Yöntem makalesi

Hızlı Nanoprobe sinyal geliştirme içinde in Situ altın nanoparçacık sentezi tarafından

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57297

⸱

7 Mart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Proteomics and Nanobiotechnology, Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, 2Global Research and Development, Thermo Fisher Scientific IDD

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, sinyal enhancement-in nanoprobe tabanlı biosensing için bir protokol sunulmuştur. Protokol chloroauric asit, altın, gümüş, Silis veya demir-oksit nano tanecikleri oluşan mevcut nano-sondalar yüzeyinin azaltılması temel alır.

Özet

Nano-sondalar altın, gümüş, Silis veya algılama reaktifler bioanalytical deneyleri içinde olarak demir-oksit nano tanecikleri gibi kullanımı yüksek hassasiyet ve uygun Renkölçer okuma etkinleştirebilirsiniz. Ancak, nano tanecikleri yüksek yoğunlukları genel algılama için gereklidir. Mevcut geliştirme sentez tabanlı iletişim kuralları ya da altın ve gümüş için sınırlı nano tanecikleri ya da hassas enzimatik kontrol ve en iyi duruma getirme güveniyor. Burada, altın, gümüş, Silis ve demir oksit nano-sondalar Renkölçer okuma geliştirmek için bir protokol mevcut. Renkölçer sinyal tarafından kadar 10000-fold bir faktör geliştirilebilir ki gözlendi. Bu sinyal geliştirme stratejileri kimyasal azaltılması Au3 + Au0temelidir. Au3 + Au0azalma sağlamak çeşitli kimyasal reaksiyonlar vardır. İletişim kuralı ' iyi'nın arabellek ve H2O2 kullanılır ve Au0 varolan nano-sondalar, yeni altın nano tanecikleri oluşumu zararına olarak yüzeyinin birikimi lehine mümkündür. Chloroauric asit ve H2O2 ' 2-(N-morpholino) oluşan bir çözüm ile Mikroarray kuluçka, protokol oluşur nanoprobe tabanlı algılama tahlil takip ethanesulfonic asit pH 6 arabellek. Geliştirme çözüm kağıt ve cam tabanlı sensörler için uygulanabilir. Ayrıca, bu piyasada bulunan uzun bir ticari alerjene Mikroarray yöntemi uygulamaya tarafından gösterildiği gibi kullanılabilir. Sinyal geliştirme az 5 dk, kuluçka ve geliştirme çözüm gerektirir ve okuma çıplak gözle ya da masa üstü tarayıcı veya dijital kamera gibi düşük-uç görüntü edinme aygıtlar tarafından tespit edilebilir.

Giriş

Nanomalzemeler altın nano tanecikleri (AuNPs) veya demir oksit nano tanecikleri (IONPs) gibi kullanımı uygulamaları biosensing içinde geliştirilmiş hassasiyet ve çok yönlülüğü ile izin verdi. Nano tanecikleri ile hacim oranı için yüksek yüzeyini yararlanmak olarak çeşitli ligandlar ve yüzey dekorasyon için geliştirilen yöntemler bolluk etkin 1 sensörler tasarım geliştirilmiş hassasiyet ile. 2 yine de, bir biosensing aracı nano-sondalar algılanabilir sinyal elde etmek için gerekli sayısına bağlıdır. Örneğin, söz konusu olduğunda 40 nm AuNPs UV-VIS spektroskopisi, yaklaşık 90 × 106 nano-sondalar aracılığıyla bir sinyal elde etmek için etkin faiz hedefinin algılamak için gereklidir. 3 bu nanoprobe yoğunluğu sınırlama sinyal amplifikasyon kullanımı ile atlatılabilir. Böyle stratejileri4 interparticle toplama veya Aglomerasyon nerede ilk nano-sondalar yoğunluğu Nano-sondaları ilk üzerine ikinci bir dizi biriken tarafından artırılır, temel alabilir. 5 görsel veya UV-VIS sinyal Alım nano tanecikleri belirli bir yerde bir sensör yüzeyi sayısını arttırmak sağlar. Ancak, testin duyarlılığı nano tanecikleri nano-sondalar başlangıç kümesi doğru ikinci dizi hedefleme kapasiteli doğal olarak bağlanacaktır. Diğer stratejileri altın ve gümüş Nano sondaları boyama güveniyor. 6 , 7 boyama gümüş iyonları görsel veya UV-VIS algılama etkinleştirme nano tanecikleri yüzeyinin azaltılması yoluyla elde edilir. 8 bu yöntemler mevcut altın sinyal geliştirmek veya yüzey rezonans plasmon potentiating tarafından gümüş nano-sondalar, ikincil hedefleme olayları olduğu gibi interparticle Aglomerasyon yöntemleri bağlı değil sinyal. Ancak, gümüş boyama yöntemleri yalnızca altın veya gümüş nano-sondalar kullanımı ile bildirilmiştir. 8 , 9

2005 ' te Zayats ve ark. 10 Au iyonları yüzey plasmon rezonans sinyal artırmak için altın nano-sondalar yüzeyinin azaltılması bildirdi. Bu enzim bağımlı çalışmada, hidrojen peroksit chloroauric asit azalması izin cetyltrimethylammonium klorür birlikte ve glikoz oksidaz kataliz tarafından oluşturuldu.

Son zamanlarda Wang ve ark. altın bir katman nerede üretilen bir geliştirme yöntemi mevcut nano-sondalar yüzeyinde bildirdi. 11 genişlemiş bu nano-sondalar peroksidaz benzeri katalitik aktivitesi substrat 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) parlak mavi renk görselleştirme çıplak gözle etkinleştirme karşı görüntülenir.

Stevens vd. Plazmonik ELISA tabanlı tahlil gelişimi bildirdi. 12 geleneksel ELISA stratejisi aracılığıyla Prostat spesifik antijen (PSA) algılama sonra katalaz ile etiketli bir ikincil antikor sonra sensör hidrojen peroksit içeren bir çözümde dalmış oldu sensör ile inkübe ve chloroauric asit. İkincil katalaz-modified antikor (olumlu sonuç) varlığı hidrojen peroksit, chloroauric asit azaltma yavaşlama ve yarı küresel monodispersed AuNPs kırmızı renk ile verimli tüketimi teşvik etmek. Katalaz-modified antikor (negatif sonuç) yokluğu böylece hızlı chloroauric azaltma teşvik ve AuNPs türleri, kötü tanımlanmış Morfoloji mavi/mor renk için sorumlu ile verimli olduğu gibi kalır için hidrojen peroksit konsantrasyon izin . Konsantrasyon hidrojen peroksit, katalaz, etkinlik tarafından belirlenen faiz analit konsantrasyon için ilişkili olduğu gösterildi. Katalaz-modified ikincil antikor ve katalitik aktivitesi şartları kontrolünü ihtiyacını bu yöntemin evrensellik engel iki etken vardır. Ayrıca, altın kümeleri, varolan AuNPs bağımsız oluşumu güçlendirme stratejisi için arka plan gürültü sorunları neden olabilir.

Yukarıda belirtilen teknikleri de birkaç diğerleri gibi13,14,15, bu mümkün kıldı nanoprobe tabanlı biyosensörler sınırları algılama geleneksel teknikleri ile eşit düzeyde ulaşmak için.

Burada, bir roman altın geliştirme yöntemi gösterilmiştir, nerede bir varolan nanoprobe sinyal güçlendirilmiş potentiating veya bir yüzey plasmon rezonans sinyal tanıtımı. Algılama altın, gümüş, Silis veya demir oksit nano tanecikleri kullanımı ile yapılır sonra sensör bir çözüm hidrojen peroksit ve 2-(N-Morpholino) chloroauric asit karışımı ile kuluçkaya yetkisi olan ethanesulfonic asit (MES) pH 6 arabellek. Geliştirme çözüm bileşenlerinde konsantrasyonları Au0 varolan nano-sondalar yüzeyinde birikimi iyilik için optimize. Tüm için nanoprobe türleri, i.eokudu. AuNPs, gümüş nano tanecikleri (AgNPs), Silis nano tanecikleri (SiNPs) ve IONPs, kötü tanımlanmış bir tabaka oluşumu vermiştir veya algılanabilir veya artan görünür bir sinyal sonuçlanan ışık saçılma artar. Nano-sondalar kağıt ve cam tabanlı microarrays için 100-fold büyütme faktörü bir sinyal artışı elde edildi ve işlemi bir sinyal almak için en az 5 dk sürer. Çıplak gözle, sinyal Alım yapılabilir UV-VIS spektroskopisi veya bir dijital fotoğraf makinesi veya bir masa üstü tarayıcı gibi düşük-uç araçları görüntüleme. Ayrıca, bu geliştirme Protokolü kolayca bir piyasada bulunan Anti teşhis tahlil özel optimizasyonu gerek kalmadan uygulanabilir olduğunu gösterilmiştir.

Protokol

İnsan serum numuneleri koleksiyonu, Yaniülkenin yasal ve etik gereksinimlerine uygun olarak elde edilmiştir. bir Etik Komitesi (veya benzeri) onayı ile ve donörden yazılı izni ile.

1. geliştirme çözüm Hazırlanışı:

  1. 10 mM MES pH 6 arabellek MES askıya tarafından sodyum tuzu deiyonize su hazırlamak. PH 6-4 M NaOH çözüm kullanımı için ayarlayın.
  2. 5 mM HAuCl4 çözüm 10 mM MES pH 6 arabelleği (Çözüm 1) hazırlayın.
  3. 1.027 M H2O2 çözüm 10 mM MES pH 6 arabelleği (Çözüm 2) hazırlayın.
    Not: Çözüm 1 ve çözüm 2 hacimleri var olmak arttırmak için sayı ve microarrays boyutunu bağlıdır. Örneğin, 10 x 10 mm Mikroarray Mikroarray alan geliştirme çözüm ile temas halinde olması için 100 μL Toplam hacim (Çözüm 1 + çözüm 2) gerektirir. Seyreltme sonra H2O2 yaklaşık 30-45 gün içinde kullanılmalıdır.

2. nano tanecikleri Hazırlanışı:

  1. 40 hazırlamak nm Bastús ve arktarafından açıklandığı gibi AuNPs. 16 kısaca, 1 mL sulu 25 mM HAuCl4 habercisi 2.2 mM sodyum sitrat (149 mL) kaynar bir çözüm enjekte. Bir kırmızı şarap rengi görülmektedir kadar bekleyin. Nano tanecikleri bu çözüm olarak tohum tohum-büyüme adımları için kullanın.
  2. 90 ° C'de 60 mM sodyum sitrat 25 mM HAuCl4 tarafından 1 mL solüsyon içeren tohum takip 1 mL enjekte. 30 dakika sonra reaksiyon tamamlandıktan. 40 nm nano tanecikleri elde edilen kadar tohum-büyüme beş kez Bastús ve arktarafından açıklandığı gibi tekrarlayın. 16
  3. UV-VIS Absorbans nano tanecikleri boyutunu belirlemek için nano tanecikleri nihai çözüm ölçmek. 17 alternatif olarak, transmisyon elektron Filmler (TEM) olabilir satın aldı ve nano tanecikleri boyutunu belirlemek için kullanılır.
  4. 90 hazırlamak nm Rivero ve arktarafından açıklandığı gibi AgNPs. 18 kısaca, dimethylaminoborane (DMAB) bir şiddetle karıştırılmış Poli (Akrilik asit, sodyum tuzu), çözüm (PAA) ve AgNO3. Çözüm son hacmi 50 mL ve DMAB, PAA son konsantrasyonu ve AgNO3 are 1.6 mM, 10 mM ve 3.33 mM, anılan sıraya göre.
    Not: karboksil grupları ve 50 ile 100 nm IONPs karboksil grupları ile modifiye SiNPs satın nm.
  5. Puertas ve arktarafından açıklanan protokol sonrası antikor ile AuNPs functionalize. 19 kısaca, COOH-PEG-SH (5000 g·mol– 1) 1 mg 1.2x10-9 M AuNPs bir çözüm eklemek. (10 optik yoğunluk, OD). 4 M NaOH çözeltisi ile 12 pH ayarlayın.
    1. Gecede, oda sıcaklığında (~ 22 ° C), kuluçkaya çözüm hafif karıştırma koşullar altında izin.
    2. PEG fazlalığı 13800 x g 15dk için de çözüm centrifuging tarafından kaldırın.
    3. Pelet 500 μL deiyonize su ile resuspend.
    4. PEG-modified AuNPs N-(3-Dimethylaminopropyl)-n 5 μmol ile kuluçkaya '-ethylcarbodiimide hidroklorid (EDC) ve N-hydroxysulfosuccinimide sodyum tuzu (sulfo-NHS) 10 mM MES pH 6 7,5 μmol arabellek için 37 ° C'de 30 dk
    5. EDC ve sulfo-NHS fazlalığı 13800 x g 5 min için de çözüm centrifuging tarafından kaldırın.
    6. Pelet 10 mM MES pH 6 arabellek 500 µL içinde resuspend ve antikor, 100 g·mL-1 ekleyin. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya çözüm izin
    7. Antikor fazlalığı 13800 x g 10 min için de çözüm iki kez centrifuging tarafından kaldırmak ve Pelet 10 mM sodyum fosfat pH 7.5, 0,3 M NaCl arabellek 500 μL içinde resuspend. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya çözüm izin
    8. İki kere belgili tanımlık eriyik vasıl 13800 x g 10 dk centrifuging tarafından belirsiz ilişkili antikor kaldırın ve % 1 sığır serum albumin (BSA) 500 μL Pelet 10 mM MES pH 6 arabellekte resuspend. 4 ° C'de örnekleri gecede kuluçkaya.
    9. BSA fazlalığı 13800 x g 10 min için de çözüm iki kez centrifuging ve Pelet 10 mM MES pH 6 arabellek 500 μL içinde resuspending yıkama.
    10. EDC ve sulfo-NHS miktarda buna göre ayarlayarak antikor ile SiNPs, 2.5.1 aracılığıyla 2.5.9 5 M AgNPs, 0.5 mg IONPS ve 0.5 mg modifikasyonu için adımları izleyin.

3. dikey akışı deneyleri: kağıda dayalı

  1. Microarrays protein G nitroselüloz kağıt membran üzerinde gradyan bir konsantrasyon robotik bir yazıcı ile yatırma tarafından hazırlayın. Yazdırma işleminden sonra oda sıcaklığında (~ 22 ° C) microarrays kuru gecede izin.
  2. Bir filtre tutucu içine membran ile dikey akışı tahlil taşımak. IgG-modified AuNPs 1 mL·min– 1oranında bir ultra-şırınga pompa kullanarak bir 8 M çözümü akışı. 17 M IgG-modified AgNPs, bir çözüm ile bu işlemi tekrarlayın 0.1 mg·mL– 1 IgG-modified SiNPs ve 0.1 mg·mL– 1 IgG değiştirilme tarihi IONPs.
  3. Microarrays oda sıcaklığında (~ 22 ° C) için 30 dk kuru ve onları Düz Yataklı Tarayıcı 4800 dpi çözünürlükte tarama izin. Resim 24-bit renk TIFF dosyaları olarak kaydedin.

4. başvuru ticari cam tabanlı deneyleri:

  1. İki cam slayt allerjen bileşenler ile oda sıcaklığında 4 farklı insan serum numuneleri algılanması için 120 min için kuluçkaya.
  2. Microarrays deiyonize suyla durulayın.
  3. Incubate bir slayt ile bir floresan Birleşik Anti-insan IgE antikor, oda sıcaklığında (~ 22 ° C) 30 dk. Incubate ikinci slayt ile Anti-insan IgE antikor-AuNPs oda sıcaklığında 30 dakika değiştiren.
  4. Microarrays deiyonize suyla durulayın.
  5. Floresan Anti-insan IgE antikor ile tarama cihazları bir lazer ile inkübe Mikroarray Floresans yoğunluğunu ölçmek. Anti-insanla IgE antikor-modified AuNPs Renkölçer sinyal Alım için bir masa üstü tarayıcı ile inkübe Mikroarray digitalize.
  6. Dijitalleştirme sonra oda sıcaklığında (~ 22 ° C) 5 min için geliştirme çözümü ile Mikroarray kuluçkaya.
  7. Sensör deiyonize suyla durulayın ve (~ 22 ° C) oda sıcaklığında 10 dakika kurumasını bekleyin.
  8. Renkölçer sinyal Alım için 4800 dpi çözünürlükte bir masa üstü tarayıcı ile Mikroarray digitalize. Görüntüleri 16-bit gri tonlamalı TIFF dosyaları kaydedin.

5. Mikroarray kuluçka geliştirme çözümü ile:

  1. Çözüm 1 ve çözüm 2 aynı miktarda önceden mix veya bunları doğrudan sensör yüzeye karıştırın ve Mikroarray üzerinde ilgi alanı çözüm karışımı ile kaplıdır sağlamak.
  2. Let sensör kuluçkaya geliştirme çözümü ile oda sıcaklığında zaman kağıt tabanlı microarrays için özellikle yüksek gürültü/sinyal oranı yanı sıra geliştirilmiş hassasiyetleri için 5 dk. daha uzun kuluçka getirebilecek kadar için.
  3. Deiyonize su 5 için bir kez batış tarafından Mikroarray yıkama s. oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    Not: Kurutma adımının Mikroarray malzeme üzerinde bağlıdır. Kağıt tabanlı Mikroarray için yaklaşık 30 dakika kurutma adım gerektirir. Cam tabanlı Mikroarray için yaklaşık 5-10 dk kurutma adım gerektirir.

6. görüntüleme analizi:

  1. Floresans yoğunluklarda yazılım aracı ile analiz. Eşit veya büyük kullanım (DfU) sensör üreticinin yönergeleri izleyerek 0.3 Isac Standartlaştırma birimleri (ISU), tüm sonuçları göz önünde bulundurun.
  2. Bir yazılım aracı kullanarak Renkölçer yoğunluklarda analiz. Görüntü dosyaları ters çevir, her nokta yoğunluğunu ölçmek ve ortalama piksel yoğunluğu hesaplamak. İneklemek noktalar değerlerini üç ortalama spot piksel yoğunluklarda ortalaması son sinyal değeri hesaplamak için kullanın.

Sonuçlar

Bir tahlil, nano-sondalar algılama Aracısı olarak kullanarak taşıdıktan sonra sensör algılama alanı Nano-sondaları ile (şekil 1bir) doldurulması. Nano-sondalar sayısı görsel algılama için sınırı altında ise, analit tespiti başlangıçta, negatif dikkate. Burada sunulan (şekil 1b) iletişim kuralını kullanarak, nano-sondalar sinyal Au (şekil 1c) kötü tanımlanmış bir tabakanın tanıtarak potentiated.

Protein G tespiti için tasarlanmış bir kağıda dayalı immunoassay etkinliğini geliştirme Protokolü (Şekil 2) vitrin olarak gerçekleştirilmiştir. AuNPs, AgNPs, SiNPs ve IONPs IgG antikorlar ile değiştirilmiş ve kullanılan ve algılama ajanlar. Kağıt microarrays bir degrade Protein G moleküllerin bir sayının nokta var olarak hazırlanmıştır.

Sonra tahlil gerçekleştirildiği, bu gözlenmiştir IgG değiştirilmiş AuNPs (IgG-AuNPs) düşük spot (Şekil 2bir) başına 2 × 105 moleküller olarak tespit etmek mümkün, IgG değiştirilmiş AgNPs (IgG-AgNPs) düşük 2 × 104 olarak tespit etmek mümkün moleküller yer (Şekil 2c) başına IgG modifiye IONPs (IgG-IONPs) SiNPs (IgG-SiNPs) görsel sinyal ( sağlamak mümkün değildi 2 × 107 molekülleri başına spot (Şekil 2e) ve IgG değiştirilme tarihi gibi düşük tespit etmek mümkün Şekil 2g).

Microarrays geliştirme çözümü ile kuluçka tarafından mümkün sinyal ile 100-fold artırmak için kullanılan nano tanecikleri tüm türleri arasındaki. SiNPs söz konusu olduğunda, geliştirme çözüm bu görsel sinyal geliştirme çözüm nerede görülmüştür bir sinyal gözlemlemek mümkün kıldı (Şekil 2b, 2d, 2f ve 2 h).

Varolan bir ticari immunoassay yönteminin uygulamaya olasılığı değerlendirilmiştir. Geliştirme bir cam tabanlı alerjen bileşen Mikroarray immunoassay gerçekleştirilmiştir. Doğrulanmış ve serum örnekleri Alerjik hastalardan Mikroarray ile değerlendirilmiştir karakterize 4 kümesi (örnekleri belirlenmiş a, b, c ve d). Bu tahlil standart Fluorometrik tespiti ile anti-IgE sinyal (şekil 3) geliştirme tarafından takip AuNPs etiketli boyama için karşılaştırıldı. Önce geliştirme, nereye belgili tanımlık hafiye anti-IgE AuNPs etiketli gerçekleştirildiği microarrays üzerinde hiçbir noktalar tespit edildi. Geliştirme sonra birkaç noktalar çıplak gözle görünür ve onların yoğunluğu görüntü dijitalleştirme (şekil 3) tarafından tescil edildi. Floresans algılama ile çeşitli yerlerinden edildi (şekil 3) tespit edildi.

figure-results-1
Resim 1 . Belgili tanımlık merdiven çizimi bir mikrospot için gelişmiş sinyal analit algılama uğrar. (bir) antikor-modified iki nano-sondalar sonra bir mikrospot, Mikroarray geliştirme iletişim kuralı ile (b) kuluçka ve antikor-modified nano-sondalar ve (sonraki tohum büyüme immobilize bir analit tespiti c) mikrospot nerede nano-sondalar boyutunu geliştirme çözümü ile 5 dk kuluçka sonra arttı. Bu rakam dapted Dias ve arkgelen olmuştur. 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2 . Microarrays protein G. tespiti için elinizde görüntü Geliştirme (birile) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) yürütülen algılama önce gözlemlenen mikrospots her Mikroarray sol tarafta olan IgG-IONPs ve (g) IgG-SiNPs. Her Mikroarray sağ tarafta mikrospots (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) geliştirme sonra olan IgG-IONPs ve (h) IgG-SiNPs. Her konsantrasyonu protein G Mikroarray nüsha olarak yatırılır. Bir hesaplama protein konsantrasyonu dayalı G yapıldı protein miktarının her mikrospot basılmış. Bu rakam Dias ve arkadapte edilmiş. 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 . Floresan yoğunluğu ve deneyleri için elde edilen Renkölçer yoğunluğu arasında korelasyon ticari anti teşhis tahlil ile yürütülen. Floresan yoğunluğu (MFI) demek ve kolorimetrik yoğunluğu (MCI) örneklerinde a, b, alerjenler tespiti için ölçülen demek c ve ö. Insets günlük 10 dönüştürülmüş verileri aralıklarla nerede her iki yöntem arasında doğrusal bir ilişki gözlendi. Fluorophore-modified antikor üzerinde (Fluorophore-Ab) tabanlı algılama için gözlenen mikrospots yoğunluğunu Floresans emisyon var. Ab-AuNPs tahlil dayalı algılama için gözlenen mikrospots parlaklığını Mikroarray dijitalleştirecek ve görüntüleme yazılımı ile görüntü ters çevirme sonra elde edildi. Microarrays aşırı sağ altta dikey triplicates floresan algılama için olumlu denetimleriyle sahip olarak tasarlanmıştır. Diğer üç köşe yazılım değerlendirme için kullanılır. Resim 16-bit gri tonlamalı olarak analiz edildi. Bu rakam Dias ve arkadapte edilmiş. 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

R2 önceki geliştirmeR2 ' den sonra geliştirme
IgG-AuNPs8.70E-017.80E-01
IgG-AgNPs9.10E-019.60E-01
IgG-IONPs9.17E-019.30E-01
IgG-SiNPs-8.50E-01

Tablo 1. R2 değerleri için algılama protein G, önce ve sonra nano tanecikleri farklı kümeleri kullanarak geliştirme,. Noktalar yoğunluğunu analit konsantrasyon ile korele ölçülen sonra R2 değerleri elde edilmiştir.

Tartışma

Şu anda, sinyal geliştirme teknikleri nanoprobe tabanlı algılama ile deneyleri için her iki enzim tabanlı12, nano tanecikleri hedef algılama nano-sondalar21 için ikinci bir set gerektirir ya da teknikleri boyama durumunda için sınırlıdır AuNPs veya AgNPs algılama probları olarak kullanın. 22 burada, nanoprobe algılama tabanlı deneyleri sinyal geliştirme için basit, hızlı ve enzim ücretsiz yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemle, nano-sondalar 4 türleri tarafından sağlanan Renkölçer sinyal artırmak mümkün: AuNPs, AgNPs, IONPs ve SiNPs.

Nano-sondalar kümelerine gözlenen amplifikasyon faktör, 100-fold, nerede miktar geliştirme faktörünün ön geliştirme sinyalleri eksikliği nedeniyle mümkün değildi SiNPs dışında oldu. Bu geliştirme faktör protokolünün etkinliği nano-sondalar tüm türleri arasında benzer olduğunu göstermektedir. Ayrıca, geliştirme Protokolü nerede bir hisse senedi AuNPs süspansiyon seyreltme dizi yazdırıldığı kağıt desteğinin üzerinde gerçekleştirildiği zaman 10000-fold büyütme faktörü gözlendi. Geliştirme, AuNPs numarası en düşük görünür lekeler için önceki nerede yaklaşık 10000 nano tanecikleri basıldı, geliştirme sonra az 10 nano tanecikleri yataklık noktalar görünür haline geldi vardı. 20

Burada sunulan geliştirme protokolü için kurulan koşulları azaltılması Au3 + sinyal arka plan gürültü minimuma koruyarak geliştirmek için Au0 yararlanarak sağladı. Şu tahlil için ilâ saklanan microarrays birkaç ay sonra tahlil gerçekleştirildi yanı sıra gerçekleştirildikten sonra geliştirme gerçekleştirilebilir. Geliştirme çözüm çözüm 1 ve çözüm 2 1:1 karışımından oluşur. Her iki çözüm de daha önce karışık veya doğrudan Mikroarray pipetted zaman karışık. Ön karıştırma veya doğrudan karıştırma arasındaki fark sadece raf ömrü geliştirme çözüm etkiler. Ne zaman öncesi karışık raf ömrü 5-7 gün 30-45 gün için değil artırma Pre karıştırılır.

Daha fazla çözümleme sonuçları geliştirme yöntemi Biyoalgılayıcı kantitatif analiz ile müdahale değil göstermiştir. Gözlenen yoğunluğu ve analit konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki (Tablo 1) devam edildi. Standart floresan algılama ve kolorimetrik algılama ile cam tabanlı alerjen bileşen Mikroarray immunoassay kullanma 4 önceden karakterize klinik örnekleri için elde edilen veriler iki algılama yöntemleri arasında iyi bir uyum gösterdi. Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) ve ortalama Renkölçer yoğunluğu (MCI), bir ortalama R2 karşılaştırma = 0,08 +/-0,79 elde edilen verileri 10 günlük her iki eksen üzerinde olduğunda. Bu deney nano-sondalar için algılama kullanıyorsa veya nanoprobe tabanlı algılama için adapte edilebilir geliştirme yöntemi için ticari bir kit uygulanabilir gösterdi.

Geliştirme yöntemi etkinliği iki kritik yönü üzerinde dayanır. Bu çözüm 1 karışımı sağlamak önemlidir ve homojen 2 çözümüdür. Homojen bir karışım sensör çözüm 1 veya 2 diğer göre baskın nerede geliştirme çözüm kesirler ile temas halinde olacak. Bu Au3 + Au0böylece geliştirme verimliliğini zarar, azaltılması verimliliği azaltır. Kuluçka döneminde Mikroarray geliştirme çözüm temas ilgi tüm alanı önemlidir.

Bir sinyal vericiyi geliştirme elde etmek için geliştirme çözüm ile daha uzun bir kuluçka süre (yaklaşık 5 dk) gerekli olacaktır. Sinyal satın alma ile etkileyebilir arka plan gürültü gelişimi önlemek için Mikroarray yüzey (belirsiz birikimi hızlı bir altın Au0 ve bunun neticesi olan oluşumunu önlemek için önceden blokeörneğin BSA, PEG) olmalıdır katman.

Tahlil içsel etkinliğini geliştirme yöntemi için bir kısıtlamadır. Tahlil sinyal geliştirme gözlenen sağlamak için negatif ve pozitif denetimleri sahip gerçek pozitif sonuçlarına bağlanabilir gerektirir. Nano-sondalar bir non-spesifik etkileşim ile hedef ise, geliştirme geçerli olmayacaktır sonra sinyalleri satın aldı.

Diğer geliştirme teknikleri temel alınarak ya nanopartikül toplama veya geliştirilmiş sinyal Alım sağlar bir malzeme ile nano tanecikleri boyama. Nano tanecikleri algılama sitesinde sayısını toplanması teşvik ederek, sinyal Alım ya da görsel olarak mümkün olacaktır veya UV-VIS ölçümleri. 5 bu sinyal geliştirme teknikleri bir iki adım algılama sistemi, faiz ve nerede muhabir ilk algılama yapı bağlamak için gereken ikinci bir adım analit ilk tespiti güveniyor. Bu stratejileri evrensellik tahlil her türü için belirli geliştirme protokolü en iyi duruma getirme gereksinimi nedeniyle eksikliği.

Boyama, çok burada sunulan, protokolü gibi gümüş gibi boyama geliştirme teknikleri sinyal algılama yapıları, doğrudan geliştirme sağlar. Ancak, burada gösterilen protokolü farklı olarak, gümüş boyama sadece ya AuNPs ya da AgNPs uygulanmak üzere gösterilmiştir. 6 , 7 , 8 , 9

Bu yöntem uygulanabilirliği büyük olasılıkla AuNPs, AgNPs, IONPs veya SiNPs algılama aracıları kullanan herhangi bir tahlil yayılan. Diğer malzemelerden oluşan sensörler yönteminde uygulanması çalışmaya daha fazla çalışma yürütülmektedir.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında finansman / ERC hibe sözleşmesi No 615458, İsveçli Araştırma Konseyi ve Pronova mükemmellik merkezi için protein teknolojisi (VINNOVA - İsveç Hükümet ajansı yenilik sistemleri için) minnetle kabul edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kloroaurik asitSigma-Aldrich254169 ALDRICH
Sodyum sitratSigma-AldrichS4641 SIGMA-ALDRICH
Dimetilaminoboran ve nbsp;Sigma-Aldrich476668 ALDRICH
Poly (akrilik asit, sodyum tuzu)  Sigma-Aldrich416037 ALDRICH
Gümüş nitratSigma-Aldrich204390 ALDRICH
100 nm manyetik nanopartiküllerAdemtech021111
50 nm silika nanopartiküllerCorposcular140510-10
COOH-PEG-SH RAPP Polimer135000-4-32
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich1.06462 & nbsp; EMD MİLLİPOR
N- (3-Dimetilaminopropil) -N'-etilkarbodiimid hidroklorürSigma-Aldrich03449 & nbsp; SIGMA
N-Hidroksisülfosüksinimid sodyum tuzu Sigma-Aldrich56485  ALDRICH
Hidrojen peroksit çözeltisiSigma-Aldrich95313 SIGMA-ALDRICH
2- (N-Morfolino) etansülfonik asit hidratSigma-AldrichM8250 SIGMA
IgG antikoruAbcam
Sodyum fosfat ve nbsp;Sigma-Aldrich342483  ALDRICH
Sodyum klorürSigma-AldrichS7653  SIGMA-ALDRICH
Sığır serum albümüVWR 422351S
Protein GThermo Scientific21193
Nitroselüloz kağıt membranWhatman10402096
Nanoplotter 2.1 robotik yazıcıGeSIM
Filtre tutucuMerckXX3001200
PhD2000 Ultrasyring pompasıHarvard
Düz yataklı tarayıcı CannonScan 9000F Mark IICannon
Anti-insan IgE antikoru modifiye edilmiş AuNPs Thermofisher
Lazer tarama LuxScan 10/KCapital Bio
Masaüstü tarayıcı Görüntü Tarayıcı Epson Expression 1600 proEpson
Cam slayt ImmunoCAP ISAC sIgE 112Thermofisher81-1011-01
Floresan konjuge anti-insan IgE antikoru Thermofisher81-1011-01
Phadia Mikroarray Görüntü Analiz Cihazı MIA 1.2.4 Termo Balıkçı

Kaynaklar

  1. Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1(2014).
  2. Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48(2014).
  3. Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
  4. Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
  5. Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
  6. Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
  7. Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
  8. Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
  9. Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
  10. Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
  11. Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
  12. de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
  13. Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
  14. Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
  15. Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
  16. Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  17. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  18. Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101(2013).
  19. Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
  20. Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837(2017).
  21. Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
  22. Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Nanopartikül Sinyal GüçlendirmeKolorimetrik Okuma GüçlendirmeKloroaurik Asit UygulamasıHidrojen Peroksit ReaksiyonuMES Tamponu İnkübasyonuKağıt Cam Sensörlerİmmünassay Sinyal AmplifikasyonuNanoprob Tespit YöntemiSinyal Güçlendirme Protokolü
Hızlı Nanoprobe sinyal geliştirme içinde in Situ altın nanoparçacık sentezi tarafından
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.