Method Article

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioelectricity, endojen elektrik iyon kanalları tarafından aracılı sinyalleşme ve hücre zarı üzerinde bulunan pompalar oynar gibi telaşlı nöronal ve kas hücrelerinin süreçleri ve birçok diğer biyolojik süreçler, sinyal önemli roller embriyonik gelişimsel desenlendirme. Ancak, in vivo omurgalı embriyogenez elektrik etkinliğini izleme için bir ihtiyaç vardır. Genetik olarak kodlanmış floresan voltaj göstergelerinin (GEVIs) gelişmeler bu sorun için bir çözüm sağlamak mümkün kılmıştır. Burada, nasıl bir transgenik voltaj göstergesi Zebra balığı kurulan voltaj göstergesi, ASAP1 kullanarak oluşturulacağını açıklar (hız sensörü, Aksiyon potansiyelleri 1), örnek olarak. Tol2 kit ve her yerde birden bulunan Zebra balığı organizatörü, ubi, bu çalışmada seçildi. Biz aynı zamanda ağ geçidi siteye özgü klonlama, Tol2 transposon tabanlı Zebra balığı transgenesis ve normal epifluorescent mikroskoplar kullanarak aşamasındaki balık embriyo ve balık tümörleri için görüntüleme işlemi işlemleri açıklar. Bu balık satırını kullanarak, Zebra balığı embriyo ve balık larva hareketi sırasında hücresel elektrik voltaj değişiklikleri vardır bulundu. Ayrıca, birkaç Zebra balığı Malign periferik sinir kılıf tümörleri içinde çevresindeki normal dokuların hücreleri genellikle polarize tümör karşılaştırıldığında gözlendi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioelectricity endojen elektrik iyon kanalları ve hücre zarının1üzerinde bulunan pompalar aracılı sinyalleşme için ifade eder. Hücresel membran ve eşleşmiş Elektrik potansiyeli ve geçerli değişiklikleri, iyonik değişim süreçleri telaşlı nöronal ve kas hücrelerinin sinyal için gereklidir. Buna ek olarak, bioelectricity ve iyon degradeler çeşitli enerji depolama, biyosentezi ve metaboliti ulaşım da dahil olmak üzere diğer önemli Biyolojik işlevleri var. Biyoelektrik sinyal Ayrıca embriyonik Desen oluşumu, vücut eksenleri, hücre döngüsü ve hücre farklılaşması1gibi bir düzenleyici olarak keşfedilmiştir. Böylece, bu tür sinyal yanlış düzenlenmesi neden pek çok insan Konjenital hastalıklar anlamak için önemlidir. Yama kelepçe yaygın tek hücreleri kaydetmek için kullanılmıştır, aynı anda birden fazla hücreleri embriyonik gelişim içinde vivosırasında izleme için ideal hala uzak olsa da. Ayrıca, voltaj duyarlı küçük moleküller de vivo içinde uygulamalar nedeniyle onların özelliklerine, hassasiyetleri ve toksisite için ideal değildir.

Çeşitli oluşturulması genetik olarak bu sorunu aşmak için yeni bir mekanizma floresan voltaj göstergelerinin (GEVIs) Teklifler kodlanmış ve düz-se bile onlar aslında sinir izlemek için istenmeyen embriyonik gelişim, eğitim kolay uygulama sağlar 2,3hücreleri. Şu anda mevcut GEVIs biri hız sensörü aksiyon potansiyelleri 1'in (ASAP1)4. Voltaj duyarlı fosfataz ve dairesel yayın derlenemiyor yeşil flüoresan protein bir gerilim algılamalı etki alanının hücre dışı bir döngü oluşur. Bu nedenle, ASAP1 hücresel elektrik potansiyel değişiklikleri görselleştirme sağlar (Polarizasyon: parlak yeşil; depolarizasyon: koyu yeşil). ASAP1 2 ms açık ve kapalı Kinetik vardır ve subthreshold olası değişiklik4izleyebilirsiniz. Böylece, bu genetik aracı gerçek zamanlı biyo-elektrik canlı hücrelerde izleme etkinliğinin yeni düzeyi sağlar. Daha fazla bioelectricity embriyonik geliştirme ve birçok insan hastalıkları, kanser gibi rollerini anlamak hastalık tedavi ve korunma için kritik olan temel mekanizmaları, yeni ışık tutacak.

Zebra balığı gelişim biyolojisi ve insan hastalıkları kanser5,6dahil olmak üzere çalışmaya güçlü bir hayvan modeli kanıtlanmıştır. Onlar % 70 orthologous genler insanlarla paylaşmak ve onlar-si olmak benzer omurgalı Biyoloji7. Zebra balığı nispeten kolay bakım, yumurta, uysal genetik, kolay transgenesis ve saydam dış embriyonik geliştirme, hangi yapmak onları vivo içinde görüntüleme5,6için üstün bir sistemi büyük debriyaj boyutunu sağlar. Bir büyük satırların kaynağı olan mutant balık zaten mevcut ve tam sıralı genom, Zebra balığı bilimsel keşif nispeten sınırsız bir dizi sağlayacaktır.

Hücreleri vivo içinde gerçek zamanlı elektriksel aktivitesinin araştırmak için Zebra balığı modeli sistemi ve ASAP1 avantajlarından yararlanın. Bu yazıda nasıl flüoresan gerilim Biyoalgılayıcı ASAP1 Tol2 transposon transgenesis kullanarak Zebra balığı genom dahil tarif ve hücresel elektriksel aktivite sırasında embriyonik gelişim, Balık larva hareketi ve canlı tümör görselleştirmek .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı AAALAC onaylı bir hayvan tesiste yer alan ve tüm deneylerin Purdue hayvan bakım ve kullanım Komitesi (PACUC) tarafından onaylanmış protokolleri göre yapılmıştır.

1. Tol2 Transposon plazmid yapı hazırlık

Not: Tol2, medaka balıkta keşfedilmiştir bir transposon içinde Zebra balığı araştırma topluluk8,9yaygın olarak kullanılmıştır. Başarılı bir şekilde ağ geçidi siteye özgü rekombinasyon tabanlı klonlama sisteme kabul ve Tol2 seti10olarak da bilinir. Tol2 seti oluşturma özelleştirilmiş ifade yapıları da transgenesis verimliliğini artırırken, daha uygun bir yol sağlar. Böylece, bu sistem yararlanmak ve doğrulanmış Ubikuitin organizatörü ASAP111sürücü kullanarak her yerde ASAP1 ifade Zebra balığı çizgi oluşturmak için kolay bir karar oldu.

  1. Orta giriş ASAP1 yapı oluştururken: pDONR221-ASAP1
    1. Genetik olarak kodlanmış voltaj sensör ASAP1 yapı, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plazmid #52519), Addgene elde etmek. ASAP1 kodlayıcı bölge yükseltmek için sonunda 5' astar (şekil 1) attB serileri ile çevrili (attB1-ASAP1F ve attB2-ASAP1R) özelleştirilmiş primerler kullanılarak bir PCR ayarlayın. Phusion DNA polimeraz yüksek verimlilik için seçildi ve PCR koşulları daha önce yayımlanmış protokolü12tarihinde göre optimize.
    2. TAE jel düzenli bir pipet ile 200 µL ipuçlarını kullanarak bir %1 50 µL PCR ürünleri yüklemek ve Elektroforez 160 V adlı bir yatay jel tankı yaklaşık 30 dk için gerçekleştirin.
    3. Jel UV transilluminator altında kontrol (353 nm), tüketim bıçak/neşter UV transilluminator altında daha önce yayımlanmış13,14olarak kullanarak istenen bant dışarı ve DNA içeren jel örneği temiz 1.5 mL microcentrifuge koymak tüp.
    4. Jel arıtma ASAP1 PCR ürünleri için gerçekleştirin. Ticari DNA jel arıtma seti üreticisinin öğretim takip uygulayarak çıkarılan jel DNA'da yeniden elde etmek ve su 20 µL DNA elute. Bir örnek olarak 1 µL al ve bir Spektrofotometre kullanarak DNA toplama ölçmek. Boş denetim15su kullanarak yazılım yönergeleri akışı.
    5. Almak 100 ng, saf PCR ürünü ve 150 ile karıştırmak pDONR221 plazmid TE 10 µL içinde ng tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. BP Clonase II 2 µL tepki içine ekleyin ve reaksiyon oda sıcaklığında gecede kuluçkaya.
    6. İkinci gününde, İndinavir K 1 µL tepki ekleyin ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    7. Dönüştürme gerçekleştirmek. Reaksiyon aktarmak ve yetkili E. coli hücreleri ve hücreleri 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya Top10 50 µL ile karıştırın. O zaman, 1 dk. 42 ° C su banyosu tepki tüpüne hemen tüpü çıkarması ve 2 min için buz üzerinde kuluçkaya transfer. Daha sonra tüp 37 ° C shaker koyun ve 1 h için kuluçkaya.
    8. Tüp çıkar ve hücreleri sefaloridin LB plaka üzerine plaka. Daha sonra plaka gecede (16-18 h) 37 ° C'de kuluçkaya
    9. Tek ve iyi ayrı kolonileri alın ve onları 14 mL hücre kültür tüpleri ile 3 mL LB orta içine aşılamak. Onları gecede bir shaker (dönüş / dakika) 250 rpm'lik dönüş hızı ile 37 ° C'de kültür.
    10. Onun öğretim el ile17takip bir ticari miniprep kit kullanarak miniprep gerçekleştirin.
    11. 3-4 Plazmid dizi Sanger ile M13F ve M13R sıralama primerler kullanılarak olumlu pDONR221-ASAP1 tanımlamak için sıralama klonlar.
  2. Mikroenjeksiyon Tol2 yapı oluştururken: pDestTol2 -ubi-ASAP1
    1. Nasıl yapılacağını pDONR221-ASAP1 klon ve ölçü onun DNA toplama bir Spektrofotometre aşağıdaki boş bir kontrol gibi15su kullanarak yazılım yönergesi kullanarak doğrulanmadı seçin.
    2. PDONR221-ASAP1 100 µg alıp Tol2 kit 5 uçlu plazmid 100 µg ile karıştırın (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-polyA (Tol2 kit #302) ve pDestTol2pA2 150 µg (Tol2 kit #394). 8 µL için toplam ses seviyesini ayarlamak bir 1.5 mL microcentrifuge TE tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) kullanarak tüp ve mix de bir 2-5 s kısa girdap tarafından. O zaman, LR Clonase II plus 2 µL ekleyin ve reaksiyon oda sıcaklığında gecede kuluçkaya.
    3. İkinci gün, İndinavir K 1 µL 10 µL pipet kullanarak tepki ekleyin ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Dönüştürme gerçekleştirmek ve olumlu klonlar (adımları 1.1.7-11) açıklandığı gibi tanımlar.
    5. Ölçü sıralama DNA konsantrasyon pDestTol2-ubi-ASAP1 klon (şekil 1B) Spektrofotometre15kullanarak doğrulanmadı. Genellikle 200ng/µL bölgedir.

2. Tol2 Transposase mRNA ve enjeksiyon çözüm hazırlamak

  1. Steril aşılama döngü kullanarak çizgi E. coli gliserol stokunun pCS2FA-transposase plazmid (Tol2 kit #396) (ile 100 µg/mL Ampisilin) LB plaka üzerine. Plaka bir kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Ertesi gün, bir koloni almak ve bunu LB (100 µg/mL Ampisilin) 3 mL steril 10 µL pipet ucu kullanarak aşılamak. Bir shaker 250 rpm'lik dönüş hızı ile 37 ° C'de gecede kültür.
  2. Miniprep onun kullanım kılavuzu takip bir ticari miniprep kit kullanarak E. coli kültür gerçekleştirin. Plazmid DNA TE arabellek 30-50 µL 1 dakika santrifüj 14.000 RPM tarafından elute ve onun DNA toplama bir Spektrofotometre ile ölçmek.
  3. Plazmid ile değil ben 1-2 µg endonükleaz linearize ve temizleme seti değil ben sonra onun kullanım kılavuzu aşağıdaki DNA ile DNA sindirim arındırmak. DNA su 5 µL 1 dakikadır 14.000 rpm centrifuging tarafından elute. Beklenen konsantrasyon ilgili 200-300 ng/µL.
  4. Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek ile değil ben pCS2FA-transposase bir ticari SP6 transkripsiyon kit kullanarak DNA şablon olarak doğrusallaştırılmış.
  5. Reaksiyon tamamlandıktan sonra üreticinin yönergelerini izleyerek bir ticari RNA temizlik kullanarak mRNA kit Tol2 transposase arındırmak. Son olarak, mRNA RNAase ücretsiz 20 µL suya elute ve bir Spektrofotometre RNA konsantrasyon ölçmek. Beklenen konsantrasyon ilgili 1-3 µg / µL. örnekleri gerekirse-80 ° C dondurucuda saklanabilir.
  6. 20 ng/µL pDestTol2 -ubikarıştırılarak mikroenjeksiyon çözüm hazırlamak-ASAP1 ve Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) pipetting tarafından microcentrifuge tüp içinde. Nükleik asit önlemek için bozulması tekrarlanan çözdürme ve tüp başına refreezing, aliquot 6 µL neden olduğu ve-80 ° C dondurucu ileride kullanmak üzere saklayın.

3. mikroenjeksiyon

  1. 4-6 üreme tankları en az 2 kadın ve 2 erkek ile öğleden sonra enjeksiyon önce ayarlayın. Bu balık öğleden sonra beslenmelidir değil. Bu adımı balık atık miktarını azaltmak ve ertesi sabah da ikna etmek üreme yanıt için yardımcı olurken, onları temizlemek için zaman kazandırır.
  2. Ertesi sabah, hazırlanan enjeksiyon çözümü kaldırmak (pDestTol2 -ubi-ASAP1 yapı ve Tol2 mRNA)-80 ° C dondurucu gelen ve buz üzerinde yerleştirin.
  3. Bölücüler tankları ıslah balık çekin ve çiftleşmek balık sağlar. Genel olarak, Balık bölücü çekerek sonra 20-30 dakika içinde yumurta yatıyordu. Aksi takdirde, 1-2 saat daha bekle. Biraz balık hiç yumurtalarını değil. Bu durumda, bu deney balık embriyo koleksiyonu için yineleyin.
  4. Beklerken, iğneler Forseps ile veya bir hassas görev silecek kırarak eğimli kenarı oluşturmak bir açıyla kırık ucu hazırlanmış olduğundan emin olun.
    1. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir micropipette çektirmenin kapiller camdan Needles çekin: 545; ısı Çekme 60; hızı 80; zaman 250; basınç 500. Forseps tutarak bir açı yaklaşık 45 ° bir diseksiyon kapsamla (çapı tahmini için göz-adet cetvel) altında Forseps ile iğne kır. İstenen iğne çapları microinjector ayarlarına bağlı olarak değişken olabilir, ama daha küçük çaplı embriyo ölümleri azaltmak için tercih edilir.
  5. Bir kez balık yumurta atılmıştır var, onları bir 10-cm çapında Petri kabına toplamak ve diseksiyon kapsama getir. Tüm anormal embriyo kaldırmak ve atık balık.
  6. Damlalıklı döllenmiş embriyo içine hazırlanan % 3 özel enjeksiyon kalıp. Embriyo tutmak yardımcı olmak için fazla suyu kaldırın.
  7. Bir kez tüm satırları uygun embriyo ile dolu, aynı yöne doğru yatay olarak yaklaşık 45 ° açı bu iğne tek hücreleri tüm yüz onları yeniden düzenleyin. Bu enjeksiyon daha sonra çok daha kolay yapacaktır.
  8. Eldiven giyerken, 20 µL yükleme damlalıklı kullanın İpucu ve buz üzerinde tüp hazır yapı 5 µL kaldırın.
  9. Dikkatle ta uzantılar gibi ipucu yakın reaktif elde olarak için başladığı için kırık kılcal tüp arka uç ucunu takın. Hala hava kabarcıkları Eğer ucunu kırmak emin iğne sallamak.
  10. İğne mikroenjeksiyon iğne bağı düz yerleştirin ve iğne yerinde kalır kadar dikkatlice sıkın. Yaklaşık 45 ° açıyla ayarlayın.
  11. Bir kez iğne hazırlanan ve bağlı, mikroskop ve gaz basınç tankı açın. Ticari CO2 Tanklar bu amaç için genel olarak iyi. Enjeksiyon hacmi holding ve ejeksiyon basınç ayarlanır: yaklaşık 0,5 psi tutmak için ve fırlatma için 30 psi. Çözüm, zaman pedal basarak çıkar ki kontrol ettiğinizden emin olun.
  12. Mineral yağ, bir damla ile bir sahne mikrometre kullanarak ayarlayın birim ve çözüm için ~ 150 µm çapında akışını (yaklaşık 2 nL). Arka basınç iğne damla küçük bir miktar izin verir emin olun. Yeterince geri dönüş basıncı varsa, kılcal eylem iğne girin ve mRNA yok etmek için sıvı neden olur.
  13. İğne kalibre edilmiş bir kez inşa döllenmiş embriyolar tek hücre enjekte başlar.
    Not: Bu uygulama, sabır ve incelik, hücre zarının delmek sabit varlık nedeniyle büyük bir miktar alır. Bu çözüm değil sarısı transgenik Zebra balığı üretmek için hücre içine enjekte etmek önemlidir. Bu morpholino enjeksiyon farklıdır. Hangi tarafta iğne hücrenin yapı hücreye gider sürece girer önemli değil. Transgenesis hücre yerine sarısı içine enjekte başarı oranı çok düşük olacaktır. Tek hücreli sahne enjeksiyon da önemlidir veya somatik chimera balık-ecek var olmak mahluk. Bu germ hücreleri girmeden transgene olasılığını azaltacaktır.
  14. Jel çentik kenarına embriyo yerine tutar ve iğne embriyo hareket ettirmeden basınç uygulamak izin veren bir destek sağlamak için kullanın. İğne ucu tek hücrede olduğunda, çözüm istenilen miktarda serbest bırakmak için pedal basın. Tüm embriyoların için bu adımları tekrarlayın.
  15. Rapor tamamlandığında, enjekte embriyo onları balık sistem su ve bir tek kullanımlık 3.4 mL transfer pipet ile özel çentik dışarı durulama etiketli bir tabak içine aktarın. Embriyo geliştirmek izin bir 28.5 ° C kuluçka makinesi içinde saklayın. Kontrol sırt ölü balık embriyo kaldırma gün ve % 0.1 Metilen mavisi balık suda su yerine.
  16. Yaklaşık 6-8 saat sonra enjeksiyon, enjekte almak 10 tek embriyo balık ve sert çocuk yöntemi18kullanarak onlardan genomik DNA hazırlamak.
  17. Ertesi sabah, diseksiyon mikroskop GFP ve sigara sarısı dokularda gösterilen embriyo dışarı sıralamak için bir Floresan ışık kaynağı ile kullanın. Bu balık embriyoların enjekte yapı içermelidir.
  18. Tol2 tüketim tahlil19daha önce açıklandığı gibi transposon etkinliği denetlemek için gerçekleştirin. Eksize plazmid tespit edilebilir, enjekte tutmak balık embriyo ve onları yetiştirmek. Eğer hiçbir eksize plazmid bulmak, Tol2 mRNA sentezi ve mikroenjeksiyon işlemi Tol2 tüketim testin pozitif sonuçlar elde kadar yineleyin.

4. transgenik ASAP1 balık, Tg kurun (UBI: ASAP1)

  1. Yetişkinliğe enjekte balık (F0 üretimi) Zebra balığı kitap20daha önce açıklandığı gibi kaldırın. Bu genellikle yaklaşık 4 ay sürer.
  2. Bir tek yetişkin F0 balık almak ve cinsiyet wildtype balık karşısında tek bir çapraz. Islah daha sonra gün sonra balık embriyo toplamak. Toplanan balık embriyo 28.5 ° C kuluçka balık su % 0,1 Metilen mavisi ile tutun.
  3. Üçüncü günde, floresan diseksiyon mikroskop altında balık embriyo GFP filtre ile kontrol edin. Eğer var birisi yeşil balık embriyo sıralamak ve onları yetişkinliğe F1 nesil transgenik balık, Tg olarak yetiştirmek (UBI: ASAP1).
    Not: mikrop-line genetik chimeras ebeveyn F0 balık çoğu bu yana Mendel oranı beklenmez.
  4. Tek F1 yetişkin balık wildtype balık ile çapraz ve balık embriyo toplamak. Yeşil balık embriyo sıralamak ve onları yetişkinliğe F2 nesil balık olarak yetiştirmek.
    Not: Yeşil ve yeşil balık embriyo 1:1 yakın olup olmadığını tek bir transgene olmalıdır.
  5. Tümör kötü huylu periferik sinir kılıfı Tümörü (MPNST) gibi elektrik potansiyel değişiklikleri görüntülemek için F2 nesil Tg çapraz (UBI: ASAP1) rpl35hi258/wt balık ile balık. Bu görünür tümör içinde 6-8 ay yaşlı yetişkin21,22bulunmak başlatmak bilinmektedir.

5. görüntüleme

  1. Zebra balığı embriyo resim, birden çok F2 nesil kurucusu balık almak ve onları wildtype balık bireysel çiftleri ile çapraz için. Kılavuzu23evreleme Zebra balığı göre farklı istenen gelişim aşamalarında balık embriyo toplamak.
  2. Balık embriyo erken dönemlerinde için soyma ve chorions dikkatlice 10 cm çapında Petri kabına balık sistem su ile bir diseksiyon kapsamı altında bir çift forseps kullanarak embriyoların kaldırma.
  3. Concaved cam slayt üzerine birkaç balık embriyo 3.4 mL tek kullanımlık transfer pipet kullanarak % 3 methylcellulose ile aktarın. Bir floresan diseksiyon kapsamı altında bir iğne kullanarak hücresel GFP etkinliğini görüntülemek için istenen konumlara embriyo ayarlayın.
  4. Balık embriyo (12 somite sahne büyük) hareketli aşamaları için % 0.05 tricaine mesylate balık embriyo slaytlara aktarmadan önce anestezi için kullanın. Kısaca, yüzme ve beden denge kaybı durdurulana kadar balık embriyo %0,05 tricaine mesylate balık su içine ortaya. Ayrıca, slayt üzerinde %0,05 tricaine mesylate methylcellulose ile bir damla ekleyin.
  5. Az 12 somite sahne balık için embriyo, epi-floresan mikroskop bileşik bir uyumlu kamera ve yazılım ile görüntüleme için kullanın. 12 somite sahne balık embriyolar daha eski için Floresans diseksiyon mikroskop kullanın.
  6. Tümör hücre voltajı resim, ilk balık MPNST tümörler ile tanımlamak için. O zaman, %0.05 tricaine mesylate balıkla anestezi. Bütün Dağı görüntüleme için balık 10 cm çapında Petri kabına koymak. Tümör hücre elektrik etkinliğini görüntülemek için balık tümörler dışarı bütün Dağı görüntüleme sonra disseke.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir başarılı yerleştirmeye, fazla enjekte % 50 balık embriyo yeşil floresan bir dereceye somatik hücreler görüntüler ve bunların çoğu Tol2 transposon tüketim tahlil (Şekil 2) tarafından olumlu olacaktır. 2-4 nesil (floresan balık % 50, beklenen Mendel oranı gelinceye) wildtype balıkla dışı geçtikten sonra transgenik balık hücre membran potansiyeli embriyonik gelişim sırasında izlemek için görüntüleme deneme için kullanılmıştır. İlk olarak, membran olası değiş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her ne kadar cep ve doku düzeyinde elektrik faaliyetleri sırasında embriyonik geliştirme ve insan hastalık uzun zaman önce keşfedildi, vivo içinde dinamik elektrik değişiklikleri ve biyolojik rolleri hala büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Büyük zorluklardan biri görselleştirmek ve elektrik değişiklikleri ölçmek etmektir. Yama kelepçe teknoloji bir mola-tek hücre izlemek için geçer ancak birçok hücrelerinin oluşan oldukları için uygulama omurgalı embriyolar için sınırlıdır. Geçerli kimyasal gerilim boyalar da onları...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında bildirilen araştırma çalışmaları tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124913, Purdue Üniversitesi PI4D teşvik programı ve PVM iç rekabet altında desteklenen Temel araştırma fonları programı. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka finansman ajanları resmi görüşlerini temsil etmiyor. Biz Koichi Kawakami Tol2 yapı, Michael Lin ASAP1 inşa etmek için teşekkür ederiz ve Leonard Zon ubi organizatörü için inşa Addgene.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 mL hücre kültürü tüpleriVWR60818-725E.Coli kültürü
Agaroz elektroforez tankıThermo ScientificOwl B2DNA eletroforez
Agarose RAAmrescoN605-500GEnjeksiyon jellerini yapmak için
Attb1-ASAP1-F astarIDT DNAGGGGACAAGTTTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		Alt klonlama için ASAP1 kodlama bölgesi amplifikasyonu
Attb2-ASAP1-R primerIDT DNAGGGGACCACTTTACAAGAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA		ASAP1 alt klonlama için kodlama bölgesi amplifikasyonu
Parlak alan diseksiyon kapsamıNikonSMZ 745Dekorionasyon, mikroenjeksiyon, montaj
Renkli kameraZeissAxioCam MRcBalık embriyosu görüntü kaydı
İçbükey slaytVWR48336-001Görüntüleme işlemi sırasında balık embriyolarını tutmak için
Tek kullanımlık transfer pipeti 3.4 mlThermo Scientific13-711-9AMBalık embriyoları ve su transferi
Endonükleaz enzimi, I DeğilNEBR0189LPlazmid DNA'yı doğrusallaştırmak için
Epifuorescent bileşik kapsamıZeissAxio Imager.A2Balık embriyo görüntüleme
Epifuoresan stereo diseksiyon kapsamıZeissStereo Discovery.V12Balık embriyo görüntüleme
Floresan ışık kaynağıLümen dinamiğiX-cite seris 120Floresan mikroskoplar için ışık kaynağı
Forseps #5WPI500342Dekoryonasyon ve iğne kırma
Ağ Geçidi BP Klonaz II Enzim karışımıThermo Scientific11789020Ağ Geçidi BP rekombinasyon klonlama
Ağ Geçidi LR Klonaz II Plus enzimiThermo Scientific12538120Ağ Geçidi LR rekombinasyon klonlama
Jel DNA KurtarmaKiti Zymo ResearchD4002DNA jel saflaştırması
Yükleme ucuEppendorf930001007Kılcal iğnelere enjeksiyon çözeltisi yüklemek için
Metilselüloz (1600cPs)Alfa Aesar43146Balık embriyo montajı
Metilen mavisiSigma-AldrichM9140Petri kaplarında mantar salgınlarını baskılar
Mikroenjeksiyon kalıbıUyarlanabilir Bilim AraçlarıTU-1Enjeksiyon sırasında balık embriyolarını tutmak için agaorse kalıp tepsisi hazırlamak için
MikroenjektörWPIPnömatik Picopump PV820Mikroenjeksiyon enjektörü
Mikro manipülatörWPIMikroenjektör MM3301RMikroenjeksiyon işlemi
Mikropipet çektirmeSutter aletiP-1000Kılcal iğne hazırlamak için
Mineral yağAmrescoJ217-500mlEnjeksiyon hacmini kalibre etmek için
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon KitiThermo ScientificAM1340mRNA in vitro transkripsiyon
Tek renkli kameraZeissAxioCam MRmBalık embriyo görüntü kaydı
Plazmid Miniprep KitiZymo ResearchD4020Az miktarda plazmid DNA
Plastik Petri kaplarıVWR25384-088Görüntüleme işlemi sırasında balık veya balık embriyolarını tutmak için
RNA Temiz & Konsantratör-5Zymo ResearchR1015in vitro transkripsiyondan sonra mRNA temizliği
ve RNA konsantrasyonlarını ölçmek içinSpektrofotometreThermo ScientificNanoDrop 2000
StageMicrometer ScopeMR100Mikroenjeksiyon hacim kalibrasyonu
ThermocyclerBio-RadT100Gen klonlama için DNA amplifikasyonu
İnce duvar cam kılcal damarlarWPITW100F-4Kappilter iğne yapmak için ham cam
Tol2-exL1 astarIDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 tüketim testi
Tol2-exR astarIDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGTol2 tüketim tahlili
TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coliThermo ScientificC404006Gen klonlaması
sırasında dönüşüm için kullanılırTrikain mesilatSigma-AldrichA5040Balık veya balık embriyolarının uyuşturulması için
UV trans-aydınlatıcı 302nmUVPM-20VDNA görselleştirme
Su banyosuThermo Scientific2853Gen klonlamanın dönüşüm süreci için
hazırlayın DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles