Yöntem makalesi

Toprak örnekleri Multi-omic analizleri için karmaşık iletişim kuralı

DOI:

10.3791/57343

⸱

30 Mayıs 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir iletişim kuralı aynı anda metabolitleri, proteinler ve yağlar bir tek toprak örneğinden ayıklanması, azaltılmış örnek hazırlama kez izin ve multi-omic kütle spektrometresi analizleri ile sınırlı miktarda örnekleri etkinleştirme için sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi (MS)-tabanlı entegre metaproteomic, metabolomic ve lipidomic (multi-omic) çalışmaları bizim yetenek anlamak ve mikrobiyal topluluklar çevre ve biyolojik sistemleri karakterize dönüştürme. Bu ölçümler bile en karmaşık toprak mikrobiyal topluluklar, gelişmiş analizler etkinleştiriyorsanız bugüne kadar bilinen karmaşık mikrobiyal sistemleri. Ayrı çekimi genellikle gerekli örnek miktarı ve hazırlık zamanı böylece önemli ölçüde yükseltecek her omic çalışması için gerekli olan bu yana Multi-omic analizleri, ancak, örnek hazırlama zorluklar vardır. Bu sınırlama adrese, 3'ü 1 metodu metabolitleri, proteinler ve yağlar (karmaşık) eşzamanlı çekme--dan aynı toprak örneği için solvent bazli bir yaklaşım adapte tarafından oluşturulur. Bu karmaşık iletişim kuralı ne zaman bile sınırlı miktarlarda karmaşık toprak örnekleri için kullanılan basit ve pek çok örnek türü, sağlam olduğu ispatlanmıştır. Karmaşık yöntem da büyük ölçüde daha iyi bir mikrobiyal her topluluk üyeleri biyolojik ve çevresel tedirginlikler üzerine gerçekleşen değişiklikleri değerlendirme sırasında anlayış kazanmak için gerekli hızlı multi-omic ölçümleri etkin.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toprak mikrobiyal toplulukları değerlendirirken karbon Bisiklete binme ve iklim değişikliği anlamak için önemli sonuçları vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ancak microbiota çeşitli toprak tipleri için sıralı genleri eksikliği ve birçok tespit proteinlerin bilinmeyen fonksiyon gibi zorluklar sermiştir. Bu zorluklar sonucu1,2,3bugüne kadar bilinen en karmaşık mikrobiyal topluluk olmak toprak nedeniyle. Birleştirme sonuçları metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic ve lipidomic çalışmaları, Multi-omic analizleri, son zamanlarda içine mikropların mevcut ise daha büyük bir anlayış kazanmak için çok sayıda toprak çalışmalarda hayata geçirdik çevre tedirginlikler1,4,5nedeniyle gerçekleşen moleküler değişiklikler hakkında kapsamlı bilgi edinme. Multi-omic çalışmaları ile bir meydan okuma kütle spektrometresi (MS) olduğunu-tabanlı metaproteomic, metabolomic ve lipidomic ölçümleri genellikle MS uyumlu6,7 olmak her omic için bir özel ayıklama işlemi gerektirir , 8 , 9. sınırlı bir miktar örneği yalnızca kesin bu yordamları bunların uygulanması çok güç veya imkansız ne zaman yapmak. Bu sorunlar bize bir eşzamanlı metaboliti, protein ve lipit ayıklama (karmaşık) yöntemi daha küçük örnek birimleri veya kitleler kullanarak, doğruluğu artırma ve daha hızlı örnek hazırlıklar tüm üç analizleri için sağlama yeteneğine sahip araştırmak için isteniyor 10. bugüne kadar tüm bu gol elde edebilirsiniz hiçbir alternatif toprak ayıklama yordamlar vardır.

Küresel multi-omic analizleri tek toprak örneği etkinleştirmek için kloroform, metanol ve su ayrımları dayalı bir organik solvent ekstraksiyon protokolü kullanıldığında10yaşındaydım. Bu yöntem was orijinal gelişmiş toplam lipid çekimi9,11 ve son zamanlarda bir tek örnek12,13 metabolitleri, proteinler ve yağlar ekstraksiyon eşzamanlı değiştirilmiştir ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, daha az örnek miktar etkinleştirme 23,24,25,26,27,28,29,30, ve Deneysel değişkenlik10. Karmaşık iletişim kuralında kloroform örnek bileşenlerinin trifazik kimyasal ayırma içine ayrı kesirler için temel sağlar su ile karışan değil. En iyi sulu faz bu nedenle alt kloroform aşamasında (Şekil 1) ardından bir protein disk ve sonra bir lipit katmanı hidrofilik metabolitleri içerir. Karmaşık çoğu topraklar için uygulandığında, partikül enkaz örnekleme tüpler çok altında birikir ve tüm katmanları toplandıktan sonra iptal edilecek. Her toprak tipi-ebilmek var olmak farklı, ancak ve torf gibi son derece organik toprak, toprak enkaz Orta katmanda kalır ve örnekleme tüp altına girmemektedir. Karmaşık sağlar çeşitli yararları 1) küçük örnek miktarlarda multi-omic analizleri, aynı örnek azalma gelen 2) multi-omic çekimi için kullanılan gibi birden fazla molekül yalıtma aynı örnekten yazdığında genel olarak deneysel değişkenliği, ve 3) daha fazla sayıda örnekleri çok daha hızlı daha yüksek üretilen iş çalışmalar10için hazır olun. Birlikte bu faydalar toprak örnekleri ve karmaşık mikrobiyal topluluklar değerlendirmek için daha iyi ölçüm yeteneği sağlamak için hayati önem taşımaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Çok ıslak toprak çıkarma çıkarma önce zarar vermeden etkinliği için liyofilize. Islak toprak da kullanılabilir ancak reaktifler belirli oranlarıyla eklerken düşünülmelidir.

Not: Bu iki 50 mL tüpler (en fazla 50 mL tüp başına 10 g toprak) arasındaki ayırmalısınız ayıklama başına kuru toprak ağırlığının 20 g kullanmak için tavsiye edilir. Çekimi bağlıdır kullanılabilir örnek aşağı ve yukarı ölçeklendirilebilir.

Not: Kuru toprak örnekleri homojenize ve küçük kökler ve kayalar kaldırmak için 3 mm ekran üzerinden elenmiş. Örnek belgili tanımlık perde içinde sıkışmış almak gibi ıslak toprak örnekleri, elek değil.

1. hücre lizis ve metabolitleri, proteinler ve yağlar (zamanlama ~ 1 d) çıkarımı toprak

  1. 20 g toprak örneği 10 g metanol/kloroform uyumlu olan iki ayrı 50 mL tüpler içine tartın. Kloroform örnekleri kirletici çoğu plastik leach olarak seçilmiş, tüpleri ile son derece dikkatli olun. Her ne zaman mümkün veya plastik borular polipropilen ya da politetrafloroetilin (PTFE) yapılan cam kullanın.
    Not: toprak buz ve serin tutmak ilk tartı ve homojenizasyon adımları sırasında mümkün olduğunca.
  2. Paslanmaz çelik kloroform yıkanmış ve garnet boncuk 10 mL her tüp için ekleyin. Buz, soğuk ultrasaf 4 mL ekleyin ( Tablo malzemeleri arıtma sistemi için görmek) her tüp (iki tüp arasında bir örnek bölünmüş) su ve buz kovası örneklerinde duman kukuIeta aktarmak.
  3. 25 mL Cam serolojik pipet kullanarak, hızlı bir şekilde buz gibi 2:1 kloroform: metanol (v/v) 20 mL ekleyin.
    Dikkat: Kloroform: metanol akut potansiyel sağlık etkileri vardır: cilt tahriş, olası kimyasal yanık ve solunum sistemini tahriş. Böbrekler, karaciğer ve kalp etkileyebilir. Uygun koruyucu gözlük, giyim ve eldiven giymek ve her zaman bir duman mahallede çalışır.
  4. Kapakları ve girdap çözüm sıkın. 2:1 choloroform:methanol prokaryot hücre duvarı kırmak yardımcı olur ve aynı zamanda enzimatik faaliyetleri inaktive.
  5. Tüpler 50 mL tüp girdap ekler ve yatay olarak bir buzdolabı içinde 4 ° C'de 10 dakika için girdap mümkünse ekleyin. O zaman, onları tamamen soğuması için ~ 15 dk-80 ° C dondurucu içine örnekleri yerleştirin.
  6. Bir sonda sonicator bir duman başlık içinde kullanarak solüsyon içeren temizleyicide her örnek genlik %60 30 6 mm (1/4") prob ile her buz s.
    Dikkat: Bu bir ses sonicating muhafaza ve kulak koruma azalmaya kullanmak için önerilir. Yüksek gerilim güç kaynağı ve yüksek frekans kabloyu mevcuttur. Alt veya örnek gemi kenarlarında ile etkin bir soruşturma dokunmaktan kaçının; çatlamak veya plastik erime olabilir.
  7. Sonicating bir sürü ısı üretmek gibi örnekleri ~ 15 dk,-80 ° C dondurucuya koyun.
  8. 1.5-1.7 adımları yineleyin.
    Not: örnekleri lizis yordam soğuk kalmak emin olun.
  9. 4000 x g 5 min, 4 ° c için de örnekler santrifüj kapasitesi Bu noktada, örnek üst metaboliti katmanı, protein interlayer ve daha düşük lipit katmanı (ve kalan enkaz Pelet) ayrılacaktır. Bkz: Şekil 1.
  10. Buz buz kovası içinde örnekleri yerleştirin ve duman kukuIeta ve 10 mL Cam serolojik pipet kullanarak içinde üst metaboliti katmanları bir büyük cam şişe iki 50 mL tüpler kaldırın.
    Not: herhangi bir protein tabakası pipet aspirating kaçının; metaboliti küçük tabakası bırakın.
  11. Böylece ücretsiz düşük lipit katmanı üzerinde yüzen olduğunu protein interlayer serbest bırakmak için 50 mL tüp biraz eğ. Bir temiz paslanmaz çelik düz kafalı laboratuvar spatula kullanarak, dikkatli bir şekilde protein interlayers her iki kepçe ve birlikte bir yeni 50 mL tüp içine koyun.
  12. 25 mL Cam serolojik pipet kullanarak, alt lipid katmanları bir büyük cam şişe kaldırın.
    Not: kalkınan toprak parçacıklar kaçınıyorum; Ancak, bazı toprak enkaz ve parçacıklar ile birlikte talip lipidler daha sonra kaldırılacak.
  13. Metaboliti ve lipid tepesinden solunabilir membranlar cam şişeleri ve bir vakum yoğunlaştırıcı kuruluk kadar kuru bir yer (lipidler ~ 4-5 h, metabolitleri gecede).
  14. Protein örnek tüp ve kalan enkaz Pelet tüpler için her buz gibi metanol ve girdap 20 mL ekleyin. Bu enkaz dışında herhangi bir olası kalan protein savurma daha önce solubilize girişiminde bulunmadan önce kloroform durulama için enkaz parçaları için yapılır.
  15. Enkaz parçaları ve protein 4.000 x g 5 min, 4 ° C, için de interlayer sonra metanol tehlikeli atık konteyner içinde duman kukuIeta içine dikkatle boşaltmak santrifüj.
  16. Sıvı azot protein ve enkaz parçaları donma ve bir lyophilizer (bir toplayıcı sıcaklığı-105 ° C metanol-98 ° c çok düşük donma noktası olması nedeniyle yeteneğine ile) Kuru ~ 2 saat için.
    Not: onlar daha solubilize zor olacak gibi granül, aşırı kuru değil.
  17. Protein solubilization arabellek (%4 SDS, 100 mM DTT (DL-dithiothreitol) 50 mM tris tampon pH 8.0; bkz: Ek reaktif Set-up) 10 mL protein interlayer tüp ve 20 mL her enkaz parçaları ekleyin.
    Dikkat: SDS akut toksisite neden olur ve yanıcı. Cilt, göz ve hava yolu tahriş edici olduğunu. Eldiven ve koruyucu gözlük giymek.
  18. Duman başlık, sonda solüsyon içeren temizleyicide örnekleri için %30 20 genlik, onları çözümü haline getirmek için s. 2 min için girdap.
  19. Protein interlayer örnek protein solubilize için bir laboratuvar tüpü rotator 300 rpm, 50 ° C'de 30 dk için içine yerleştirin.
  20. Yatay olarak girdap enkaz örnekleri için kalan sağlam hücreler, koşullar için ek bir 10 dk sonra döndürün kalan 20 dk için protein interlayer örnekleri ile.
  21. Tüm örnekleri, 4500 x g 10 dk, oda sıcaklığında (RT), santrifüj kapasitesi ve süpernatant her tüpün örnek başına iki 50 mL tüpler içine toplamak.
  22. Solubilization 10 mL protein interlayer Pelet tampon, sonra da solüsyon içeren temizleyicide ve girdap geri çözüm ve santrifüj daha önce olduğu gibi ekleyin.
  23. Supernatants iki 50 mL tüpler içine eşit birleştirmek ve 8.000 x g 10 dk, sabit açılı kova Open End 4 ° C de santrifüj kapasitesi.
    Not: Son Santrifüjü Aşırı bulaşıcı hümik maddelerin kaldırmak gereklidir.
  24. Böylece her 30 mL her supernatants iki 50 mL tüpler içine dikkatle boşaltmak. Ardından, bir 10 mL Cam serolojik pipet kullanarak TCA (trichloroacetic asit) 7.5 mL her tüp için ekleyin. Girdap içine çözüm. Bu % 20 yapar TCA her 30 mL örnek (buna göre ayarlayın),
    Dikkat: Bu TCA kostik, toksik ve Mayıs cilt yanıklara neden. Eldiven ve koruyucu gözlük giymek.
  25. Örnekleri-20 ° C-dondurucu gece 2 h için yerleştirin.
    Not: Proteinler genellikle içinde 1 h çökelti ama sol (en fazla 18 saat) gece olabilir.
    Not: 18 h protein mümkün asit hidroliz nedeniyle daha uzun süre gitmek TCA ayıklama izin vermeyin. Örnek donmuş, buz çözme; tezcan ısınmak örnek izin vermeyin.
  26. Çöktürülmüş protein cips için 4500 x g 10 dk, 4 ° C için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant içine atık dikkatle boşaltmak.
  27. 10 mL % 100 buz gibi soğuk aseton her protein Pelet, girdap ve birleştirme parçaları gibi bir tüpün içine ekleyin.
  28. (Bir denge kullanarak) kombine Pelet içeren tüp santrifüj kapasitesi ve sonra içine atık süpernatant dikkatle boşaltmak.
    Dikkat: Aseton solunum yolu ve deri ve göz tahrişine neden olabilir ve bir yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük eldiven ve önlük giymek, duman mahallede çalışma.
  29. İki kez 1.5 mL aseton ve son olarak 2 mL tüp 10.000 x g 5 min için de son tur için aktarılması kullanarak Pelet yıkayın.
  30. Süpernatant içine atık dikkatle boşaltmak ve Pelet biraz çatlamak başlayana kadar kurumaya Pelet ters bir duman başlıklı ~ 20 dakika veya azot akış altında kağıt mendil izin.
  31. 100-200 µL Pelet büyüklüğüne bağlı olarak protein solubilization arabellek ekleyin.
    Not: solubilization arabellek mümkün olduğunca düşük örnek eklenen ses tutun. Sonraki filtre destekli örnek hazırlama (FASP) sadece 50 μL örnek sütun başına çözündürüldükten kadar kullanabilirsiniz; herhangi daha birden fazla FASP sütuna bölün olması gerekir.
  32. Solüsyon içeren temizleyicide ve girdap Pelet çözüm içine. Not örnek viskoz hümik maddelerin bir sonraki Santrifüjü ile kaldırılacak protein birlikte presipite nedeniyle olabilir.
  33. Örnek protein çözüm solubilize ve protein sindirimi için devam etmek için bir kuluçka makinesi/Shaker 300 rpm, 40 ° C'de 30 dk için salla.
  34. Ek dondur örnek sıvı azot ve-80 ° C dondurucu store kadar protein sindirimi için hazır.

2. lipid hazırlık (~ 20 dk zamanlama)

  1. Lipid örnekleri kuru olduğunda, 2:1 kloroform: metanol için şişe, girdap içine çözüm ve transfer 1,5 mL polipropilen boru içine 200 μL ek bir 200 μL cam ekleyin şişe, girdap ve kalan lipidler pipette ve transfer tüp.
  2. Enkaz 12.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek dışında santrifüj kapasitesi
  3. Süpernatant içine bir cam lipid flakon ve mağaza-20 ° C'de LC-MS/MS Analizi (daha fazla bilgi için Ek yöntemlerLC-MS/MS) kadar transfer.
  4. Örnekleri hemen hazırlık sonra analiz, lipitler solvent oksidasyon ve yıkımı önlemek için-20 ° C'de depolanması gerekir.

3. metaboliti hazırlık ve Derivatization (~ 5 h zamanlama)

  1. Çıkarma ertesi günü üzerinde hız Vac metaboliti örnekleri çıkarın ve hazır için derivatization ve GC analizine kadar-20 ° C'de kuru saklayın. Aksi takdirde bir GC metabolitleri çalıştıran sonra araç için uygun iletişim kuralını kullanarak hazırlamak.
  2. Hemen önce saptırma metabolitleri GC, çözümleme için transfer büyük cam şişeleri metanol, vortexing ve 1,5 mL polipropilen boru ekleme 200 μL ekleyerek. Bir kez yinelenir.
  3. 12.000 x g 10 dk, 4 ° c de tüp santrifüj kapasitesi Süpernatant daha küçük cam şişe aktarmak, top ve tamamen kuru bir hız Vac içinde nefes alabilen bir membran ekleyin.
  4. Örnek flakon ve 30 için girdap methoxyamine çözüm 20 µL ekleyerek metabolitleri derivatize orta hızda bir vortexer s.
    Dikkat: Methoxyamine hidroklorid ciddi yanıklar ve gözleri ciddi hasara neden olur, sensitizasyon Ciltle temas tarafından neden olabilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve önlük giymek ve duman mahallede iş.
  5. Bir banyo sonicator örnek tamamen çözülmüş emin olmak için kullanın.
  6. 1000 sallayarak d / 1 saat 30 dk için 37 ° C'de tutulan bir yoğunlaşma önleme kapak ile örnek bir kuluçka kuluçkaya.
  7. Şişeyi kap yüzeyinde yoğun damla ile örnekleri karıştırmak için bir kez ters çevir. Örnek spin aşağı vasıl 1000 x g 1 dk, RT.
  8. Silylation (kullanarak) 80 µL n ekleyerek gerçekleştirmek-metil - N-(trimethylsilyl) % 1'i trimethylchlorosilane ile trifluoroacetamide. 10'lar için girdap.
    Dikkat: MSTFA + %1 TMCS cilt korozyon, ciddi göz hasarı ve belirli hedef organ toksisite neden olabilir ve bir yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük, eldiven ve önlük giymek ve duman mahallede iş.
  9. 1000 sallayarak d / 30 dk 37 ° C'de tutulan bir yoğunlaşma önleme kapak ile örnek bir kuluçka kuluçkaya.
  10. Şişeyi kap yüzeyinde yoğun damla ile örnekleri karıştırmak için bir kez ters çevir.
  11. Spin 2.000 x g, RT, 5 min için aşağı örnek
  12. Tepki çözüm şişeleri GC-MS analiz için uygun içine aktarın.

4. protein sindirimi (~ 1 d zamanlama)

  1. 15.000 x g 5 min, RT herhangi bir enkaz cips, için de örnek santrifüj kapasitesi.
  2. (Bkz. Tablo reçetesi) FASP kullanarak sindirim kitleri için filtre-destekli-örnek-hazırlık (FASP) gerçekleştirmek aşağıdaki değiştirilmiş üreticisinin yönergeleri31,32:
    1. 8 M üre arabelleği 400 μL FASP sütuna (500 μL 30 K MWCO spin filtre) ekleyin.
    2. Örnek centrifuging sona erdiğinde süpernatant (Pelet silmek) pipet ve en fazla 50 μL örnek 400 μL 8 M üre sütun ekleyin.
      Not: yalnızca 50 μL örnek sütun başına ekleyin. 50'den fazla μL örnek ise, birden çok sütun kullan ve peptidler sindirim sonra birleştirir. Bu birimin mümkün olduğunca düşük bırakmak en iyisi (30 µL idealdir) FASP sağlamak için sütun tüm kitle spec analizi ile önemli ölçüde etkileyebilir SDS kaldırmak.
    3. Sütun dahil 1.5 mL tüp içine yerleştirin ve 14.000 x g 30 dk, RT için de örnek santrifüj kapasitesi
    4. Akış yoluyla içine atık kaldırmak ve 8 M üre 400 μL sütununu ekleyin ve tekrar santrifüj kapasitesi.
    5. Önceki adımı 3 üre durular toplam için bir kez daha yineleyin.
      Not: Eğer varsa örnek gider kuruluk yakın sütun, emin olun daha fazla ~ 30 µL filtre her spin sonra kalan devam centrifuging.
    6. 14.000 x g 20 dk için 50 mM NH4HCO3 ve santrifüj 400 μL ekleyin, atık atmak ve bir kez yinelenir.
    7. Sütunları bir temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarın.
    8. 75 μL tripsin sindirim arabelleği için sütunları ekleyin ve 750 rpm bir buğu önleme kapaklı bir kuluçka 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    9. 50 mM NH4HCO3 40 µL için sütunları ekleyin.
    10. 14.000 x g yüksek molekül ağırlıklı kirletici sütun üzerine tutarken tüpün içine peptidler toplamak 15 dakika da örneğine santrifüj kapasitesi.
    11. 40 μL 50 mM NH4HCO3 sütun ve santrifüj yeniden ekleyin.
  3. Sütun atmak, peptidler hız Vac ~ 30 µL ve BCA tahlil (Bicinchoninic asit protein tahlil kiti; bkz: Malzemeler tablo) tüp içinde aşağı peptidler Makinası.
  4. SDS kirlenme (görünür kabarcıklar)33şüphesi varsa isteğe bağlı olarak, bir temizlik adımı gerçekleştirin. Katı faz ayıklama daha sonra bu seçeneği belirlemek Eğer yapmanız gerekir. Bu temizlik yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi için Ek yöntemlerkullanılabilir.
  5. MS analizi için örnek seyreltik veya HPLC ayırma (sonraki iki adımı) isteğe bağlı olarak devam.
  6. Fractionate için örnekleri 10 mM amonyum Formiat arabelleği (pH 10.0) ile 400 µL hacmiyle oranında seyreltin.
  7. Bir C18 sütun çözümlemek ( Tablo malzemelerigörmek) 0.5 mL/dk bir HPLC sistemi kullanarak mobil aşamaları (A) 10 mM amonyum format, pH 10.0 ve (B) 10 mM amonyum format, pH 10.0/Asetonitril (10:90) ayıran tarafından.
    1. Min 10-70 %65 A % 30 a üzerinden en az 70 ila 85, % 30 A dk 85-95 üzerinden korumak üzerinde degradenin üzerinde ilk 10 dk, %95 A % 95'a e A % %100 65'a ayarlayın.
    2. Min 95 den 105 üzerinden %100 A ile yeniden equilibrate ve A % 100 dk 120 kadar tutun.
    3. Kesirler her 1,25 min (96 kesirler üzerinden tüm degrade) toplamak ve nihayet her satır için toplam 12 örnekleri veya her iki satırdan 24 örnekleri için birleştirmek (her biri n = 8 veya n 4 kesirler havuza alınmış =).
  8. Vakum altında tüm kesirler kuru ve LC-MS/MS Analizi kadar her depolama-20 ° C'de 15 µL ultrasaf su ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molekülleri Kansas yerel kır topraktan (Mollisol toprak) ayıklamak için karmaşık iletişim kuralı kullanıldığında, ineklemek analizleri sonuçları 3376 peptidler, 105 lipidler ve 102 kutup metabolitleri (tüm benzersiz kimlikleri) için sağlanan. Süre karmaşık iletişim kuralı lipidler ve metabolitleri12,13,14,15,16,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli yöntemleri, örneğin lizis adım, adapte edilebilir böylece tüm laboratuvarlar aynı kullanılabilir donanım olduğunu unutmamak gerekir. Burada kullanıyoruz vortexing ve sonicating, ancak bir büyük 50 mL boncuk çırpıcı kullanımı işe yarar. Bir toplayıcı sıcaklığı-105 ° C yetenekli bir lyophilizer yoksa, o zaman örnekleri bir azot akış altında kurutulmuş. Ayrıca toprak türleri çok çeşitli ve kum, silt, kil, torf ve kerpiç (vb) içerebilir ve onlar da pH, tuzluluk ve organik madde zenginlik göre değişebilir. Es...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Nathan Johnson rakamlar hazırlarken onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Enerji Bakanlığı'nın Office biyolojik ve çevresel araştırma (genom bilim programı), Microbiomes geçiş (nane) laboratuvar yönelik araştırma geliştirme tarafından finanse Pan-omics Program tarafından desteklenmiştir Pacific Northwest National Laboratory, hem de ulusal kurumları, Sağlık Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (R01 ES022190) girişimi ve NIH (P42 ES027704). KEBJ R21 HD084788 geliştirmek ve yeni multi-omic ayıklama teknikleri doğrulamak finansal destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser içinde W. R. Wiley çevre moleküler Bilimleri Laboratuvarı (EMSL), DOE Ulusal bilimsel Kullanıcı olanağı Pacific Northwest Ulusal Laboratuvarı (PNNL) adlı gerçekleştirildi. PNNL için sözleşme DE-AC06-76RL01830 altında DOE Battelle tarafından işletilen bir çok program Ulusal laboratuvardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KloroformSigma-Aldrich650498-20 ° C'de saklanır; C ! Dikkat kloroformun akut potansiyel sağlık etkileri, cilt tahrişi ve olası kimyasal yanıklar, solunum sisteminde tahriş vardır, böbrekleri, karaciğeri, kalbi etkileyebilir. Uygun koruyucu gözlük, giysi ve eldiven giyin, çeker ocakta çalışın.
MetanolSigma-Aldrich34860-20 ° C'de saklanır; C ! Dikkat Metanol solunum yolu, cilt ve göz tahrişine neden olabilir, sinirlere, böbreklere ve karaciğere zarar verebilir. Uygun koruyucu gözlük, giysi ve eldiven giyin, çeker ocakta çalışın.
Milli-QSu arıtma sistemindenarıtılmış su
Sodyum dodesil sülfatSigma-AldrichL6026! Dikkat: SDS akut toksisiteye neden olur ve yanıcıdır. Cildi, gözü ve solunum yollarını tahriş eder. Eldiven ve koruyucu gözlük takın.
Toprak proteini ekstraksiyon kitiMoBio, NoviPure Toprak Proteini Ekstraksiyon Kiti, Qiagen30000-20
DL-dithiothreitolSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
Trikloroasetik asitSigma-AldrichT0699! Dikkat: TCA yakıcıdır, toksiktir ve cilt yanıklarına neden olabilir. Eldiven ve koruyucu gözlük takın.
AsetonSigma-Aldrich650501-20 ° C'de saklanır; C ! Dikkat: Aseton solunum yollarına, cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin, çeker ocakta çalışın.
ÜreSigma-Aldrich208884! Dikkat Üre göz ve cildi tahriş eder, eldiven ve koruyucu gözlük kullanın
Amonyum bikarbonatFluka09830
TripsinPromegaV528A20&mikro; g şişeleri
Biskintoninik asit protein test kitiPierce23227
Amonyum FormatSigma-Aldrich09735
AsetonitrilSigma-Aldrich34998! Dikkat: Asetonitril cildi ve gözü tahriş eder. Son derece yanıcı. Eldiven ve koruyucu gözlük takın. Çeker ocakta çalışın.
Trifloroasetik asitSigma-AldrichT6508! Dikkat: TFA, cilt teması, göz teması, yutulması ve solunması durumunda son derece tehlikelidir. Özellikle göz, ağız ve solunum yollarının mukozalarında doku hasarına neden olabilir. Cilt teması yanıklara neden olabilir. Eldiven, laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük takın ve çeker ocakta çalışın.
Metoksiamin hidroklorürSigma-Aldrich226904! Dikkat: Metoksiamin hidroklorür ciddi yanıklara ve gözlerde ciddi hasara neden olur, cilt temasında hassasiyete neden olabilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin, çeker ocakta çalışın.
PiridinSigma-Aldrich270970! Dikkat: Piridin cilt ve göz tahrişine, merkezi sinir sistemi depresyonuna neden olabilir. Buhar ani yangına neden olabilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin, çeker ocakta çalışın.
Sigma-Aldrich69478ile N-Metil-N-(trimetilsilil) trifloroasetamid! Dikkat MSTFA +% 1 TMCS cilt korozyonuna, ciddi göz hasarına ve spesifik hedef organ toksisitesine neden olabilir. Yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin, çeker ocakta çalışın.
Potasyum klorürSigma-AldrichP9541
Milli-Q su arıtma sistemiMilliporemodeli MPGP04001
VortexScientific IndustriesSI-0236Vortex Genie 2
Prob sonikatörüFisherBrandmodeli FB505
Soğutmalı santrifüjEppendorfmodel 5810R
50mL tüp sallanan kova rotoruEppendorfA-4-44
50 mL sabit açılı rotorEppendorfFA-45-6-30
DengeOHAUSmodeli V22PWE150IT
Serolojik pipet kontrolörüEppendorf12-654-100
10 mL, 25 mL cam serolojik pipetlerFisherBrand13-678-27F, 13-678-36D
Termomikser ThermotopEppendorf5382000015, 5308000003
0,9 & ndash 2,0 mm karışımlı paslanmaz çelik boncuklarNextAdvanceSSB14B
0,15 mm granat boncuklarMoBio13122-500
Manyetik karıştırma plakasıFisherBrand11-100-16SH
Manyetik karıştırma çubuğuFisherBrand14512130
pH kağıt şeritler, pH aralık 0– 14FisherBrandM95903
15 mL, 50 mL konik polipropilen santrifüj tüpüGenesee Scientific21-103 21-108kloroform uyumlu
50 mL girdap ekiMoBio13000-V1-50
Buz kovasıFisherBrand02-591-44
27.25x70mm cam şişelerFisherBrand03-339-22K
Nefes Daha kolay plaka membranlarıMidwest ScientificBERM-2000
Alkollü mendillerÇeşitlendirilmiş BiyoteknolojiBPWP-1000
Isıtıcı çalkalayıcı inkübatörBenchmark, Incu-Shaker Mini
Analog döner tüp döndürücüSoCal BioMed, LLC82422001
Filtre Destekli Numune Hazırlama kitiFASP; Expedeon44250
Mikroplaka okuyucuBiotek, EPOCH-20
Derece Santigrat DondurucuFisher13986149-80
Derece Santigrat DondurucuStirling UltracoldSU78OUE
Q-Exactive iyon tuzağı kütle spektrometresiThermo Scientific
Agilent 7890A gaz kromatografı tek bir dört kutuplu ile birleştirilmiş 5975C kütle spektrometresiAgilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo ThermoScientific
Waters NanoEquityTM UPLC sistemiMillford, MA
250 mL medya şişesiFisherBrand1395-250
Su şişesiSular186002805
Cam MS numune şişesi ve eklerMicroSolv9502S-WCV, 9502S-02ND
Cam HPLC flakon ve çıtçıtlı kapaklarMicroSolv9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96 kuyulu plakaAgilent5042-6454
Büyük cam şişe 27.25x70mmFisherBrand03-339-22K
LiyofilizatörLabconco7934021
Cilalı paslanmaz çelik düz başlı spatulaSpoonula; FisherBrand14-375-10
Kim,Kimberly-Clark34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 & 4.6x20 mm koruma kolonlu MWaters186003117, 186003064
Agilent 1100 serisi HPLC sistemiAgilent TechnologiesG1380-90000
1.7mL santrifüj tüpüSorenson11700
Hamilton Cam Şırıngalar, 5mL, 50 & mikro; L ve 250 & mikro; LHamilton81517, 80975, 81175
Pastör PipetleriFisherBrand13-678-20A
Pasteur PipetAmpulleri Sigma-AldrichZ111597
Banyo SonikatörüBranson 1800 Ultrasonik Temizleyici
Vakum SantrifüjüLabconco Centrivap Aside Dayanıklı Konsantratör Sistemi
MicroSpin Sütunları, C18 SilikaYuva GrubuSEM SS18V
Millipore .%1 trimetilklorosilan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
  3. White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
  4. Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
  5. Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
  7. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
  8. Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
  10. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
  11. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  12. Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138(2016).
  13. Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
  14. Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
  15. Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
  16. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209(2015).
  17. Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188(2015).
  18. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
  19. Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155(2013).
  20. Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
  21. Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
  22. Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558(2012).
  23. Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
  24. Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584(2012).
  25. Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
  26. Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
  27. Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719(2010).
  28. Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
  29. Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
  30. Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
  31. Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
  32. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
  33. Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
  34. Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
  35. Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
  36. Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
  37. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277(2014).
  38. Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
  39. Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multi omik AnalizToprak rne i EkstraksiyonuMetabolit Protein Lipid EkstraksiyonuKloroform Metanol EkstraksiyonuProtein Ara Katman zolasyonuSantrif jle Ay rmaProb Sonikasyonueker Ocak lemiS v Azotla Dondurma

İlgili makaleler