leke arka plan geliştirmek. Arabellek eserler şüphelisiniz, arabellek bileşenleri gözlenen eserler kaynağı olup olmadığını belirlemek için bir salt arabellek kılavuz leke bilgilendirici olabilir.

Örnek adsorbe ve Imha ve gerekirse yıkanmış bir boyama reaktif uygulanır. Reaktifler çeşitli etkili negatif lekeleri (Tablo 1) olmak bulundu ama leke örneğe uygun olarak seçilmelidir. Bir '' leke formlarının etrafında halo parçacık nedeniyle her iki yerinden leke molekülleri hidrofobik bölgeler tarafından protein ve itme tarafından grupları kullanılıyorsa. Bu nedenle, protein herhangi bir potansiyel dolu gruplarında protonation durumunu çalışma pH leke aynıdır böylece leke seçilmelidir. Bir olumlu boyama için ücretleri proteinin yüzeyinde karşısında katkıda bulunabilir etkisi, hangi kendi doğru10 yararlı bir yöntem bu kağıt kapsamında olmamasına rağmen. En sık kullanılan negatif boyama reaktifler uranyl asetat ve uranyl Format vardır. Bu lekelerin bir nispeten ince taneli boyutu var (4-5 Å)9 ve diğer lekeleri fosfo-volframatler (8-9 Å tane boyutu)9,11, amonyum molibdat11ve bazı gibi üzerinden yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlamak lanthanide tabanlı 12lekeleri. Uranyl asetat ve format leke ve fizyolojik pH çökelti onun eğilimi düşük pH bazı örnekler14 zararlı olabilir, ancak bir milisaniye zaman ölçeği13, birçok protein-protein etkileşimleri koruyarak bir sabitleştirici olarak hareket . Onların yarar rağmen uranyl tuzları da hangi özel taşıma, depolama, gerektirebilir olan toksik ve hafif radyoaktif ve radyoaktif olmayan alternatifler aramaya bazı kullanıcılar neden bertaraf gereksinimleri olarak onlar lojistik sorunlar mevcut.

Yüzey Hazırlığı, örnek uygulama, açıklanan ve EM Izgaralar, boyama yöntemleri büyük bir çeşitlilik vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi örnek bağımlı ve yeni bir sistem mücadele zaman tespit etmek zor olabilir. Bu el yazması iki substrat hazırlık ve üç kurutma yöntemleri açıklar; yan kurutma, flicking5ve15kızarma hızlı. Yan kurutma açıklanan yöntemlerinin en basit olanıdır. Flicking yöntemi ve hızlı reçeteye göre sarf yöntemini uygulamak ama örnek fiksasyon önce destek film ile ilgili zaman sınırı ve iyileştirmek için bazı örnekleri5leke yapıların oluşumu gösterilmiştir daha zordur. Böylece bu el yazması hedefidir zorlu sistemleri negatif-leke EM tarafından görselleştirme mücadele için ilk bir iş akışı sağlamak için.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. EM Izgaralar hazırlanması

  1. Karbon sayfası yöntemi
    1. Bir taze i ciddi Mika sayfası hazırlamak.
      1. Yavaşça Mika levha, katmanları arasında bir kaç mm bir köşesinde bir hassas şırınga iğne veya jilet yerleştirin. Aracı olarak yaklaşık olarak eşit kalınlıkta iki parça üretmek mümkün olduğunca sayfasının dikey merkezine yakın yerleştirin.
      2. Dikkatle Mika sayfası iki yarısını ayrı halledeceğiz. Bu göz veya diseksiyon mikroskop altında yapmak.
      3. Her yeni i ciddi Mika sayfaların köşeler birini kes. Vakum yayın sırasında karbon Evaporatör sayfayı çevirir olay bu kağıdın karbon kaplı yan tespit edilebilir.
    2. İ ciddi Mika sayfası/s yukarı dönük olacak şekilde taze i ciddi yüzeyli bir karbon Evaporatör odasında yerleştirin.
    3. Karbon Evaporatör set-up düzgün hazırlanmış karbon elektrot ile düzgün olduğundan emin olun.
      Not: karbon çubuklar hazırlama yöntemi karbon Evaporatör özelliklerine bağlı olarak değişir. Bir araç için bir protokol adım kadar 1.1.5 gibidir.
      1. Bir karbon çubuk ile keskin bir ipucu var ve o zaman herhangi bir kaba çapak kaldırmak için bir kağıt havlu ile Lehçe bir kalemtıraş keskinleştirmek.
      2. İnce zımpara kullanarak ikinci bir çubuk sonuna dümdüz edip tekrar pürüzsüz bir kağıt havlu ile Lehçe.
      3. İki karbon çubuklar üreticinin yönergelerine uygun Evaporatör içine koyun. İlk çubuk üzerinde keskinleşmiş sonunda ikinci çubuk basık yüzlü firma iletişim yapar olun.
    4. Karbon kalınlığı görsel olarak gauged olabilir Eğer temiz, Kuru filtre kağıdı kısmen Mika altında küçük bir parça yerleştirin. Alternatif olarak, karbon kalınlığını ölçmek için Mika yanında vakum yağ küçük bir kurulamak beyaz buzlu mikroskop slaytla yerleştirin.
    5. Üreticinin yönergelerine uygun Mika üzerine karbon Kasası.
      1. Aşağı vakum pompası ve 10-5 mbar tamamlanana kadar bekleyin. Elektrot gerilimi V 4.0 ayarla (en çok 5 V karbon çubuk kaynağına bağlı olarak gerekli olabilir).
      2. Yaklaşık 3.5 ve birden çok kısa darbeleri çalıştırmak süresi boyunca 1-2 nm kalın evaporations karbon Mika yüzeyinde yatırmak için elektrot s.
        Not: Olarak geçerli o kırmızı kızdırma ve o zaman beyaz karbon çubuk uygulanır. Bu gözlerini zarar verebilir gibi parlak ışıklardan dik dik değil.
      3. Karbon istediğiniz kalınlıkta ulaşılıncaya kadar Mika üzerinde karbon Buharlaştırıcı'nın kalınlık ölçer veya filtre kağıdı ya da mikroskop slayt yatırılır karbon görsel gözlem tarafından ölçülen yatırmak izin. Son karbon tabaka 5-10 nm kalın olduğundan emin olun.
        1. Karbon kalınlığı görsel olarak ölçülür Eğer açık alan için vakum yağıyla kaplı mikroskop slayt buzlu cam parçası karşılaştırmak, o-ecek var olmak daha fazla karbon yatırılır gibi daha koyu.
          Not: Bu yöntemi kullanırken karbon kalınlığını belirlemek için nicel yöntem vardır.
    6. Vakum odası delik ve karbon kaplı Mika karbon Buharlaştırıcı kaldırın.
      Not: Sonraki adımlara geçmeden önce gecede yerleşmek için karbon kaplı Mika bırakılabilir
    7. Karbon film EM Izgaralar üzerine float için iki su kapsayıcı birini kullanın: bir kap su drene olabilir bu yüzden alt ve karbon tabaka tahliye Vanalı indirdi bekliyor kılavuzlar veya Izgaralar su altında ayarlanabilir bir kaldırma teçhizat yüzey, daha sonra su yüzeyinde karbon film kadar Izgaralar yükseltebilirsiniz.
    8. Böylece suyun yüzeyine yaklaşık 5 mm üst kapsayıcı ultrasaf distile su ile doldurun. Bir sayfa veya iki objektif doku herhangi bir kayan parçacıklar kaldırmak için yüzey üzerinde sürükleyerek su yüzeyini temizlemek.
    9. Temiz paslanmaz çelik kafes bir parça yerleştirin (1 inç x 2,5 inç ise uygun bir boyut) su yüzeyinin altında.
    10. Bir çift güzel cımbız kullanarak, temiz, Kuru EM Izgaralar yüz kadar (göre üreticinin açıklaması) paslanmaz çelik kafes üzerinde yatıyordu. Izgaralar birlikte mümkün olduğunca sıkı bir şekilde paketi ama örtüşmesi izin vermeyin.
    11. Bir kez Izgaralar düzenlenir, sıkıca karbon kaplı Mika sayfası cımbız veya maşa gelişmekte olan film bir çift kavrama.
    12. Mika sayfası suya tanıtmak. Bu çok sığ bir açıyla (~ 10 derece) yapılır emin olun.
      Not: Mika su yüzey kırmak ve daldırın, karbon film Mika ayırmak ve su yüzeyine float gerekir. Bu adımı hasar ve/veya kontaminasyonu önlemek için doğrudan Izgaralar üzerinde gerçekleştirilmesi gereken değil.
      1. Mika sacdan ayıran değil karbon film olasılığını en aza indirmek için bir tıraş bıçağı ile Mika levha kenarındaki Puan edinildi veya suya tanıtımı önce bir köşesinde küçük makasla kesilmiş.
    13. Karbon film müstakil, Mika sayfası kaldırmak veya kapsayıcı altına düşmesine izin.
    14. İnce uçlu cımbız kullanarak, çok hafif basınç uygulayın ve yavaş hareketleri ile karbon film Izgaralar üst üzerinde Kılavuzu.
    15. Karbon gökyüzünde yavaş yavaş su boşaltma veya kullanılan aparat türüne bağlı olarak kaldırma yüzüğü yükselterek ya Izgaralar yüzeyi ile temas halinde getir.
    16. Bazı filtre kağıt kullanarak aşırı su (şimdi ile Izgaralar karbon kaplı) paslanmaz çelik kafes aparatı ve fitil uzakta çýkýntýdan. Bu filtre kağıdı çelik kafes çok kenarına dokunmak ama Izgaralar veya karbon film ile temas gelmiyor tarafından yapılır emin olun.
    17. Izgaralar mesh kuru bir filtre kağıt parçası içeren bir kabında yerleştirin ve için tamamen kuru sağlar.
      Not: Bu en iyi gece oda sıcaklığında kurutma tarafından etkilenir, ama adım yanında duvar ilanı Izgaralar bir fırında yaklaşık 60 ° C'de hızlandırılmış olabilir
  2. Float ve ceket (doğrudan karbon birikimi). Bu yöntem daha önce ayrıntılı olarak tarif edilmiştir16
    1. Tamamen üst kısmında bir Menisküs oluşturur böylece ağzına kadar temiz büyük cam kase distile su ile doldurun.
    2. Dağılın ve tamamen kuru damlacık izin, Kolloidon çözüm (nitroselüloz amil asetat) tek bir damla temiz pasteur pipet kullanarak su yüzeyine uygulanır. Kuru bir kez ince bir tabaka halinde su yüzeyi üzerinde yüzen Kolloidon görünür hale gelir.
    3. Yavaşça su yüzeyinden toz veya diğer kirlenme kaldırmak için bir kürdan kullanarak Kolloidon katmanı kaldırın.
    4. İkinci Kolloidon damlacık su uygulamak ve dağılın ve 2-3 dakika kuru sağlar.
      Not: adımları 1.2.3-1.2.4 Kolloidon bir düz ve kırışık ücretsiz levha elde edilir kadar yineleyin.
    5. İyi cımbız yer EM Izgaralar yüz aşağı (göre üreticinin açıklaması) bir çift üzerinde kayan Kolloidon sayfasını kullanarak. Izgaralar birlikte sıkıca altıgen bir dizide paketi ama örtüşmesi izin vermeyin.
      Not: bir kılavuz misplaced ya da baş aşağı yerleştirilir Kolloidon sayfayı taşımak çalışırken zarar riski yerine yerde bırakmak genellikle en iyisi.
    6. Bir kez tüm kılavuzlar yerleştirilir, yavaşça bir filtre kağıt onlar üzerinde yatıyordu. Kağıt kılcal eylem tarafından doymuş olmak için izin verir.
      Not: Herhangi bir boyut veya filtre kağıt kalınlığı tam Izgaralar kapsıyorsa uygundur.
    7. Filtre kağıdı uzanan Kolloidon filmin kaldırmak için bir kürdan kullanın.
    8. Filtre kağıdı kenarındaki kavrama ve su yüzeyinden soyma.
      Not: Kılavuzlar için kağıt yapıştırılır kalmalı.
    9. Düz kağıt ve Kolloidon suratlı bir petri kabına yerleştirin ve tamamen kurumasını bekleyin.
    10. Filtre kağıdı ile 1.1.2 detaylı olarak düzgün hazırlanmış karbon elektrot ile karbon Evaporatör TMMOB kılavuzlarda yer.
    11. Karbon sayfası yönteminde için açıklandığı gibi karbon buharlaşma yordamı izleyin
  3. Aşırı ısınma ve nitroselüloz levha zarar önlemek için bakliyat arasında birkaç saniye izin vermek.
    Not: polimer katman her ne kadar bu adımı nadiren gereklidir Izgaralar boyalı, karbon edildikten sonra kaldırılabilir isterseniz. Izgaralar karbon yan taze bir filtre kağıt parçasına yerleştirin ve kağıt, ama üzerinde Izgaralar aseton birkaç damla koy. Aseton altında Izgaralar yayılmış ve dağıtılması ve polimer tabaka absorbe sağlar.

2. negatif boyama reaktifler hazırlanması

  1. Uranyl asetat hazırlanması
    1. Küçük hacimli ultrasaf su kaynatın ve iyice degas için 10 dakika kaynamaya sağlar. Biraz soğumasını bekleyin ve daha sonra uranyl asetat (UA) 1-%2 (w/v) dağıtmak için kullanabilirsiniz.
      Not: bir duman dolabında ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile bu yordamı gerçekleştirin.
    2. Çözüm soğuduktan sonra 0.2 µm şırınga filtre veya filtre kağıdı ile filtre.
    3. Işık ve 4 ˚C korumalı UA saklayın. Çözüm 1 yıla kadar stabil.
  2. Uranyl Format toz üzerinden hazırlanması. Bu yöntem daha ayrıntı önce içinde açıklanan8
    1. 20 mg uranyl Format (UF) toz 2 ml haşlanmış degassed ultrasaf su (aynı derecede içinde adım 2.1.1) tarafından karıştırma geçiyoruz.
    2. Karıştırmaya devam ederken, 5 M NaOH, çözüm 8 µL bir koyu sarı renk değiştirmek gerekir ama yok çökelti oluşturması gerektiğini ekleyin.
    3. Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre.
    4. UF leke ışıktan korunan mağaza. Herhangi bir çökelti veya renk değişikliği kahverengi leke gerekir atma görülmektedir. Çözüm sadece 1-2 gün boyunca stabildir.
  3. Uranyl Format Uranyl asetat üzerinden hazırlanması
    1. %1 (w/v) UA leke 1 mL 100 µL 1 M NaOH ekleyerek çökelti.
    2. Karışımı benchtop santrifüj maksimum hızda 2 dk santrifüj kapasitesi.
    3. Herhangi bir süpernatant atın ve 100 µL % 5 (v/v) formik asitin çökelti tarafından dinç vortexing geçiyoruz.
    4. %0,5 (v/v) formik asit UF leke vermeye 900 µL ultrasaf su ile 1 ml son hacim oranında seyreltin.
    5. UF leke ışıktan korunan mağaza. Hiç acele veya kahverengi renk değişikliği gözlem yapılırsa leke atın.
  4. Diğer boyama reaktifler hazırlanması
    1. Lanthanide asetat lekeleri hazırlanması
      1. Samaryum asetat (şaplak atmak), gadolinyum asetat (GdAc), Thulium asetat (TmAc) veya Erbiyum asetat (ErAc) 1-%2 (w/v) ultrasaf su geçiyoruz.
        Not: Eğer örnekleri olumlu boyama veya kılavuza zavallı bağlılık Bu lekeler kullanırken göstermek, onlar ilâ %0,5 (v/v) ile acidified formik asit. Pozitif boyama beyaz bir hale tarafından çevrili bir karanlık nesnesi olarak beliren örnek sonuçlanır. Izgarayı zavallı bağlılık beklenen kılavuzda gözlenen daha az sayıda molekülleri neden olur.
    2. Amonyum molibdat ve sodyum Phosphotungstate hazırlanması
      1. 1-%3 (w/v) ultrasaf su lekesi geçiyoruz. PH 7.0 istenirse 5 M NaOH kullanarak ayarlayın.

3. karbon örnekleri adsorbing substrat ve boyama

  1. Hydrophilic işleme tarafından hazırlanması ızgara yüzeyi için örnek uygulama
    1. Yukarı bakacak şekilde bir ışıma deşarj biriminde mikroskop slayttaki kılavuz yerleştirin.
    2. Izgarayı 30 en az tedavi s 10 mA.
      Not: Kızdırma deşarj kesin yöntem kullanılan ekipmanın belirli özelliklerine bağlıdır.
    3. Alternatif olarak bu UV ışınlama 10 dakika benchtop UV lamba4kullanarak tarafından başarılı.
  2. Yan Blot yöntemi. Bu yöntem daha ayrıntı önce içinde açıklanan8
    1. Kılavuz kenar negatif basınç cımbız bir çift ile kavrama ve 3-5 µL örnek destek yüzey için geçerlidir.
    2. Örnek 10 için kılavuz yüzeye absorbe izin s 1 dk. Optimize için adsorpsiyon zaman gerekir için bireysel örnekleri.
    3. Bir filtre kağıt kılavuzuna kenarına dokunmak ve kılcal sıvı çekmek eyleme izin.
    4. İsteğe bağlı: ızgara yıkayın. Ultrasaf su veya uygun geçici arabellek çözüm laboratuvar film bir sayfada yer 50 µL bırakır. Hafifçe ızgara karbon yüzeye damlasına dokunun ve kapalı ızgara yüzeyine küçük damlacık kaldırın. Bir filtre kağıt kılavuzuna kenarına dokunmak ve kılcal sıvı çekmek eyleme izin.
    5. İstediğiniz gibi birçok kez bu yıkama tekrarlayın.
    6. Laboratuvar film sayfadaki reaktif boyama yer iki 50 µL damla.
    7. Hafifçe ızgara karbon yüzeye damlasına dokunun ve kılavuzun üst yüzeyine küçük damlacık kapalı kaldırın.
      Not: Eğer leke geçirir kılavuz sonra kılavuz arkası atılmalıdır.
    8. Bir filtre kağıt kılavuzuna kenarına dokunmak ve kılcal sıvı çizmek eyleme izin. İki kez boyama bu adımı gerçekleştirin.
    9. Hava kılavuza kuru veya kuru bir akkor lamba altında izin.
  3. Flicking yöntemi
    1. Kılavuz kenar negatif basınç cımbız bir çift ile kavrama ve 3-5 µL örnek destek yüzey için geçerlidir.
    2. Böylece ızgara yaklaşık 45 ° uzakta karşı karşıya açılı cımbız bir elinde tutarak, hızla 'fiske kapalı ızgara üzerine damlacık çoğunluğu için ' Bu el bilek hafifçe vur.
    3. İsteğe bağlı: bir cam Pasteur pipet kullanarak yıkama çözüm bir damla destek yüzeye uygulamak ve 'kapalı fiske 3.2.2 olduğu gibi'. Gerektiği şekilde yineleyin.
    4. Bir cam Pasteur pipet kullanarak destek yüzeye reaktif boyama bir damla uygulama ve 'kapalı fiske 3.2.2 olduğu gibi'. Numune görselleştirme için gerekli leke derinliği 1 - 3 kez bağımlı yineleyin.
      Not: Bu son leke derinlik için öznitelikleri tek etken değildir (konuya bakın).
    5. Fazla leke filtre kağıt kılavuz kenarına yırtık kenar dokunarak kaldırın.
    6. Hava kılavuza kuru veya kuru bir akkor lamba altında izin.
  4. Hızlı reçeteye göre sarf yöntemi
    1. Leke, 30-70 µL çizmek (% 1'ua genellikle kullanılan) 200 µL pipet ucu hava 5 µL kadar çizmek, o zaman kadar reaktif yıkama/karıştırma (5-30 µL), eğer gerekli, başka bir küçük hava boşluğu tarafından takip ve sonra örnek 5 µL kadar çizmek çizmek için birim kadranını.
    2. Kavrama negatif basınç cımbız, böylece kılavuz araştırmacı uzak karşı karşıya yaklaşık 45 ° açılı cımbız tutan bir çift ile bir kılavuz kenar karbon kaplı EM kılavuz suratının ortasına pipet ucu tüm içeriğini dışarı atmak.
    3. Fazla leke filtre kağıt kılavuz kenarına yırtık kenar dokunarak kaldırın.
    4. Hava kılavuza kuru veya kuru bir akkor lamba altında izin.
      Not: tüm yöntemleri için bu çözüm bir kez onlar are hangi kurutulmuş kılavuz forseps çene indirebiliriz forseps, iki taraf arasında sıkışıp kaldırır gibi ızgara ulaşıncaya kadar yırtık forseps boyunca filtre kağıdın kenarına slayt için tavsiye edilir açıldı. Cımbız kılavuzunda da kuru bir duman hood kenarında yerleştirilebilir. Sabit hava akımı daha fazla üretmek yardımcı olabilir hatta boyama.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm test boyama reaktifler negatif bir dereceye kadar boyama örnekleri en iyi kontrast ve keskin, en ayrıntılı parçacıkları ile verimli UF ile üretilen. TmAc ile üretilen ErAc ve TmAc belirgin kontrast ve netlik lekeli parçacıkların tarafından değerlendirilecektir olarak UA için eşdeğer kalitede negatif boyama derin gömülü örnekleri (şekil 1) göre lanthanide lekeleri için üreten daha net, daha net görüntüler ErAc. Tütün mozaik virüsü (TMV) partikülleri % 1 TmAc ~ 23 Å tekrar TMV parçacık lekeli TmAc büyük tane boyutu yüksek büyütme oranında belirgin hale gelir, ancak17 hala açıkça göz ve a güneyden tabaka satır olarak görünür Fourier dönüşümü ham görüntü. Test, diğer lanthanide lekeleri ErAc, şaplak atmak veya GdAc, bu özellik çözmeniz mümkün değildi. Sınıf ortalamaları TMV parçacıkları nerede Helisel tekrar görünür örtüşen kesimleri ayıklayarak üretildi. Ayıklanan kesimleri sonra uyumlu ve düzenli özelliği (Şekil 2) daha iyi görmek için RELION18 kullanarak gizli.

C-protein kas türetilmiş gibi bazı örnekleri boyama, yöntem için özellikle duyarlıdır. C-protein, IG ve Fn benzeri etki alanları esnek bir dizi oluşur, negatif-leke EM boyama kullanılan (şekil 3) yöntemi üzerinde bağımlı tarafından önemli ölçüde farklı görüntüleri üretir. Yan-Blot yöntemi kullanarak çöktüğünde ne zaman hızlı yıkama veya yöntemleri flicking tarafından lekeli, C proteinli bir dize üstündeki benzer etki alanları bir dizi olarak görülmektedir, ancak yüzük benzeri yapılar gözlenir.

ReaktifKonsantrasyonpHTürü
Amonyum molibdat1 - %25-7Anyonik
Erbiyum asetat (ErAc)1-%26Katyonik
Gadolinyum asetat (GdAc)1-%26Katyonik
Methylamine tungstate% 26-7Anyonik
Samaryum asetat (şaplak atmak)% 16Katyonik
Sodyum silicotungstate1 – % 55-8Anyonik
Sodyum phosphotungstate1 -3%5-8Anyonik
Thulium asetat (TmAc)1-%26Katyonik
Uranyl asetat (UA)1-% 33-4Katyonik
Uranyl Format (UF)0.75-%13-4Katyonik

Tablo 1: Bazı ortak negatif boyama reaktifler.

figure-results-1
Şekil 1: örnek Filmler Tütün mozaik virüsü ile çeşitli olumsuz leke reaktifler lekeli (A) % 1 UF (B) % 2.5 TmAc (C) % 2.5 ErAc. (D) % 1'ua (E) % 2.5 GdAc ve (F) % 2.5 şaplak atmak. Ölçek çubukları vardır 100 nm. Birden çok alanı REPLICATE görüntüsü ile birden fazla çoğaltır temsilcisi görüntülerden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Tütün mozaik virüsü Thulium asetat ile boyama (A) yüksek büyütme TMV bir test üzerinden alanının yüzde 1'lekeli TmAc. Ölçek çubuğu olduğunu 20 nm. Ayıklanan TMV kesimleri ortalama sınıf (B) . (C) Fourier dönüşümü paneli A gösteren katman çizgi yansımaları ~ 23 görüntünün Å. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: kurutma yöntemi C-protein biçimi üzerinde etkileri. (A) C-protein yan blot yöntemi ve (B) flicking yöntemi kullanarak UA ile lekeli. Üst panel ölçek çubuğu olduğunu 50 nm, alt paneli ölçek çubuğu olduğunu 20 nm. Birden çok alanı REPLICATE görüntüsü ile birden fazla çoğaltır temsilcisi görüntülerden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması için elektron mikroskobu boyama reaktifler, iki roman lanthanide reaktifler (TmAc ve ErAc) dahil olmak üzere çeşitli kullanarak örnekleri negatif boyama için birden çok yöntem açıklanır. Negatif boyama işlemi adımların çoğu, leke tutmayan, varsa gerekli yıkama ve blotting tekniği seçimi de dahil olmak üzere tek tek örnekler için optimize edilmiş olması gerekir. Bu el yazması böylece microscopists negatif boyama zorlu sistemlerinin mücadele için kendi iş akışı geliştirmek için bir temel sağlar.

Leke son derece bağımlı örnek seçimdir. Düşük pH için özellikle hassas örnekleri UA ve/veya UF, bu lekeleri19sabitleştirici özellikleri rağmen bozulmuş. Bu gibi durumlarda, lanthanide bazlı lekeleri rağmen hazırlık genel pH olumlu boyama önlemeye yardımcı olmak için örnek protein isoelectric noktasını altına tutulmalıdır TmAc veya ErAc daha uygun olabilir. Bu gerekirse Asetik asit ile leke acidifying tarafından gerçekleştirilebilir. Özellikle düşük pH duyarlı örnekler için Anyonik tungstate veya molibdat lekeleri daha etkili olabilir. Gibi her ne kadar bu lekeler eserler bazı durumlarda oluşumu teşvik tespit edilmiştir, lipoprotein rouleaux oluşumu20örnekler. Yine, leke, pH, bu kez olumlu boyama önlemek için örnek, isoelectric noktası yukarıda ayarlanması gerekebilir.

Yıkama boyama önce örnek numune tutulan arabellek yüksek tuz veya fosfat bileşeni varsa gerekli olabilir. Birçok durumda, çamaşır ultrasaf su ile yapılabilir ama aşağılamak veya su yalnız maruz kaldığında yapısal değişiklikleri meydana, daha duyarlı örnekleri için çamaşır düşük iyonik gücü8uçucu bir arabellek ile yapılması gerekebilir. Dikkatle kontrollü şartlar altında bile, çamaşır karbon yüzey21bazı yapısal yeniden neden olabilir.

Hangi kurutma ve boyama örnek adsorpsiyon açısından bir kılavuz hazırlanmıştır yöntemi ne görülmektedir de önemli ölçüde etkileyebilir. En uygun yöntemi olduğunu böylece, yeniden, son derece örnek bağımlı. C-protein, örneğin, yan-leke boyama takip küresel bir yüzük benzeri yapı olarak gözlenen, ama bu bir obje boyama işleminin Izgaralar flicking yöntemi (ya da hızlı reçeteye göre sarf yöntemi tarafından) hazırlanan ortaya gibi görünüyor (şekil 3 ). Fiske ve hızlı reçeteye göre sarf yöntemi içinde karbon ile etkileşim için örnek vardır zaman destek fiksasyon önce simge durumuna küçültülmüş15yüzeydir. Örnek ayrıca daha az önce fiksasyon kurutma üzerine basık Menisküs kuvvetlerden deneyimleri. Bu üzerine uzun süreli emme zamanı karbon film veya kılcal eylem yoluyla oluşabilir numune yapısal değişiklikleri en aza indirgemek anlamına gelir. Hızlı reçeteye göre sarf yöntemini örneklerin analiz zaman karar vermek için de kullanılabilir. Örnek bir ligand ya da bir pipet ucu kümesi içinde katkı ile karışık ızgara yüzeyi fiksasyon milisaniye içinde önce ne kadar süre uygulama bir kılavuza veya sadece bir an önce dönem.

Belirli bir örnek en iyi görüntüleri yeniden örnek bağımlı2sağlamak için gerekli leke derinliği. Leke çok sığ ise, moleküller elektron ışını tarafından zarar görebilir ancak leke çok kalın ise yapısal özellikleri kaybolabilir. Leke derinlik hydrophilicity ızgara yüzeyi, Rastgelelik karbon tabaka, leke leke ile temas halinde ızgarayı kurutma, kurutma ölçüde ve zaman önce o süreyi kılavuza ta uygulanan tutar gibi çoklu faktörlerden etkilenir Kes için kılavuza tamamen kuru. Bir kılavuz hiç leke eşit dağılımı bütünüyle arasında olacak ve bu nedenle ızgarayı görüntüleme için uygun alanları dikkatle seçilmesi gerekir. Nitekim, Izgaralar kez zaman bile aynı gün aynı koşullarda hazırlanan kalite değişir. Görüntüleme Burgess tarafından sağlanır varyasyon leke derinlemesine molekülleri ve uygun leke derinlik görünümünü etkilemesi iyi bir örnek ve ark5.

Negatif boyama çok hızlı, çok yönlü ve basit bir yöntem olmasına rağmen tüm biyolojik örnekler görselleştirme bu yöntem tarafından mükellef bulunmaktadır. Kırılgan derlemeler daraltmak veya boyama veya EM kılavuz22tarihinde kurutma adsorpsiyon sökmeye. Negatif boyama da molekülleri düzleştirme için yol ve molekülleri karbon destek film7tercih edilen yönelimleri teşvik.

Olumsuz örneklerin kendi başına ve aynı zamanda cryo-EM analiz öncesi değerlendirme için değerli bir araç olmuş ama birçok örnek işlemi sırasında karşılaştığı fiziksel güçlerinin kötü anlaşılır. Bu nedenle, kullanmak için en iyi yaklaşım olduğunu son derece bağımlı örnek ve deneme yanılma yerine sabit bir iletişim kuralı aşağıdaki öğretti tarafından belirlenmelidir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peter Knight için son derece yararlı tartışmalar ve eleştiri el yazması için minnettarız. Tüm üyeleri Neil Ranson'ın ve Stephen Muench'ın labs ve Astbury Biostructure laboratuvar personeli yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Avrupa Araştırma Konseyi (FP7/2007-2013) tarafından finanse edildi / ERC hibe sözleşmesi 322408. C-protein kaynakları bir İngiliz kalp Vakfı Hibe (birimi BHF PG/13/83/30485) tarafından sağlanan kullanarak üretildi. Biz de Wellcome Trust elektron mikroskobu Leeds (090932/Z/09/Z ve 094232/Z/10/Z) desteklemek için fon donanımları için teşekkür ederiz. CS bir hoş geldiniz güven ISSF Grant tarafından finanse edilmektedir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
200 gözenekli bakır EM ızgaralarıSigma-AldrichG4776-1VLDiğer malzemeler ve / veya ağ boyutları da kullanılabilir:
Amonyum Molibdat, Sigma-Aldrich277908
Karbon buharlaştırıcıTed Pella, Inc.9620Cressington 208 veya eşdeğeri
Sigma-Aldrichiçinde %2 kolodion çözeltisi9817
Dumont #5 negatif basınçlı cımbızWorld Precision Instruments501202Veya tercih edilen diğer cımbız
Erbiyum AsetatSigma-Aldrich325570
Gadolinyum AsetatSigma-Aldrich325678
Mika levhalar. 75x25x0.15mm boyutlarındadır.AGAR ScientificAGG250-1
Mikroskop slaytları, beyaz buzluFisher Scientific12607976Veya eşdeğeri
ParafilmFisher Scientific10018130Veya eşdeğeri
Pasteur pipeti (cam)Fisher Scientific10343663Veya eşdeğeri
Tıraş bıçağıFisher Scientific11904325Veya eşdeğeri
Zımpara Kağıdı Hırdavatçı200 (600 önerilen)
Samaryum AsetatSigma-Aldrich325872
Sodyum HidroksitSigma-Aldrich1.06462
Sodyum FosfotungstatSigma-AldrichP6395
Paslanmaz Çelik Hasır, 150x150 mm (boyuta göre kesilmiş)AGAR ScientificAGG252
Thulium AsetatSigma-Aldrich367702
İki Kademeli Karbon Çubuk Keskinleştirici, 1/4 "çubuklar içinTed Pella Inc.57-10Veya kullanılan karbon buharlaştırıcı için eşdeğeri
Ultra saf su
Uranil Asetat ElektronMikroskobu Bilimleri22400
Uranil Format ElektronMikroskobu Bilimleri22450
Vakum gresiFisher Scientific12719406Veya eşdeğeri
Whatman # 1 Filtre kağıdı.Fisher Scientific1001 090Veya eşdeğeri
Whatman #40 filtre kağıdıFisher Scientific10674122Veya eşdeğeri
, Amil asetat daha ince kumlu ıslak ve kuru zımpara kağıdı.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).">Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  2. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).">De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  3. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).">Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  4. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).">Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
  5. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).">Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
  6. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).">Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
  7. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).">Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  8. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).">Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
  9. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).">Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
  10. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).">Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
  11. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).">Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
  12. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).">Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
  13. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).">Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
  14. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).">Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
  15. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179(2015).">Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179(2015).
  16. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).">Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  17. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).">Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
  18. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).">Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
  19. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).">Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  20. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).">Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
  21. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).">Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
  22. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).">Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Negative Stain Electron MicroscopyGrid Preparation TechniquesStaining ReagentsBlotting MethodsUranyl AcetateLanthanide Based StainsCarbon Sheet MethodSide Blot MethodFlicking MethodRapid Flushing Method

Related Articles