JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Published: May 06, 2018
doi:
10.3791/57322
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Abstract

Biyofilm oluşumu bakteri sert çevre koşulları veya stresli zamanlarda altında oluşan dinamik, çok aşamalı bir süreçtir. Enterik patojenler için önemli stres tepkisi gastrointestinal transit sırasında ve safra maruz, insan sindirim normal bir bileşeni üzerine indüklenen. Safra bakteri yok edici etkilerini aşmak için birçok enterik patojenler ince bağırsak transit zaman hayatta kalma izni olan bir biyofilm oluştururlar. Burada metodolojileri biyofilm oluşumu katı fazlı bağlılık deneyleri gibi hücre dışı polimer madde (EPS) matris algılama ve görselleştirme ile tanımlamak için mevcut. Ayrıca, biyofilm dağılım değerlendirme serbest bırakmak-in bakteri enfeksiyonu işlemi sırasında tetikleme olayları analiz taklit etmek için sunulmaktadır. Kristal violet boyama bir yüksek-den geçerek 96-şey plaka bağlılık tahlil yapisan bakteri tespit etmek için kullanılır. EPS üretim değerlendirme iki deneyleri tarafından belirlenir Yani mikroskobu EPS matris ve yarı kantitatif analiz fluorescently Birleşik polisakkarit bağlayıcı lektin ile boyama. Son olarak, biyofilm dağılım koloni sayıları ve kaplama ile ölçülür. Birden çok testleri pozitif verilerden biyofilmler karakterizasyonu destek ve diğer bakteri suşları safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu tanımlamak için kullanılabilir.

Introduction

Biyofilm oluşumu sırasında sert çevre koşullarına bağlı bir önemli bakteriyel hayatta kalma stratejisidir. Bakteri yok edici bileşikler maruz gibi antibiyotikler veya besin değişimler ya da oksijen durumu biyofilm oluşumu ile hafifletti bakteri stresli bir durumda neden olmaktadır. Bir biyofilm bakteri eki bir yüzey veya diğer bakteri ile karakterizedir ve öncelikle polisakkaritler1,2,3oluşan bir EPS matris salgı tarafından eşlik eder. Biyofilm oluşumu olayları bir çağlayan bir olgun yapisan bakteriyel topluluk1,2,3oluşumunda culminates dinamik bir süreçtir. Bakteri adhesin gen ifade profilleri eki biyofilm olgunlaşma sırasında güçlendirmek için değişen süre erken ek kolaylaştırmak için adhesins üretir. Aynı anda, EPS üretim kat ilk tetikleyici hücreleri korumak için bir matris bakteriyel toplumda için oluşur. Biyofilm içinde bulunan bakteriler yavaş büyüyen vardır; ve bu nedenle, en antibiyotikler etkisiz vermektedir. Ayrıca, yavaş büyüme Bakteriyel büyüme1,2,3iyilik için koşullar değiştirene kadar enerji tasarruf sağlar. Sert koşulları geçtikten sonra bakteri biyofilm dağıtmak ve planktonik yaşam tarzı1,2,3devam edin. Geleneksel olarak, biyofilmler yüzeylerinde gözlenen ve kalıcı bir klinik meydan okuma nedeniyle enfeksiyon rezervuarlar Kateterler ve konut cihazlar1,2,3mevcut temsil eder.

Biyofilm oluşumu son zamanlarda birkaç enterik patojenler için tanımlanmıştır; ince bağırsak veya iki nokta üst üste4bulaştırmak bakteri. Shigella türleri, enfeksiyonu gastrointestinal sistem çoğunluğu üzerinden transit sonra insan kolonda oluşur. İnce bağırsak yoluyla geçiş sırasında Shigella safra için maruz kalmaktadır; aynı anda birçok bakteri5öldürme süre lipidler hazım kolaylaştırmak için bağırsak içine salgılanan lipid aşağılayıcı deterjan. Enterik patojenler safra6bakteri yok edici etkileri karşı koymak için eşsiz bir yeteneği var. Bizim son analiz vivo içindekullanılan-hangi tarihlerde glikoz ve S. flexneri sağlam biyofilm oluşumu göstermek için safra tuzları birleşimleri yanı sıra diğer türler, Shigella, patojenik Escherichia colive Salmonella4. Daha önce Salmonella enterica serovar Typhi safra kaynaklı bir biyofilm safra kesesi benzersiz kolonizasyon kronik enfeksiyon7,8,9, sırasında nedeniyle oluşturmak için gösterildi 10. Ayrıca, Vibrio11ve Campylobacter12 ile önceki araştırma biyofilm oluşumu yanıt safra olarak gösterdi. Bu nedenle, analizler safra kaynaklı biyofilm oluşumu gözlemler diğer patojenler için genişletilmiş ve safra korunmuş enterik patojen yanıt bir gösteri kurmak için yardım. Bakteriyel gen transkripsiyonu sınırlıdır ve hücre yaşlanma1,2,3oluşabilir kronik biyofilmler enterik safra kaynaklı biyofilm doğada daha geçici öneriyorum. Bu geçici öldürücü biyofilm tarafından hızlı sökme (dağılım assay olarak görüldüğü gibi) hallmarked ve biyofilm nüfus4,6‘ gözlenen virülans gen ekspresyonu gelişmiş. 

Başlatan bir faktör sadece son zamanlarda en enterik patojenler açıklandığı olduğu gibi çok yönlü, dinamik bir süreç ve safra tuzları kullanımı biyofilm oluşumu olduğu gibi araçları ve teknikleri kullanılan eşsiz ve yaratıcı uygulamalar geleneksel yöntemler vardır. Böylece, burada sunulan üç ücretsiz stratejileri safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu, bakteriyel bağlılık, EPS matris üretimini ve canlı bakteri dağılımı biyofilm üzerinden de dahil olmak üzere birçok önemli özelliklerini ölçmek için vardır. Bu teknikler öncelikle Shigellaile araştırma için kullanılmıştır; ve bu nedenle, en iyi duruma getirme diğer enterik patojenler değerlendirilmesi gerekebilir. Yine de, tüm üç deneyleri olumlu veri tanımlaması biyofilmler destek ve safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için tekrarlanabilir iletişim kuralları kurmak.

Protocol

1. hazırlanması reaktifler Safra tuzları orta: % 0.4 safra tuzları (ağırlık/hacim) içeren tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak için safra tuzları 200 mg 50 mL resuspend autoclaved tekerlekli sandalye Basketbolu. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Taze orta haftalık olun.Notlar: Safra tuzları rutin olarak kullanılan sodyum cholate ve sodyum deoxycholate ovine ve sığır gallbladders izole bir 1:1 karışımı var. Daha önce4gösterildiği, glikoz varlığı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için gerekli idi. Tekerlekli sandalye Basketbolu glikoz göre Luria-Bertani (LB) suyu ekledi; ve bu nedenle, Shigella ve analiz diğer enterik patojenler biyofilm oluşumu ikna etmek yeterliydi. Analiz edilebilir bakteri bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonu veya farklı şeker gereksinimleri gerekli olabilir. %0,5 w/v kristal violet su: 2.5 g kristal violet 500 mL distile suda çözülür. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Concanavalin A (ConA) Birleşik floresein isothiocyanate (FITC): 1 x PBS stokta Reconstitute. 25 µg/mL nihai bir konsantrasyon PBS’ye 1 x 400 μL ile 10 mg konsantre stok sulandırmak ve ışıktan korumak. PBS + glikoz: 10 mL 1 x PBS (%2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun. PBS + safra tuzları: 40 mg 10 mL 1 x PBS çözülür (% 0,4 w/v safra tuzları son). Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun. PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzları ve 10 mL 1 x PBS (% 0,4 w/v safra tuzları ve % 2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun. LB Ağar kaplamalar hazırlayın. Formaldehit/oxazolidin düzeltme: ekleme 810 µL formaldehit (% 37 hisse senedi çözüm, % 3 son konsantrasyonu) ve 125 µL oxazolidin (% 25 hisse senedi çözüm, %0.25 son konsantrasyonu) 14 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve 4 ° C’de depolayın Belgili tanımlık saptamak için doğru kullanımı soğuk olmalıdır.Dikkat: Belgili tanımlık saptamak zehirli ve tehlikeli atık bertaraf gerektirir. Antifade mountant çözüm: 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke içeren antifade mountant çözüm photobleaching immünfloresan mikroskobu örneklerinin fluorescently bakteri DNA boyama sırasında inhibe için kullanın. 2. bakteri hazırlanması TSB 3 mL steril kültür tüp içinde bir tek, iyi izole koloni ile aşı test edilecek bakteri suşlarının gecelik kültürler büyümek. 37 ° C’de gecede kuluçka (16-24 h) için 225 rpm’de sallayarak ile kuluçkaya.Not: Suşları dondurucu stokları her 2 4 hafta ve üzerinde tutulan plakaları Hayır 2 haftadan fazla restreaked. 3. katı faz bağlılık tahlil Not: Bu tahlil yapisan bakteri bir 96-şey plaka yöntemi kullanarak quantifies. Bakteri statik olarak düz dipli levha yetiştirilmektedir. Yapisan bakteri kristal violet ile lekeli ve çamaşır yapışık olmayan bakteriler kaldırmak için gerçekleştirilir. Kristal mor leke peptidoglikan bakteriyel hücre duvarı bağlar ve etanol kullanarak çözündürüldükten. Yapisan bakteri sayısı kristal violet saklama üzerinde bağlı olarak belirlenir. İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + safra tuzları (BS) ile. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme). Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim wells (TSB ve tekerlekli sandalye Basketbolu + BS) test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak üç kuyu ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin. 4-24 h 37 ° C’de için statik olarak kuluçkaya. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells ‘boş’ olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir. Kültür plaka hafifçe eğerek ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına orta aspirating bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan bakteriyel nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun. EPS matris kuluçka döneminde üretilen, matris beyaz çökelti görüntülenir. EPS matris rahatsız etmeyin. Yavaşça wells bir kez 200 µL steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın. Kuru için plaka tersine çevirin. En az 20 dk kurumaya izin.Not: biyofilm iyice boyama önce kurutulmuş gerekir beri Protokolü birkaç saat için bu adım, duraklatılmış veya bile gece olabilir. Eksik kurutma sonuçları ve tekrarlanabilirlik miktar etkiler iken eklenen kuruma süresi boyama yordamı değiştirmez. 0 0.5 kristal violet için her deneysel µL ve denetimi de ekleyin. (RT) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells bir kez 400 µL distile su ile yıkayın. Eklenen birim artık kristal mor leke kuyuları taraftan kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama vakum hattı ile kaldırın. Wells beş kez 200 µL distile su ile yıkayın. Yıkama vakum hattı ile kaldırın.Not: Ayrıntılı çamaşır miktar için önemlidir. Ne zaman boş wells distile su açık ve herhangi bir kalıntı kristal mor leke içermeyen, sonraki adıma geçin. Kuru için plaka ışıktan korunan tersine çevirin. Yukarıda da belirtildiği gibi plaka tam kurutma emin olun. Wells 200 µL % 95 etanol ile destain. Plaka için 30 dk shaker üzerinde kuluçkaya. Özellikle yüksek sıcaklıkta buharlaşma önlemek için bu adım 4 ° C’de uygulayın Bir plaka okuyucu kullanarak, OD540kaydedin.Not: Kristal violet maksimum Absorbans için dalga boyu 590 olduğunu nm. Belgeleri OD540 – kristal violet Absorbans için OD5954,13,14,15,16 Aralık raporları; Böylece bir dalga boyu kullanılabilir plaka okuyucu göre seçin. 4. EPS matris algılama Not: Bu ücretsiz deneyleri ölçmek ve aka görselleştirin. İkimiz de EPS polisakkaritler bağlamak için bir lektin kullanılarak algılanır. Fluorescently Birleşik protein miktar (Adım 4.1) ve görsel öğeler (Adım 4.2) sağlar. EPS yarı kantitatif tespiti İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme). Bir steril, siyah, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için kuyu eklemek ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar tekrarlayın. 4-24 h 37 ° C’de için statik olarak kuluçkaya. Kültür orta açık 96-şey plaka bir pipet, ideal olarak bir çok kanallı pipet ile aktarın. Yapisan nüfus ve/veya plastik yüzeyde bulunan EPS aksatmadan kültür orta toplamak için dikkatli olun. Bir kenara koyun. 15 dakika siyah plaka RT 200 µL/kuyu formaldehit/oxazolidin 1 x PBS kullanarak düzeltmek. Yapisan nüfus tespit ederken, adım 4.1.6 süpernatant kesir değerlendirin. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells ‘boş’ olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. Alternatif olarak, tüm tahlil bir siyah açık alt plaka gerçekleştirilebilir. Bu gibi durumlarda aşırı doz600 değerleri kaydedilebilir ve kültür orta daha sonra 4.1.7 adıma devam etmeden önce iptal edilecek. OD600 değerleri verileri normalleştirmek için kullanılabilir durumda büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar vardır. Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf. Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama hafifçe eğerek plaka ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına yıkamada aspirating vakum satırını kullanarak kaldırın. 150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya Yavaşça iki kez 200 µL PBS ile yıkayın. PBS 150 µL her şey için ekleyin. 488, Floresans kaydetmek nm. Confocal mikroskobu görselleştirme EPS üretim ve biyofilm kalınlığı hesaplanması İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme). Steril bir 24-şey plaka ile 12 mm cam coverslips steril ayarlayın. Boş denetimi hizmet için üç kuyu 400 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın. Yinelenen wells aşısını kültürünün 400 µL eklemek ve tüm deneysel koşullar kaplama kadar tekrarlayın. 4-24 h 37 ° C’de için statik olarak kuluçkaya. Görsel olarak TSB koşulu, büyüme ve EPS çökelti (TSB beyaz) + BS koşulu, büyüme ve hiçbir büyüme ve/veya steril kontrol Wells beyaz çökelti onaylayın. Supernatants kaldırın. RT 200 µL/iyi formaldehit/oxazolidin çözüm 1 x PBS kullanarak, 15 dk fix. Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf. Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın. 150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya Yavaşça iki kez 200 µL/kuyu ile PBS yıkayın. Antifade mountant çözüm DAPI ile bağlayın.Not: Aynı anda bir counterstain olarak görselleştirme için bakteri hücrelerindeki DNA boyama sırasında floresan etiket korumak için DAPI içeren bir hazır, gliserol tabanlı bağlama çözüm çözümdür. Kit’in yönergeleri ve önerileri örnekleri Imaging önce kuluçka süreleri için izleyin. Yordam boyama DAPI DAPI içermiyor antifade mountant çözüm uygulanmadan önce gerçekleştirilir. Tarafından confocal mikroskobu değerlendirin. Confocal mikroskobunun lazer 495 nm/519 nm uyarma/emisyon FITC görselleştirme için ayarlayın. İkinci bir lazer 360 nm/460 nm uyarma/DAPI görselleştirmek için emisyon için ayarlayın. Biyofilm DAPI kanal üzerinde odaklanarak bulun. DAPI ve FITC kanalları tam kalınlıkta belirlemek ve üst ayarlamak için kullanın ve alt kenarlıklarını görüntüleme. Tam kalınlıkta Z-yığın görüntüleri tarafından esir alma imge her 0.25 µm z yığının altında ve üst için parametreleri ayarladıktan sonra kaydedin. Confocal mikroskobu hakkında daha fazla bilgi için lütfen yayınlar için Paddock ve ark. tarafından bakın. 17 , 18 , 19 , 20 Tam biyofilm oluşumu görselleştirmek ve biyofilm kalınlığı hesaplamak için ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 3D görüntülerde yeniden. S. flexneri safra-tuz indüklenen biyofilmler için elde edilen ortalama kalınlık 14 µm4oldu. 5. dağılım tahlil Not: Bu tahlil biyofilm bakteri dağılımı ile sökme algılanır. Burada, olgun biyofilmler kurulan ve daha sonra (genellikle ertesi gün), medya PBS ile değiştirilir veya PBS desteklenmiştir. Süpernatant bileşeni sonra biyofilm ayrışmış bakteri sayısı quantitate için tabi. İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme). Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyu test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için üç kuyular ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin. 4-24 h 37 ° C’de plaka statik olarak kuluçkaya. Devam etmeden önce sıcak PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + 37 ° c glikoz Bu reaktifler taze günlük hazırlayın. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells ‘boş’ olarak ayarlama Orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir. Kültür bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun. Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın. Aşağıdaki üç kuyu içine 130 µL/iyi yıkamak yerine: PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikoz. Bu reaktifler 37 ° C’ye Önceden ısıtılmış olmalıdır 37 ° C’de 30 dk plaka kuluçkaya Dikkatli bir şekilde plaka 37 ° C kuluçka çıkarın. Supernatants bir taze, steril 96-şey tabağa aktarın. 96-iyi blok, levha veya seyreltme kullanarak hazırlamak 10 kat (1:10) steril PBS içine süpernatant, seri dilutions.Not: Seyreltme serisi su katılmamış 10-6 bağlı olarak test edilecek bakteriyel zorlanma alanı. Pilot deneyler en uygun seyreltme aralığı belirlemek için gerçekleştirilebilir. Plaka 5 µL üzerine bir çok kanallı pipet kullanarak LB agar her seyreltme, nokta. 37 ° C’de gecede kuluçkaya. Koloniler ertesi gün ve seyreltme faktörü hesaba birimleri (CFU) oluşturan kurtarma koloni belirlerken güvenirim. 1 x PBS denetimi (% 100 ayarlamak) göre yüzde dağılımı hesaplamak için 1 x PBS denetimi örneğini kurtarma CFU tarafından her tedavi durum CFU kurtarma bölün.Not: Rutin medya plakaları bakteriyel zorlanma ilgi için de kullanılabilir. Örneğin, Shigella Kongo kırmızısı Tabaklarda kaplama. Tabakları için uygun yer kaplama teknikleri kuru olduğundan emin olun.

Representative Results

Şekil 1′ de, altı enterik patojenler sınanan aşağıdaki büyüme medyada safra tuzları içeren çoğunda biyofilm oluşumu indüklenen. Safra tuzları pozlama neredeyse tüm suşların görülmektedir sonra yapisan bakteri önemli bir artış test. İstisnadır enteroaggregative E. coli (olursa); ancak, Δaaf mutant4indüklenen gözlenmesi unutmayın. Ek bağlılık mekanizmaları olursa safra tuzları…

Discussion

Biyofilm oluşumu analizini biyofilmler ve suşları, malzemeleri, laboratuar ve deneyleri arasında değişkenlik dinamik doğası nedeniyle zordur. Burada, çeşitli stratejiler enterik patojenler safra tuzları pozlama deneysel fikir tekrarlanabilirlik tanıtmak için sağlanan takip biyofilm oluşumu belirlemek için sunulmuştur. Tekrarlanabilirlik emin olmak için ek konuları vardır. Her şeyden önce en az üç bağımsız gerçekleştirme her gözlem ve istatistiksel önemi nedeniyle oluşabilir değişim onayl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Rachael B. Chanin ve Alejandro Llanos-Chea teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski ve Bobby Cherayil bu çalışmada kullanılan suşları için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar Grant K22AI104755 (C.S.F.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Tags

Bile SaltsBiofilm FormationEnteric PathogensBacterial PathogenesisShigella FlexneriCrystal Violet AssayQuantification96-well PlateStatic IncubationPBS Washing
Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image