Yöntem makalesi

Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

DOI:

10.3791/57263

⸱

28 Şubat 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health, Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, kardiyak Mezenkimal stromal hücre Aritmojenik kardiyomiyopati hasta endomyocardial bioptic örneklerinden izole etmek için bir yöntem sağlar. Onların karakterizasyonu ve onların Adipojenik farklılaşma artırmak için iletişim kuralı anlatılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normal bir yetişkin kalp arasında kardiyak Mezenkimal stromal hücreler bol bir nüfusu temsil birkaç farklı hücre türleri oluşur. Bu hücreler yalıtım onların katılımı kalp hastalıkları eğitim imkanı sunuyor ve buna ek olarak, biyolojik mekanizmaları araştırmak için yararlı birincil hücre modeli sağlar.

Burada, C-MSC izolasyonu Aritmojenik kardiyomiyopati hasta bioptic örnekleri için yöntemi açıklanmıştır. Endomyocardial biyopsi örnekleme bitişik elektro-anatomik eşleme tarafından görüntülenmiştir SCAR sağ ventrikül alanlarda yönlendirilir. Collagenase ve kültür C-MSC büyüme sağlamak için orta bir plastik tabak üzerine onların kaplama biyopsileri hazım açıklanmıştır. İzole hücreler kültür çeşitli pasajlar için genişletilebilir. Onların Mezenkimal fenotip onaylamak için immün phenotypical karakterizasyonu açıklaması sağlanır. C-MSC içine adipositler, kondrosit ve dokusunu gibi çeşitli hücre tiplerinin ayırt edebiliyoruz: ACM bağlamında, hastaların kalp yataklarında adipocyte, C-MSC Adipojenik farklılaşma protokollerde karakterize ve lipid damlacık birikimi karakterizasyonu açıklanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok doku1' deki önemli bir destek işlevi ile yetişkin hücreler Mezenkimal Stromal hücreler (MSC). Kemik iliği MSC tarihsel kaynak gösterir, ama onlar plasenta, yağ dokusu, kordon kanı, karaciğer ve kalp1,2de dahil olmak üzere farklı dokulardan ayrılmış olabilir.

2006'da, uluslararası toplum için hücresel Terapisi (ISCT) belirtilen, ilk kez insan MSC3tanımlayan en az ölçütü. Özellikle, MSC plastik için uygun yeteneği olması gerekir. Onlar belirli yüzey antijenleri hızlı: iyimserliği CD44, CD105, CD29 ve CD90 Mezenkimal işaretleri ve CD14, CD45, CD34 olumsuzluk için MSC CD31 hematopoetik ve endotel işaretleri karakterize. HLA-DR eksikliği ifadesi nedeniyle, MSC alloreactivity tetiklemek yapamaz. Ayrıca, onlar multipotent hücrelerinin Adipojenik, kondrosit ve osteoblast soy1,3doğru ayırt etmek için potansiyeli vardır.

Kardiyak hücresel kompozisyon üzerinde odaklanarak, kardiyak Mezenkimal stromal hücre (C-MSC) bir normal yetişkin kalp4,5' te bol miktarda bulunmaktadır. Onlar normal kardiyak fonksiyon ve patolojik koşulları hem de kritik bir rol oynamaktadır. Süre, fizyolojik, C-MSC Miyokardiyum yapısal ve işlevsel bütünlüğü destekleyen bir microenvironment sağlamak, kalp hastalıkları kalp yaralanması yara iyileşmesi ve fibrotik6 remodeling katılan karşılık olarak etkinleştirilir ,7.

C-MSC katılımı Aritmojenik kardiyomiyopati (ACM) yağ değiştirme gösterdiği8zamanlarda. Özellikle, ACM esas olarak başta olmak üzere sağ ventrikül9miyokardiyal fibro-yağ yerine neden desmosomal genlerdeki mutasyonlar neden genetik bir hastalıktır. Epicardium endokard için uzanan bu ikame ilerleyici kalp yetmezliği ortaya çıkarır ve ani ölüm için şiddetli vakalarda açabilir Ventriküler Aritmiler kötüleşir iletken olmayan bir yüzey oluşturur. Sommariva vd. öncesi adiposit Mezenkimal kökenli gösterdi ACM hastaların explanted kalp bölümler mevcut. Ayrıca, C-MSC ACM kalpler hızlı desmosomal gen endomyocardial biyopsi izole ve bu nedenle onların mutasyon tarafından etkilenebilir. Özellikle, Adipojenik koşullar altında ACM C-MSC denetim kalpler gelen bu daha fazla yağlar birikir. Bu kanıt C-MSC hem aktif bir rol hastalık patogenezinde ve ACM eğitim için geçerli hücre modeli temsil olduğunu sonuca yol açar.

Bu bağlamda veya diğer kalp hastalıkları kardiyak biyopsi gösteren gelecekteki araştırma kolaylaştırmak için detaylı bir iletişim kuralı küçük parçaları endomyocardial doku, kendi genişleme, onların IMMUNO-phenotypical C-MSC izolasyonu için sunulan karakterizasyonu ve Adipojenik farklılaşma.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yaklaşım Helsinki Bildirgesi ile uyumludur ve sağ ventrikül örnekleri topluluğu yapıldı (07/06/2012) "Centro Cardiologico Monzino IRCCS" Etik Komitesi tarafından onaylanmış.

1. çözümler

  1. BR orta ile Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (% 20 ile desteklenmiş IMDM), C-MSC kültür için yapmak Fetal sığır Serum (FBS), 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü, 10.000 U/mL penisilin, 10.000 µg/mL streptomisin ve 0,02 M L-glutamin. 0,22 µm steril filtre birimini kullanarak br orta filtre ve 4 ° C'de depolayın
  2. Collagenase çözüm hazırlamak için 3 mg/mL bir konsantrasyon ile son bir çözüm elde etmek için IMDM orta collagenase NB4 karışımı resuspend. Girdap yavaşça toz geçiyoruz ve collagenase çözüm 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulamak için. Aliquot 1 mL Cilt 2 mL steril tüpler ve mağaza-20 ° c kadar kullanım için gerekli.
  3. T. ADIPO orta hazırlamak, Adipojenik orta IMDM orta ile yapmak için takıma %10 FBS, 0,5 mM 3-İzobütil-1-(Dimetil sülfoksit (DMSO) 0, 5 M bir konsantrasyon önceden seyreltilmiş ve kadar kullanmak-20 ° C'de muhafaza) methylxanthine, (önceden seyreltilmiş 1 µM hidrokortizon 100 mM ve daha fazla steril 10 mM seyreltilmiş DMSO içinde distile su ve kadar kullanmak-20 ° C'de muhafaza) ve (önceden 0,5 M bir konsantrasyon DMSO içinde seyreltilmiş ve kadar kullanmak-20 ° C'de muhafaza) 0.1 mM İndometazin. 0,22 µm steril filtre birimini kullanarak T. ADIPO orta filtre ve 4 ° C'de depolayın
  4. Fosfat tamponlu tuz 0.0067 M PO4 (PBS), ethylenediamine tetra Asetik asit (EDTA) oluşan çamaşır arabellek hazırlamak 5 mM ve % 5 sığır serum albümin ve mağaza 4 ° C'de
  5. Yağ kırmızı O (ORO) çalışma çözüm % 1 ORO toz % 60 isopropanol içinde eriterek, 2s için karıştırma ve precipitates kaldırmak için 0,22 µm filtre ünitesi kullanarak filtreleme hazırlayın. Çalışma çözüm (RT) oda sıcaklığında saklayın.

2. kardiyak Mezenkimal Stromal hücre izolasyon

  1. Kardiyak biyopsi toplama ve işleme
    Not:     başlamadan önce collagenase çözüm ve br Orta hazır olduğundan emin olun.
    1. ACM endomyocardial biyopsi koymak (genellikle 5 mg doku) steril bir tüp içinde br ile dolu ve laboratuvara taşımak.
      Not: ACM biyopsi Elektrofizyoloji ameliyat odasında önceki raporları10göre toplanır. Kısaca, elektro-anatomik eşleme ve sağ ventrikül içinde İntrakardiyak Ekokardiyografi entegrasyon ( Video 1bakınız) endomyocardial biyopsi rehberlik için kullanılır (bkz. Video 2, floroskop) yazışma için sınır bölgesi içinde hastalıklı Miyokardiyum. Sağlıklı kontrol (HC) örnekleri bir doku biyo-banka, sağ ventrikül ücretsiz duvar kadavra donör ölüm (kaza sonucu ölüm, sağlıklı) 24 saat içinde elde tarafından sağlanır. Taşıma sırasında ve diseksiyon önce biyopsi br içinde 4 ° C'de depolamak. Biyopsi toplama ve doku işleme (maksimum 24 saat) arasında zaman sınırı.
    2. Biyolojik koruması ürününü Enzimatik sindirim kadar yordamı yürütmek için gerekli çözümleri ile kabine ayarlayın.
    3. Sterilizatör başlık altında koymak ve enstrüman kullanmadan önce 15 dk kadar 200-250 ° c sıcaklık yükselir açmak
    4. Makas sterilize ve cımbız 10 s. yapmak için emin steril aletler kullanılmadan önce soğuk vardır. Tek kullanımlık steril neşter hazır olun.
    5. Biyopsi ile tüplerin steril mahallede yerleştirin. Tüp açın ve biyopsi steril bir tabak aktarın.
    6. Sağ ventrikül biyopsiyi iki kez 3 mL steril PBS ile yıkayın. Biyopsi mikroskop çekmek istiyorsanız.
    7. 1 mL collagenase çözeltisi içeren bir steril 2 mL tüp içine steril cımbız kullanarak sağ ventrikül biyopsi aktarın.
    8. Örnek 0,5 - 1 mm3 parçalar halinde steril makasla kesilmiş.
    9. Sürekli dönen ajitasyon altında 37 ° C'de 1,5 saat için kuluçkaya.
    10. 400 x g 10 dk RT. az için de sindirilir çözüm santrifüj kapasitesi
    11. Süpernatant çıkarın ve 1 mL steril PBS Pelet yıkamak için ekleyin.
    12. Dik, 10 dk 400 x g, santrifüj
    13. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 1 mL br orta resuspend.
    14. Steril 60 mm doku kültürü tedavi plaka üzerine elde edilen süspansiyon plaka ve br orta 3 mL son hacim için ekleyin. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO237 ° C'de plaka kuluçkaya.
      Not: Orta daha yüksek hacmi sindirilir biyopsi parçaları doğru yapışma engelleyebilir.
    15. 24 saat sonra sigara yapışık hücreleri ve enkaz kaldırmak için orta atın.
      Not: Tek Disosiye Mezenkimal hücreler plastik yüzey ekleyin ve klonlar için neden olmaktadır; Ayrıca, sindirilmemiş küçük biyopsi parçaları plastik yemek için iliştirin ve hücre çimlenme izin verebilirsiniz.
    16. İki kez 5 mL steril PBS ile tabak yıkama ve taze br orta 3 mL ekleyin.
    17. BR orta üç bir hafta kadar hücreleri % 80 birleşmesi değiştirin.
      Not: Ekli hücre sayısı kalite, doku miktarını ve sindirim verimliliğini bağlıdır.

3. Hücre genişletme

Not: Başlamadan önce doğru br Orta hazır olduğundan emin olun.

  1. Hücrelerin % 80 Konfluent, transfer olduğunda yeni bir steril 60 mm doku kültürü içine sindirilmiş küçük bioptic örnekleri plaka tedavi ve taze br orta 3 mL ekleyin.
    Not: Bioptic örnekleri daha fazla C-MSC yalıtım için yeniden kullanılabilir. İzole hücreler önemli sayıda kadar bu yordamı yineleyin mümkündür.
  2. 3 mL steril PBS ekli hücrelerle iki kez yıkayın. Tripsin-EDTA çözüm (60 mm yemek için 0.5 mL) ekleyin ve 3-5 dk hücre dekolmanı izin vermek için 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. Hücreleri plaka yüzeyinden ayrılır, 0.5 mL steril FBS tripsin devre dışı bırakın ve yeni bir 50 mL steril tüpe hücreleri toplamak için ekleyin.
  4. 5 mL steril PBS için aynı tüp kalan hücreleri eklemek için de iki kez plakalı yıkayın.
  5. 400 x g 10 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi
  6. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 1 mL br orta resuspend.
  7. Odası sayma hücredeki hücre süspansiyon 10 µL yükleyin.
    Not: Hücreleri de konsantre yoksa PBS ilk süspansiyon 1:10 sulandırmak ve 10 µL odası sayma hücredeki seyreltilmiş hücrelerinin yükleyin.
  8. Mikroskop altında 3 büyük meydanlarda ve iki yan yana satırlarındaki hücreleri saymak ve hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın.
    Not: Hücre/mL dizi elde etmek için sınırlı sayıda hücre ortalama 10 ile çarpılır4, seyreltme faktörü odası sayma hücre. Çarpma için seyreltme faktörü hücreleri daha fazla sulandırılmış eğer. Temel için cep telefonu numarasını ve hücre konsantrasyonu (hücre/mL sayısı) arasındaki oran ilk süspansiyon için bir sonraki adım (noktası 3,9) kaplama hacmi (mL içinde) karşılık gelir.
  9. Resuspension steril 100-mm doku kültürü tedavi plakaları 5,000-10,000 hücreler/cm2 son bir konsantrasyon, üzerine plaka ve br Orta 8 mL son hacim için ekleyin. Bir hücre kültür kuluçka plaka kuluçkaya.
    Not: Hücreleri % 70-80 birleşmesi olduğunda hücre genişletme yordamı yineleyin. Her geçiş (P), bu hücreleri ve plaka kalan tutar parçası cryopreserve için tavsiye edilir. P3 veya P4 kadar hücreleri genişletin ve floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) analizi (Bölüm 4) ve Adipojenik farklılaşma (Bölüm 5) için kullanın.
  10. Dekolmanı sonra dondurma için 400 x g 10 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi
  11. Olarak hücreleri hesaplama (Adım 3.7-3,8) açıklanan ve 1 x 106 steril FBS 900 µL hücrelerde resuspend. Steril cryo-şişe için transfer ve 100 µL steril DMSO ve karışımı ekleyin.
  12. Hızlı bir şekilde cryo-şişeleri dondurucu bir kaba-80 ° C'de en az 2 gün için depolamak ve sıvı nitrojen tüpleri aktarmak.

4. kardiyak Mezenkimal Stromal hücreler tarafından Akış Sitometresi karakterizasyonu

Not: Başlamadan önce hücre ayrılma reaktifi Tampon ve hazırlanan özel antikorlar yıkama emin olun.

  1. Cep numarası en az 3 x 10 ulaştığında6 (sayısı) 3.7-3,8 içinde hücreler olarak açıklanan, 10 mL steril PBS ile iki kez 100-mm saç yıkamak.
  2. Bir hücre ayrılma reaktif 5 mL ekleyin ve RT hücre dekolmanı izin vermek için 7-10 dk bekleyin.
  3. Hücreleri plaka yüzeyinden ayrılır, 15 mL steril çamaşır arabellek ekleyin ve süspansiyon bir yeni 50 mL steril tüpe toplamak.
  4. Plaka, arabellek yıkama 10 mL ile iki kez yıkayın ve kalan hücreleri aynı tüp ekleyin.
  5. 400 x g 10 dk RT az için hücreleri santrifüj kapasitesi ve Pelet arabellek yıkama 1 mL resuspend.
  6. Açıklanan (Adım 3,7-3,8), içindeki hücreleri saymak ve 3 x 106 hücre yeni bir steril tüp içine aktarmak ve çamaşır arabellek 1,5 mL son hacim için ekleyin.
    Not: Toplam cep telefonu numarasını ve çamaşır arabellek hacmi analizi (3 x 105 için her FACS polistren tüp 100 µL hücreleri) için kullanılan seçili işaretçileri sayısına bağlıdır.
  7. 12 farklı FACS polistren tüpler hücresel süspansiyon, 100 µL dağıtmak ve ürün veri sayfasında belirtilen konsantrasyon spesifik antikor ekleyin.
    Not: C-MSC karakterizasyonu için kullanılan antikor CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 ve HLA-DR (Tablo 1) dir. Resuspended hücre sinyal özgüllük kontrol etmek izotip kontrol ile lekeli 100 µL oluşan bir denetimi örneğini hazırlamak önemlidir.
  8. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık örnekleri kuluçkaya.
  9. 1 mL steril çamaşır arabelleği reaksiyonu durdurmak için her tüpün ekleyin.
  10. 400 x g 10 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi
  11. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 250 µL, arabellek yıkama resuspend.
  12. C-MSC karakterizasyonu Akış Sitometresi ile devam edin.

5. Adipojenik kardiyak Mezenkimal Stromal hücre farklılaşma

Not: Başlamadan önce T. ADIPO orta ve ORO çalışma çözüm hazırladık emin olun.

  1. Kültür T. ADIPO orta
    1. Bağlantısını kesin ve 3 bölümde açıklandığı gibi hücreleri saymak.
    2. Plaka 3 x 105 hücreleri bir steril 6-iyi doku kültürü her şey üzerine 2 mL T. ADIPO orta plaka tedavi.
    3. C-MSC orta her 2-3 gün değişen T. ADIPO orta 72 h için ya da 1 hafta, ayırt izin.
  2. Kırmızı O petrol boyama
    Not:     kullanım petrol kırmızı O (ORO) lipid birikimi C-MSC içinde test etmek için boyama.
    1. 6-iyi doku kültürü plateunder duman hood yerleştirin.
    2. Adipojenik orta kaldırmak ve hücreleri iki kez PBS 2 mL ile yıkayın.
    3. %4 paraformaldehyde (PFA) her karşılamak için yeterli hacim eklemek de. RT, 5 min için hücreleri tamir
    4. İngiltere'de yılın atın ve hücreleri iki kez PBS 2 mL ile yıkayın.
    5. ORO çalışma çözüm yeterli hacim her kullanacak RT, 1 h için sabit hücrelerle kuluçkaya de.
      Not: 6-iyi doku kültürü plaka duman başlık altında ORO kuluçka sırasında ORO çalışma çözüm buharlaşma önlemek için tutmak değil.
    6. Tüm ORO çalışma çözümü kaldırmak ve PBS 3 - 2 mL ile plaka tamamen temizlenir kadar 5 kere yıkayın; atma yıkar. Yıkama ve kullanılan PBS açık ne zaman mikroskop, hücreleri boyama belirsiz altında görmüyorum durdurmak.
    7. 20 X büyütme ters doku kültürü faz kontrast mikroskop kullanarak her şey için 20 görüntülere yakalamak.
    8. Resimler cep ORO birikimi ölçmek için görüntü işleme programı ile açın.
    9. Sadece 255-kırmızı kanal ışıklılık ölçmek için farklı renk kanalları "kanalları Böl" işlev ile ayırın.
    10. Her resim için hücre çekirdekleri sayarak saymak. ORO sinyal yoğunluğu hücre sayısı normale.
    11. Aynı örnek her resmin görüntüleneceği süre elde edilen sonuçları ortalamasını hesaplamak.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak stromal hücre izolasyon: Endomyocardial biyopsi prosedürü C-MSC izolasyonu şekil 1' de özetlenmiştir.

Kardiyak stromal hücreler Mezenkimal karakterizasyonu: Hücresel tedavi (ISCT) için uluslararası toplum tarafından kurulduğu şekilde, onların IMMUNO fenotipik karakterizasyonu3multipotent Mezenkimal stromal hücre tanımlamak için en az kriterleri içermektedir. Özellikle, onların Mezenkimal lineage onaylamak için hücreleri uygun FITC/PE/APC-Birleşik antikorlar ile inkübe ve Akış Sitometresi tarafından analiz. C-MSC karakterizasyonu kullanılan antikor Malzemeler tabloiçinde listelenir.

Şekil 2' de gösterildiği gibi C-MSC biyopsi elde edilen belirli Mezenkimal yüzey antijenleri için CD29, CD44 ve CD105 olumlu. CD90 pozitif hücrelerinin yüzdesi olarak daha önce11rapor değişkendir. Endotel (CD31, CD34), monosit/makrofaj (CD14), hematopoetik (CD45) işaretleri ve MHC kompleksi (HLA-DR) değildir (Şekil 2) ifade.

Kardiyak Mezenkimal stromal hücre Adipojenik farklılaşma: Onların Adipojenik farklılaşma sormak için C-MSC ACM ve HC etkilenen hastalardan elde edilen T. ADIPO ortamda kültürlü olmak zorunda (çözümler bölümüne bakın). Hücreleri 72 h veya 1 hafta, haftada iki kez orta yerine Kültür sürdürülür.

Hücre içi lipid damlacıkları birikimi (şekil 3) Boyama ORO tarafından olduğunu göstermiştir. ACM ve HC elde hücreleri arasındaki farklar yeteneği yanı sıra farklılaşma, derecesini görülebilmektedir. Temsilcisi Albümdeki gösterildiği gibi ACM C-MSC daha fazla lipid damlacıkları HC C-MSC daha sonra kültür Adipojenik orta (şekil 3) 72 h birikir. Hücreleri Adipojenik farklılaşma koşullarına (1 hafta) (şekil 3) daha uzun bir süre maruz kaldığında bu farklılıklar da tutulur.

figure-results-1
Video 1: Electroanatomical harita ve İntrakardiyak Ekokardiyografi entegrasyon. Endocardial tek kutuplu electroanatomical sağ ventrikül (sol anterior oblik ve sağ anterior oblik kez) endomyocardial biyopsi (alt panelleri) uğrar bir hastada eşleştirir. Alçak gerilim (kırmızı/yeşil) sınırlı alanlarda apex görülebilir. Endomyocardial bioptic örnekleri (Daire olarak etiketli) yazışmalarda hastalıklı Miyokardiyum ve interventricular septum toplanır. Gerçek zamanlı İntrakardiyak Ekokardiyografi hedef alan (üst paneli), bioptome doğru konumunu kontrol sağlar. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

figure-results-2
Video 2: sağ anterior oblik görünümü videoda floroskop. Bioptome uzun deflectable bir kılıf ile eklenen ve ventrikül gelişmiş. Miyokardiyum bioptome kişiyle dikkatli kontrol sonra çeneleri açılır ve örnek toplamak için sıkıca kapalı. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

figure-results-3
Resim 1: yordam taslak. Endomyocardial bioptic örnek bir bioptome kateter, bir küçük kıskaç şeklinde kesme aleti kullanılarak toplanır. Elde edilen biyopsi yaklaşık 5 mg(a)ağırlığıdır. Endomyocardial bioptic örnek steril makasla (B), 0,5 - 1 mm3 parçaları, kıyılmış ve collagenase çözüm eklenir. Örnek 37 ° C kuluçka sindirim (C) 1,5 saat için dönen bir platform Mikser üzerinde yer alıyor. Sindirilir çözüm centrifuged ve br plastik tabak (D) kaplama. C-MSC plastik yapışma özelliklerini tek hücreler veya klonlar veya küçük sindirilmemiş bioptic parçalar (E) çimlenme sayesinde elde edilir. C-MSC sonra Akış Sitometresi (F) tarafından karakterize. C-MSC Adipojenik ortamda kaplama ve lipid damlacık birikimi petrol kırmızı (G) Boyama O tarafından test edilir. Ölçek Çubuklarõn 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Resim 2: C-MSC temsilcisi cyto-fluorimetric profili. Her çubuk grafik vs floresan yoğunluğu hücre sayısı belirtilen kanalda gösterir (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: floresein-isothyocyanate). Her grafikte izotip kontrol (beyaz) ve bir örnek ile belirli hücre Birleşik yüzey marker antikor (kırmızı) gösterilir. C-MSC onlar CD31, CD34 CD14 CD45 ve HLA-Dr ifade değil, ancak olumlu Mezenkimal yüzey antijenleri CD29, CD44, CD105 ve için kısmen, CD90, Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 3: C-MSC Adipojenik farklılaşma. ACM ve HC C-MSC, Adipojenik orta 72 h ve 1 hafta, kültürlü temsilcisi görüntülerini lekeli ORO ile (sol resimler; n = 3). Doğru grafiklerde miktar 255-kırmızı kanal boyama parlaklık bildirilmektedir: yoğunluğu rasgele birimleri (yapıyordum) cinsinden ifade edilir. ACM C-MSC denetimlerden daha daha fazla lipid damlacıkları birikir. Öğrenci T-testi kullanılmıştır, *: p < 0,05. Ölçek Çubuklarõn 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC ve C-MSC: MSC multipotent hücreler kemik iliği, yağ dokusu, kıkırdak, beyin, Cilt, fetal ekleri ve kalp12gibi farklı yetişkin doku stromal kısmını ikamet vardır. Farklı çalışmalar yalıtmak ve onları potansiyel uygulamalar temel ve translasyonel araştırma12,13için karakterize için gerçekleştirilmiş.

Sağlıklı koşullarda, MSC deneniyor, kendi kendini yenileyerek düşük oranları14. Bu yana çevre patolojik değişikliklere maruz kalır, onlar teşvik doku remodeling doğrudan transdifferentiation, matris ifade veya parakrin etki14ile tepki.

Kardiyak MSC (C-MSC) kalp4büyük sigara myocyte hücre nüfusu temsil eder. Onlar epicardium kaynaklanan ve epitel-için-Mezenkimal geçiş15süreci geçiren Miyokardiyum geçirilir. Onlar kalp yapısı, hem fizyolojik ve patolojik devletlerin, cardiomyocytes ve hücre dışı matriks homeostazı7,16ile etkileşimleri aracılığıyla mekanik ve elektrik bütünlüğünü katkıda bulunur. Ancak, geniş Aralık C-MSC işlevleri hala tamamen anladım. Hem fizyolojik ve patolojik koşullarda vitro çalışmalar tarafından kolaylaştırılabilir kendi rolünün daha derin bir bilgi onların yalıtım sonra gerçekleştirilen.

C-MSC Atriyal apendiks2,17 ve sağ ventrikül18gibi insan kalbinin farklı bölgelerinden gelen elde.

Son zamanlarda, C-MSC insan sağ ventrikül endomyocardial bioptic örneklerinden elde edilen8, kaynak doku 3-5 mg kadar az olabilir gösteren.

Olası uygulamaları: Bu el yazması özetlenen yöntemi sindirim ve seçim için plastik bağlılık, gibi birkaç basit pasajlar içeren hücrelerin çok küçük kalp örnekler almak sağlanır.

Çünkü onlar vitrokorumak ve yükseltmek kolay ve Mezenkimal silsilesi (endotel, osteocytes ve adipositler) hücrelere ayırt edebiliyoruz C-MSC hücre modeli, kabul edilebilir. Ayrıca, hücreleri doğrudan hastalardan elde etme olasılığını büyük vitro aracı kişiselleştirilmiş/hassas tıp bağlamında mekanik araştırmalar oluşturmaktadır. Nitekim, bu hücreler genetik arka plan ve bağış sonunda belirli mutasyonlar taşımak ve klinik durumlar, yaş, cinsiyet, yaşam tarzı ve tedaviler gibi belirli hastaların özellikleri tarafından etkilenmektedir. Ayrıca, onları farklı işaretler için sıralama olasılığı belirli C-MSC alt kümeleri19çalışma izin verebilir.

C-MSC çoğunlukla olumsuz kalbinde remodeling tarafından karakterize farklı kardiyovasküler hastalıklardaki aktif oyuncu olmak için bilinir. Bu nedenle, temsil ettikleri kalp hastalıkları8,20karşı koymak yeni tedavi stratejileri için aday hedefler.

C-MSC kök benzeri özellikleri ve onların eksikliği önemli immünojenisite potansiyel başvurularının hücre-kardiyak rejeneratif tıp tedavisi öneriyor. Nitekim, kemik iliği veya diğer kaynaklardan MSC gibi C-MSC potansiyel olarak hem de Otolog donör ve alıcı21gerek kalmadan allojenik ayarları kullanılabilir.

Ayrıca, C-MSC doğrudan kalp dokusundan izole, kalp mikro-çevre ve epigenetik profil tarafından preconditioned avantajı var. Kardiyak rejeneratif tıp bağlamında, bu başarılı sonuçlar elde etmek özellikle önemli olabilir.

Bugüne kadar C-MSC ve onların parakrin etkinlik18,22,23yararlı tedavi potansiyeli rejeneratif tıp preklinik çalışmaları tespit. Önemlisi, hücre kaynak kalp olduğu klinik cardiosfere elde edilen hücreleri veya C-MSC13,24,25altgrupları etmektedir. Ancak, kemik iliği türevi MSC gelince farklı protokolleri klinik sınıf C-MSC26elde etmek gerekli olabilir.

C-MSC ACM içinde: Sunulan iletişim kuralı çoğunlukla bir endocardial biyopsi gösteren patolojiler çalışma için uygundur. ACM hastalar bioptic yordamlar tanılma27için tabi. Onların Miyokardiyum yavaş yavaş yara-dokusu, adipositler ve fibrozis oluşan elektriksel olarak inert bir doku ile değiştirilecektir. Bioptic örnekleme tanılama verim maksimal nerede, yara alan için rehberlik için kullanılan10,28,29endomyocardial eşleştirme yapılır. Bu protokol için kullanılan örnekleri hastalıklı Miyokardiyum sınır bölgesi alınır.

Sommariva ve ark. son zamanlarda bir rol C-MSC, ACM8C-MSC olduğunu aktif oyuncular ACM kalp adipogenesis, preadipocytes bu Hearts Mezenkimal kökenli olduğundan gösteren, patogenezinde tanımlamıştır. Ayrıca, mevcut iletişim kuralından denetimlerden daha lipid birikimi ve adipogenesis daha fazla eğilimi gösterdi ACM hastaların biyopsi ile C-MSC izole. Bu nedenle, bu hücreler ACM, mekanik çalışmalar9hücre model olarak uygunluk ispat moleküler mekanizmaları bazıları onaylamak için kullanılabilir.

Sınırlamalar ve kritik adımlar: C-MSC doğrudan (paragraf "Olası uygulamaları" bakınız) hastalardan alma avantajları rağmen bu iletişim kuralı için farklı sınırlamalar tabi tutulur.

İlk olarak, kardiyak bioptic invaziv bir yöntemdir ve sık sık Eğer kesinlikle gerekli kaçınılmalıdır. Nitekim, kalp doku örnekleme etik ve teknik olarak sorunlu olduğunu. Kardiyak biyopsi performans nedenleri kardiyomiyopatiler bağlamında kesin bir tanı ulaşılmasına kalp nakli durumunu izlemek veya bir kalp tümörü30varlığı ascertaining ayırıcı tanı içinde olabilir. Bu nedenle, yalnızca bir endomyocardial biyopsi fikir birliği deyim31 tarafından gösteren hastalar C-MSC araştırma kayıtlı. Ayrıca, kardiyak bioptic yordamı klinik komplikasyonlar, her şeyden önce cardiomyopathic kalbimizde olabilir. Bu nedenle, electrophysiologist'ın dağıtımları her zaman dikkatli ve bioptic örnekleri çok küçük, hücre izolasyon ödün olabilir. Gelecekteki deneyler bu sorunu collagenase konsantrasyon ayarlama veya zamanlama sindirim tarafından üstesinden gelebilir.

C-MSC, tüm birincil insan hücreleri, tüm fenotipleri farklı konular arasında yüksek bir değişkenlik gösterir. Nitekim, farklı konularda hücrelerden sadece genetik olarak farklı, ama aynı zamanda tabi için değişken çevre Klima bulunmaktadır. Özellikle, bu deney içinde yüksek bir değişkenlik hücre izolasyon, büyüme ve Adipojenik ayrımında görülmektedir.

Kritik adımlar mevcut Protokolü kabul var. Bioptic örnek kılcal içeriyorsa, C-MSC kültür kontamine ve FACS analizi (pozitif CD31 için) tarafından kanıtlanan endotel hücreleri, paralel yalıtım önlemek için kaldırılmalıdır. Bir verimli Adipojenik farklılaşma elde etmek için hücrelerin bir aktif büyüme aşamasında olması gerekir. İzdiham derecesini de lipid birikimi etkileyebilir.

Yönteminin önemi: Yalıtım Mezenkimal stromal hücre önceki yöntemleri ile ilgili olarak, bu ilk kez nerede C-MSC elde doğrudan doğruya--dan insan ventrikül bioptic örnekleri açıklaması ayrıntılı olarak teklif edilir. Bu yöntem ACM hasta numuneleri işlenmesi için önerilmektedir, potansiyel olarak kardiyak biyopsi gösteren tüm hastalar için uygun olsa da.

Bu iletişim kuralını temsil eden önceki yöntemlerden daha büyük kalp örnekleri32, gerekli kez toplamak zor olan hücrelerinin elde için yararlı bir uygulama.

Ayrıca, ilginç bir yenilik örnek kaynağını oluşturmaktadır. Ventrikül biyopsi genellikle septum33' te gerçekleştirilir, bu iletişim kuralı sağ ventrikül ücretsiz duvarından elde edilen hesap örnekleri içine alır. Hücreler hastalıklı sağ ventrikül semtinden türetilmiş RV ilgili hastalıkların patolojik durum daha temsilci olabilir

Buna ek olarak, bazı mevcut protokolünde kullanılan reaktifler diğer C-MSC yalıtım ve ayırt etme yöntemleri32ile ilgili farklı vardır. Örneğin, bu el yazması önerilen collagenase türü bir karışımıdır sınıf ı ve sınıf II collagenases proteolitik aktivite dengeli oranında. Ayrıca, sindirim çözüm izole C-MSC gelecekteki büyüme koşullarına uyum sağlayan C-MSC kültür ortamının hazırlanması için kullanılan aynı Bazal orta (IMDM) çözünmüş collagenase karışımı oluşur.

Ayrıca, yordamlar sıralama tüm C-MSC nüfus kullanarak hücre toplu iş standartlaştırmak ama sadece bu hücreler plastik yapışma özelliği aracılığıyla izole, immunophenotypic değiştirmeden bir basitleştirme kabul ettiğiniz anlamına gelir C-MSC özellikleri. T. ADIPO bu el yazması önerilen bileşimi Adipojenik farklılaşma, metabolik bozukluk insülin gibi diğer bileşenler tarafından indüklenen kaçınarak yol yapabiliyor.

Ayrıca, ORO Renkölçer yoğunluğu değerlendirmesine dayanarak, lipid birikimi miktar önerilen yöntem yalnızca yüzde tabanlı yöntemleri ile karşılaştırıldığında Eğer birikmiş yağlar, miktarı ile ilgili daha fazla bilgi sağlar hücreleri ORO boyama için olumlu. Sık sık lipid birikimi sayısal ORO ayıklayarak hücreleri isopropanol ve onun Absorbans ölçme tarafından dahil. Ancak, bu yöntem daha fazla geçişleri gerektirir ve değişkenlik isopropanol buharlaşma nedeniyle tabi tutulur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser İtalyanca Ricerca Corrente Centro Cardiologico Monzino-IRCCS için Sağlık Bakanlığı tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
IMDMGibco 
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichF2442
PANİSILIN STREPTOMISINYaşam Teknolojileri İtalya15140122
Kollajenaz NB4Serva17454.02
Temel fibroblast büyüme faktörüPeprotech100-18B
L-glutaminSigma-AldrichG7513
PBSLonza17-516F
Tryple select 1X (hücre ayrışma reaktifi)Gibco12563029
EDTASigma-AldrichEDS
Tripsin-EDTA çözeltisi Sigma-AldrichT6689
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA2058
3-İzobutil-1-metilksantinSigma-AldrichI5879
HidrokortizonSigma-AldrichH4001
İndometasinSigma-AldrichI7378
YağKırmızı O Sigma-AldrichO0625
İzopropanolSigma-AldrichI9516
Paraformaldehit (PFA) Çözeltisi% 4 PBSDBA Italia Srl'desc-281692
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich276855
Antikoru CD14-FITC (Mφ P9)Becton Dickinson345784
Antikor İntegrin ve beta; 1 (CD29)-PE (klon MAR4)Becton Dickinson561795
Antikoru PECAM-1 (CD31)- APC  (klon 9G11)Ar-Ge D SystemsFAB3567A
Antikoru Hematopoetik progenitör hücre antijeni (CD34)-APC (klon 581)Thermo Fisher Scientific CD34-581-05
Antikor H-CAM (CD44)-PE  (klon G44-26)Becton Dickinson561858
Antikoru L-CA (CD45)-APC (klon HI30)Thermo Fisher ScientificMHCD4505-4
Antikoru THY1 (CD90)-FITC (klon 5E10)Becton Dickinson561969
Antikoru Endoglin (CD105)-APC (klon 266)Becton Dickinson562408
Antikoru HLA-DR-FITC (klon L243)Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizatörGima 35642
Tezgah santrifüjü Sigma 3-16KSigma Santrifüjleri10330
Mr. Frosty Dondurma KabıThermo Fisher Scientific 5100-0001
AxioVert 200M mikroskobu ZeissB 40-080 e 03/01
FACS Gallios BeckmanCoulter 773231AF
ImageJ (görüntü işleme programı)NIH
Stericup filtre üniteleriMerck S.P.A. 
Konik Tüpler, 50 mLEppendorf30122178
Konik Tüpler, 15 mLEppendorf30122151
Güvenli Kilitli Tüpler, 2 mLEppendorf30120094
100 mm TC İşlemli Hücre Kültürü KabıCorning430167
6 kuyulu TC ile İşlem Görmüş Çok Kuyulu PlakalarCorning3516
Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüpler, 5 mLBD Falcon352058
MARKA  sayma odası BLAUBRAND Bü rker-Tü rkSigma-AldrichBR719520
Life Technologies tarafından 12440053SCGPU05RE 60 mm TC İşlemli Hücre Kültürü Kabı Corning 430166

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
  2. Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
  3. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  4. Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
  5. Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
  6. Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
  7. Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
  8. Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
  9. Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
  10. Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
  11. Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
  12. da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
  13. Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
  14. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  15. Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
  16. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).
  17. Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  18. Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745(2016).
  19. Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
  20. Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
  21. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  22. Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  23. Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513(2011).
  24. Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
  25. Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
  26. Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512(2014).
  27. Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
  28. Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
  29. Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
  30. Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
  31. Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
  32. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
  33. From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S. Current status of endomyocardial biopsy. Mayo Clin Proc. 86 (11), 1095-1102 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endomiyokardiyal BiyopsiKollagenaz SindirimiAk SitometrisiAdipojenik DiferansiyasyonORO BoyamaCD29 CD44 CD105H cre K lt r EkspansiyonuLipit Damlac Birikimi

İlgili makaleler