Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Memelilerde nöronal aktivite içinde ve beyin bölgeleri^1,2,3,4arasında bilgi aktarımı yardımcı ağ salınımları tarafından koordine edilmektedir. Beyin ritimleri salınımları çok yavaş (< 0.8 Hz) kadar ultrafast (> 200 Hz) Frekanslar arasında değişen içerir. Kanıt büyük gövdeli ağ salınımlarını katılımı biliş^{5,6,7,8,9,10 da dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyonları destekler.} , yanı sıra Parkinson hastalığı ve epilepsi^13,14,15gibi Nöropsikiyatrik bozukluklar doğuştan gelen davranışları^11,12 . Ağ salınımlarını deneysel manipülasyon için seçici ve geçici kesin yöntemleri bu nedenle eşitleme fizyolojik açıdan makul modellerinin geliştirilmesi için ve davranış ile nedensel bağlantılar kurmak için gereklidir.

Ağ eşitlemesi farklı biyolojik yüzeylerde ve iyon kanalları moleküler kimliğini ve onların kinetik için uyarılabilirlik ve ağ bağlantısı neuromodulation kadar geniş süreçleri tarafından aracılık ettiği. Biyolojik ritim ortaya¹⁶ jeneratörleri birçok beyin ritimleri, hangi (Örneğin, frekans, genlik) farklı yönleri için çoğu kez tasarımını farklı hücre tipleri ve ağlar dinamikleri hakkında getirdi. Örneğin, asıl hücreler somata hedefleme inhibitör interneurons en önemli oyuncular frekans bantlarında ve Teta^19,20, gama²⁰ beyin bölgeleri^17,dahil¹⁸, vardır ^{, 21}ve dalgalanma (140-200 Hz)²² titreşimler. Buna karşılık, Aşama eşitlemesi uzak hücre sağlam besleme ileri piramit hücrelerinin interneurons ateş sıfırlayan sinyal tarafından sağlanmaktadır. Titreşimler, eşitlenmiş nöronal nüfus büyüklüğü önemli bir parametre için ölçülen LFP salınım'ın genlik yakından ilgilidir ve en az hızlı salınım için interneurons²eksitatör diske bağlıdır. Buna ek olarak, delta ve Teta ritimleri, gibi daha yavaş salınım kortiko-talamik^23,24 ve medial hipokampal septal projeksiyonlar^25, oluşturduğu uzun menzilli desteklemeyeceğini döngüler tarafından oluşturulan ^26,27, anılan sıraya göre. Salınımlarını böyle devrelerde sinyal yayma gecikmeler, heyecanlı yanıt ve katılımcı hücreleri^28,29,30, içinde onların frekans tercih etkileşimler tarafından getirilen ^{31 , 32}. GABAergic parvalbumin (PV) inhibitör projeksiyonlar-pozitif hücreler interneurons hipokampus^25,33, parahipokampal bölge ve entorhinal korteks²⁶ için medial septum (MS) Teta salınımlarını medial temporal lob üretimi için gerekli. Böylece, ağ salınımlar ve nöronal eşitleme fizyolojik mekanizmaları optogenetics gerçek zamanlı bir hassasiyetle kullanarak manipüle edilebilir.

Hücre türüne özgü optogenetic manipülasyonlar hipokampal ve kortikal salınımlarını vitro^{34,35,36,37,38} ve çalışmaları için uygulanan içinde vivofonksiyonel dahil olmak üzere^{30,39,40,41,42,43,44,45}, araştırmalar gama^{5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52} ve dalgalanma salınımlarını^40,53,54 ve uyku iğlik^55,56. Son zamanlarda Cre-bağımlı ChR2 virüs PV-Cre fareler MS bir anahtar bölge hipokampal teta ritim, nesil için dile getirdi. Bu hazırlık kullanarak, hipokampal teta salınımları (frekans ve zamansal istikrar) özelliklerini hipokampus¹¹MS inhibitör projeksiyonlar uyarılması optogenetic tarafından kontrol. Ayrıca, inhibitör septo-hipokampal projeksiyonlar teta-frekans optogenetic uyarılması sırasında uyanık hareketsizlik teta ritim uyarılmış. Optogenetically spontan teta salınımlarını LFP ve nöronal aktivite düzeyine Mouse teta ritim görüntülenen özelliklerini entrained.

Bu protokolün temel özellikleri şunlardır: (1) hipokampal uyarılabilirlik; belirsiz etkileri kaçınırken spontan teta salınım için fizyolojik açıdan kritik bir inhibitör yolu kullanımı (2) aksonlar, yani, projeksiyon özel uyarı hipokampal MS efferents üzerinde; doğrudan bir etkisi en aza indirmek için (3) teta-ritmik septo-hipokampal dinamikleri ve Teta salınımlarını bir küresel ikili sürüklenme ile en az bir doğrudan müdahale sağlamak yerel teta-ritmik ışık stimülasyon, (4) teta salınım frekansı ve düzenlilik parametrik kontrolü; ve hayvan davranış içinde nicel Nedensellik analizi sağlamak için LFP sürüklenme sadakat yüksek zamansal çözünürlük ile (5) miktar kullanarak. Bu hazırlık aslında teta üretimi^25,30septo-hipokampal Disinhibisyonu olan tanınmış bir rolüne büyük yapar bu yana, teta salınımlarını davranıyor farelerde çeşitli parametreleri üzerinde sağlam kontrol sağlar. Diğer daha az incelenen yolları ve hücre tipleri septo-hipokampal devresi neredeydin çalışmalar^{38,39,47,49,50,51} manipüle ^{, 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} ortaya daha fazla teta ritim mekanizmaları.

PV-Cre çakma erkek fareler⁵⁹, 10-25 haftalık kullanılmıştır. Fareler hayvan tesiste standart koşullar altında yer alan ve bir 12 h açık/koyu döngüsü devam etti. Tüm yordamlar ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilen ve (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen) yerel sağlık otoriteleri tarafından kabul edildi.

1. viral enjeksiyon

1. Tüm prosedürü sırasında biyolojik güvenlik yönergeleri⁶⁰izleyin. Laboratuvar önlüğü, ameliyat maskesi, bir saç filesi ve iki çift eldiven giymek.
2. Tüp bir steril neşter veya makas ile yaklaşık 1 m boy kesme, Pompa enjektör sahibi Blok Ekle ve düzeltebilirim.
   1. Tüp şırınga kullanarak tamamen silikon yağı ile doldurun.
   2. Hava kabarcıkları boru içinde görünüp görünmediğini kontrol edin. Hava kabarcıkları gözlenir, tüp yağı ile tekrar tekrar doldur.
   3. İtici blok fırlatıcıya düzeltmek.
   4. Pistonu tüp dokunduğundan kadar yavaş yavaş itici tenkıye tutucusu blok doğru ilerlemek.
   5. Pistonu ucu tüp içine yerleştirin ve otomatik olarak ileri itici blok tenkıye tutucusu blok ulaşıncaya kadar "Infuse" komut penceresi ve düşük infüzyon hızı (Örneğin, 500 nL/dk) seçerek yavaş bir hızda hareket.
3. Enjeksiyon iğne (34 G) hazırlayın.
   1. Hassas matkap/değirmeni bir kesim diske bağlı kullanarak açık bir kesim ile iğne hub kaldırın. Gerekirse, metal artıkları taze kesilmiş yüzeyden kaldırmak için bir iğne kullanın.
   2. Kılcal boru (3-4 cm uzunluk) iğne iplik.
   3. Tüp için iğne ile süper yapıştırıcı tutkal.
   4. Microsyringe pompa bağlanır hortumunun sonuna enjeksiyon iğne bağlayın.
4. İğne stereotaksik sahibine iliştirin.
5. İğne üstünde saydam tüp içinde bir hava kabarcığı görünene kadar hava geri alıyorum.
6. Fare ile 1.5-%3 isoflurane oksijen anestezi. Yaklaşık 2-3 dakika bekleyin, sonra onun yanıt-e doğru ayak parmağı çimdik değerlendirmek tarafından fare tam anestezi onaylayın. Ameliyat boyunca hayvanın nefes izlemek ve gerekirse isoflurane konsantrasyon ayarlayın.
7. Fareyi kullanarak travmatik olmayan kulak sahipleri stereotaksik çerçevesine yerleştirin.
8. Fare bir lipid jel ile gözleri koruyun.
9. 0.1 mL lidokain intradermally küçük bir 0,01-1 kullanarak baş cilt enjekte mL şırınga ve 26G Enjeksiyon kanül.
10. Tıraş ve etanol çözüm kullanarak fare kafa dezenfekte. O zaman üç kez %2 KLORHEKSİDİN cerrahi sitesi dezenfekte için etanol ile alternatif.
11. Bregma ve lambda görünecek şekilde kulak arkası arasından göz seviyesine mi ince ve keskin makas kullanarak bir ensizyon gerçekleştirin.
12. Bir Ģırınga kullanarak NaCl yaklaşık 50 µL uygulayarak kafatası temiz ve kuru kağıt mendil ve bir hava üfle.
13. Fare kafa bregma ve lambda aynı dorso-ventral düzeyde böylece burun kıskacı dorso-ventral düzeyini ayarlayarak konumlandırın (± 0,3 mm).
14. MS (AP 0,98 ve L bregma referans olarak 0,5 mm) yukarıda bir delik.
15. Bu noktada, bir aliquot ( AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40en az 2 µL içermelidir) virüs (RT) Oda sıcaklığında yaklaşık 5 min için çözdürün.
16. 1 dk. için RT de yaklaşık 4.000 x g, aliquot santrifüj kapasitesi.
17. Pipet virüs Parafilm bir parça üzerine 2 µL; daha önce korumalı yan kullanın.
18. Sıvı enjeksiyon iğne ucu daldırın ve dikkatli bir şekilde kesilmediğini gözleyerek sıvı düzeyini yaklaşık 500 nL/dk az tutar. Hava emme önlemek için virüs tamamen alınır önce para çekme durdurun. Çözüm viskozite göre geri hızını ayarlama; hızlı bir virüs geri çekilmesi ile daha yüksek viskozite kolaylaştırabilir.
19. Kağıt mendil iğneyle temiz.
20. Virüs tüp yer alıyor ve virüs ve petrol bir hava kabarcığı tarafından ayrılır emin olun. Virüs enjeksiyon sırasında başarıyla infüzyon olup olmadığını denetlemek için virüs tüp düzeyini işaretlemek.
21. Kranyotomi yukarıda iğne yerleştirin ve yavaş yavaş beyin ilk enjeksiyon noktada (AP 0,98, L 0.5, V-5.2, 5.5 ° lateral) takın.
22. 450 enjekte nL 100-150 nL/dak 10 dk bekle oranında şunun dikkatle iğne 0,1 mm yukarı taşımak ve başka bir 5 dakika bekleyin.
    1. İğne ikinci enjeksiyon noktaya (AP 0,98, L 0.5, V -4,6) taşıyın ve başka bir 450 enjekte nL 100-150 nL/dk.
    2. İğneyi 0,1 mm. kadar geçmeden önce 10 dakika için tekrar bekle başka bir 5 dk iğne çıkarmadan önce.
23. Belgili tanımlık kesme kare knot kullanarak dikiş ipek siyah örgülü dikiş. Hayvan kurtarma hızlandırmak için kırmızı bir lamba ile sıcak. Antibiyotikler (0.3 mL Erycinum (1:4 steril NaCl)) ve carprofen IP günlük 2-3 gün ameliyat sonrası yönetmek.
24. Virüs düzeyini belirtilen işareti yukarıda tüp kesti. Tüp daha fazla enjeksiyon için kullanılabilir. Daha önce her iğne taze enjeksiyon iğne hazırlayın.
    Not: Bu ameliyatı yaklaşık 1-1.5 saat sürer. Hayvan ameliyattan sonra genellikle 5 dk içinde uyanır. En az beklemek yeterli aksonal ifade için 6 haftalık zaman ama değil ifade düzeyleri yaklaşık 6 ay sonra virüs enjeksiyon azaltmak başladığınızda stereotaksik takılan, gerçekleştirmeden önce 5 ay daha uzun.

2. optik fiberler (Şekil 1A) hazırlanması

1. Multimod optik fiber (105 µm çekirdek, silis çekirdek, 0,22 NA ile kaplı cam) kullanın. Şerit 125 µm kaplama lif lif biriktirme hâlâ bağlı mikro striptizci kullanarak fiber çekirdekli.
2. Fiber bir elmas bıçak kullanarak yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda için kesti.
3. Fiber bir zirkon seramik sopa yüksük Ekle (ID: 126 µm). Yaklaşık 0,5-1 mm optik fiber yüksük dışbükey taraftan çıkıntı.
4. Bir iğne kullanarak, epoksi tutkal bir damla her iki uçtan yüksük ama değil üzerine yüksük kenarlarına uygulanır. Alternatif olarak, süper yapıştırıcı kullanın.
5. Tutkal için en az 30 dakika kurumasını sağlar.
6. Film (3 µm Mısır ezmesi) parlatma fiber alıştırma elmas kullanarak yüksük dışbükey tarafında Lehçe.
7. Bir optik güç metre kullanılarak ışık aktarımını sadakat testi.
   1. Dalga boyu güç metre olarak kullanılan lazer aynı dalga boyu için ayarlayın.
   2. Yama kablosu ucunu sensör ortasına bakacak şekilde yerleştirin. Lazer ve okuma güç metre hafif çıktısı gücüyle. Değeri kaydedin.
   3. Optik fiber üzerinden bir çiftleşme kol yama kablosu bağlayın ve sensör ortasına bakacak şekilde fiber ucu ile konumlandırın. Lazer ve okuma güç metre hafif çıktısı gücüyle. Değeri kaydedin.
   4. Aktarım hızını hesaplamak: ikinci değeri ilk değerle bölün. İletim hızı 0.5 ise, fiber atmak, aksi halde implantasyon için kullanın.
   5. İmplantasyondan önce her lif için aktarım hızını test.
   6. Daha sonraki deneyler için optik fiber iletim hızı için lazer ışık şiddeti çıkışını ayarlayın: 5-15 5-15 mW fiber ucundan son ışık verimi elde etmek için iletim hızına göre bölünmüş için yama kablosu uç--dan ışık çıkışını ayarlayın.
      Not: Ayrıca ref. ⁶¹ optik lifler hazırlanması için bkz.

3. hazırlık Tungsten Tel diziler LFP için kayıtları (Şekil 1B)

1. Birkaç (örneğin 6) tutkal 100 µm silis tüp kılavuzları paralel yapışkan bant parçası tarafına. Bir parça, bir kablo dizi derleme için yaklaşık 4-6 mm kesme.
2. Formvar izolasyonlu 45 µm tungsten teller forseps kullanarak Kılavuzu tüpler aracılığıyla iş parçacığı.
3. Teller (yaklaşık 5 mm uzun) ve topraklama tel (yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda) uzakta her iki ucunda yalıtım kazımak için neşterden kullanarak Yapıştırma şeridi altı emaye izolasyonlu ince bakır. Onları nanoconnector pins lehim.
4. Her bağ tel Gümüş iletken boya, bir damla sırasıyla kullanarak bir tungsten tel bağlayın. En az 30 dk kurumaya bırakın.
5. Çimento kabloları kapsayacak şekilde en az miktarda uygulayın. Çimento beyin dokusunda veya nanoconnector üst kısmında eklenecek tungsten teller üzerinde geçerli değil. İzin için en az 30 dakika Kuru çimento.
6. Künt paslanmaz çelik makas kullanarak güvenilir implantasyon teller aşağıda veya bölge stratum pyramidale için ventrally bitişik teta genlik nerede tahmini için çok düşük üstünde etkinleştirme tungsten tellerin bir açısal kesme (5-20 °) gerçekleştirmek sürüklenme sadakat.
7. İpucu (yaklaşık 2 mm) zemin tel uzakta yalıtım kazımak için neşterden kullanarak deinsulate. Akı ve presolder ile tedavi.
8. Onay potansiyel çapraz-elektrotlar arasında kullanarak bir dijital multimetre görüşmeler. Bunu yapmak için direnç ölçme moduna ayarlamanız gerekir multimetre konektörü pin bağlayın. İkili kanal birleşimlerini denetleyin; 5 MΩ aşağıda multimetre üzerinde okuma önemli çapraz-talk gösterir.
9. Serum fizyolojik bir empedans metre kullanarak her tel elektrot empedans denetleyin. 100 kΩ tipik empedans değerlerdir.
10. İmplantasyon kolaylaştırmak için böylece lif ucu kısa tel düzeyinde ve lif yolgösterendir yakın ama tungsten teller değil müessir bir optik fiber kablo diziye tutkal. Fiber açı implantasyonu-doku hasarı önlemek için mümkün olduğu kadar küçük tutun.
    Not: Ayrıca ref. ⁶² tungsten tel dizileri imalatı için bkz.

4. stereotaksik takılan

1. Hazırlıklar 1.6-1,13 adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
2. Bağ dokusu kafatası en baştan çıkarmak ve kayıt sırasında kas yapıları önlemek için iyice yaklaşık 2 mm tarafından boyun kasları itin.
3. Temiz bir pamuk-ipucu aplikatör ve serum kullanarak kafatası ve 4 (2 ön) ve beyincik, 0.8 mm çap yukarıdaki 2 için zemin ve stabilization (Şekil 1 d) implantın kemik paslanmaz çelik vidalar (00-96 x 1/16) yerleştirmek için delik. Bir bakır tel (yaklaşık 2-3 cm uzunluk) beyincik yukarıda bağlı zemin vidayı yerleştirin.
4. Zemin-vida ile tamamen çimento elektrofizyolojik kayıtları sırasında kas yapıları önlemek için kapak. Tüm vidaları (Şekil 1E) bağlanan bir çimento halka oluşturun.
5. Bir kranyotomi implantasyon yan (hipokampus, AP-1.94, L 1.4, referans olarak bregma V 1.4) yukarıda gerçekleştirmek. Yaklaşık 5 µL steril NaCl beyin doku yüzeyine uygulamak.
6. Yavaşça stereotaxis kranyotomi kullanarak Tel dizi indirin. Üniter kayıtları için bir silikon sonda bir tel dizi⁶³yerine implant; Optoelectric hafif yapıları önlemek için doğrudan soruşturma karşı karşıya fiber ucu ile ayrı ayrı hipokampüs optik lif implant (Şekil 1 c -ı). Sürüklenme hemisferlerin arasında koordinasyonu soruşturma için ek bir optik fiber kontralateral hipokampal CA1 alanında implant.
7. Yaklaşık 5 µL beyin dokusunu korumak için implantasyon site yukarıda bir şırınga ile 70 ° C'de ısıtılmış sıcak sıvı balmumu/parafin yağı uygulayın.
8. Çimento tel dizi çevresinde uygulamak ve çimento ile kafatası kapağı.
9. Presoldered zemin/başvuru tel ve örneğin bir iğne kullanarak zemin vida bağlı presoldered tel akı bir damla uygulamak ve teller lehim makinasıyla sigorta.
10. Tüm zemin tel çimento ile kapak.
11. 0.3 mL Erycinum (1:4 içinde steril NaCl) yönetmek ve carprofen (5mg/mL) IP ve ameliyattan sonra en az iki gün. Fare genellikle ameliyatı takiben 15 dk içinde uyanır. Hayvan kurtarma hızlandırmak için kırmızı bir lamba ile sıcak.
12. Farenin ağırlığını her gün ameliyatı takiben ilk hafta için ya da ağırlığı dengeli olana kadar izlemek. Kilo kaybı ameliyattan önce kaydedilen fare ağırlığı yüzde 10'u geçmemelidir. Sabitleme ağırlığının hızlandırmak için ameliyatı takiben ilk gün boyunca fare ile ıslak yiyecek ve yoğunlaştırılmış süt tedarik.
13. Hipokampal hücresel hareketlilik sürüklenme sırasında kaydetmek için hipokampus (AP-1.94, L 1.4, V 1, sonraki düşürülmesi ile) bir silikon sonda ref. ⁶² ' açıklandığı gibi implant (Şekil 1 c -ı). AP -3, L 1.4, V 1.6, 39 ° rostral kaudal, hipokampus optik lif implant. Hücre somata uyarılması isterseniz MS (AP +0.98, L 1, V 3.9, 15 ° lateral) ek bir optik lif implant.

5. Optogenetic stimülasyon ve elektrofizyolojik veri toplama

1. (Örneğin, 15dk oturumları, 3 gün boyunca günde 1-2 seans) kayıt kurulum için fareyi alıştırmak. Hayvanın davranış ile ilk deneyler başlamadan önce inceleyin. Fare odasında, koklama, performans rearings, vb, çevre keşfetmek hareket ediyorsa ilk deneysel oturumu başlatmak.
2. Diğer hayvanlar aynı odada yokluğunda tanıdık bir odasında fareyi getirin.
3. Bir LED kafa-hayvanın konumunu izlemek için yapıştırıcı bant kullanarak sahne alanı'na ekleyin. Hayvan deneyleri başlamadan önce kayıt odası araştırmaktadır LED ışık süresi boyunca kamera tarafından yakalanır emin olun. Karanlıkta LED ışık izlemek için kaydedin. Bir kamera kayıt odası üzerinde konumlandırın.
4. Yama kablosu ışık çıktısını denetleyin. Sonra bağlantı bağlı olarak iletim hızı implante lif lif ucundan ıșık çıkıșı tahmin. Fiber ucundan ıșık çıkıșı güvenilir sürüklenme etkinleştirmek için 5-15 mW arasında olduğundan emin olun.
5. Headstage pre amplifikatör kronik implante konektörüne bağlayın. Kronik implante hipokampal fiber optogenetic stimülasyon deneyler için fiberoptik yama kablosu takın. Denetim ışık stimülasyon deneylerde, optik fiber için kulaklıklı mikrofon seti bağlı bir kukla yüksük bağlayın.
6. Kayıt odasında fareyi getirin.
7. Stimülasyon Protokolü oluşturmak için uyarıcı jeneratör kontrol yazılımını açın.
8. 473 nm DPSS laser kontrol kanalı seçin. 3000 ilk satırına girdiğiniz mV (1 sütun), 30 ms zaman (2 sütun), 0 değeri mV (3 sütun), 112 ms zaman (4 sütun), tekrar 840 kürek ve Grup 7 Hz stimülasyon ile 30 ms uzun bakliyat 2 min için bir protokol oluşturmak için tekrar 1. Uyarımı başka bir frekans veya farklı bir süre de gerekirse süre 4 sütun ve satır Tekrarlamaların sayısını ayarlayın. İkinci satır Seç 0 mW olarak (1 sütun), 500 h zaman (2 sütun), satır yineleyin 1 ve Grup 1 stimülasyon Protokolü sonlandırıldı sonra lazer kapalı olduğundan emin olmak için tekrar ediyorum.
9. Tıklayın "Dosya > Farklı Kaydet" ve istenen bir adla kaydedin.
10. Uyarıcı TTL lazer tetikleme elektrofizyolojik edinimi eşitlemek için dijital Lynx analog giriş kuruluna bağlı çıkış temin ederim ve optogenetic veri.
11. Alternatif olarak, parametrik teta salınım frekansı değişkenliği düzenleyen tren adlı arası darbe aralıkları, Gauss dağılımı aşağıdaki noktalarla değişen ışık darbeleri uygulanır. Örneğin, adım 3.2-15,1 ms²arası darbe aralıkları için farklı iletişim kuralları, dispersiyon değiştirin. Teta dönemini teta frekans (Şekil 6) farklı değişkenlik ile oluşturmak için bu iletişim kurallarını uygulayın.
12. Kayıt sistemi yazılımını açın. Tıkırtı üstünde "satın alma" ve "REC" kaydetmek için. Temel davranış (Örneğin, temel hız almak için 2 dk veya temel yer alanları ayıklamak için 30 dk) kaydetmek için ışık stimülasyon başlanmasından önce bekleyin.
13. Uyarıcı jeneratör kontrol yazılımını açın. "Dosya > Aç" tıklayın ve tercih Protokolü dosyası seçin. "Download ve ışık stimülasyon başlatmak için" Başlat.
    Not: Deneme araştırılmıştır ve stimülasyon uzaktan kumanda ile başladı; Bu hayvanın davranış deneyci varlığı etkisi içermez. Çalışmanın amacı bağlı olarak, stimülasyon başlatılan ve özel davranış sırasında sonlandırıldı.

6. bir kombine yaklaşım Optogenetic sürüklenme ve hipokampal çıkış projeksiyon özgü inhibisyonu için

1. ChR2 MS GABAergic hücrelere PV-Cre farelerin 1 bölümünde açıklandığı gibi hızlı.
2. Buna ek olarak, her iki dorsal hipokampal hemisferlerin (AP-1.7; CamKIIα bağlı halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) 2.4 µL toplam enjekte L ± 1,05; V-2.05 ve - 1,4 mm; AP-1.7; L ± 1.7; V-2.05 ve - 1.55 mm; AP-2.3; L ± 1.5; V-2.2 ve - 1.3 mm; AP-2.3; L ± 2.2; V-1.65 ve - 2.45 mm).
3. 6 hafta ifade zaman tanıyın.
4. Hipokampal CA1 bölgesindeki optik lif içeren bir tungsten tel dizi 4 bölümde açıklandığı gibi implant. Ayrıca, yanal septum bilateral optik lifler implant (LS, AP 0,1, L 0,25, V-2.25 mm ve AP 0.5, L-0.3, V-2.7 mm).
5. 5.4 5.5 adımlarda açıklandığı gibi optogenetic teta sürüklenme deneyler yapmak.
   1. LS hipokampal çıktısına eşzamanlı inhibisyonu için bir iletişim kuralı uyarıcı nesil oluşturmak: Örneğin, tetikleyici çıktı kanalı başlangıcı bağlı 593 nm DPSS laser 15 s için toplam 45'kalıcı bir sürekli darbe ile tetikleme önce s, 473 nm DPSS lazer bakliyat çıktı.
   2. LS yama halatlar multimod fiber optik girişli 593 nm DPSS lazere kullanarak üzerinden her iki lifler bağlayın.
   3. Kayýt iþlemini baþlatmak ve download ve uyarıcı üretimi denetlemek için iletişim kuralı tetikler.

7. veri işleme

1. Elektrofizyolojik sinyalleri dönüştürmek ve nörofizyolojik veri (ND) Yöneticisi .dat ve .pos formatları, sırasıyla⁶⁴ile izleme verilerini getirin.
2. LFP alçak geçiren filtre uygulama ve aşağı örnekleme geniş bantlı sinyal 1,250 Hz ND Yöneticisi⁶⁶kullanarak elde.
3. Her kayıt, teta salınımları (Neuroscope kullanarak)¹⁹maksimal genliği ile kanalı seçin.
4. Zaman damgaları lazer bakliyat ve stimülasyon dönemini algoritması algılama eşik ile tespit (MATLAB işlevi findpeaks.m kullanarak veya benzer)¹¹.
5. Bir çok kanallı veri analiz yazılımı .dat dosyasını almak için "Dosya > Al"'ı tıklatın, "ikili dosyaları" veri türü olarak seçin ve .dat dosyasını seçin. Yapılandırma iletişim kutusunda, doğru kanal sayısı ve 1,250 Hz örnekleme oranı girin, "Tamam" ve .smr dosyası olarak kaydedin. Güç spectra "Analiz > yeni sonuç görünümü > PowerSpectrum" seçerek arsa. Ayarları'nda, en yüksek teta genlik ve 16.384 FFT boyutu ile kanalı seçin, "Yeni"'ı tıklatın, "Başlangıç saati olarak" başında stimülasyon dönem ve "End time" olarak tanımlamak belgili tanımlık stimülasyon dönem ve tıkırtı "Süreci" sonuna.
6. Sürüklenme sadakat toplu güç spektral yoğunluğu (PSD) oranı olarak optogenetic stimülasyon frekans aralığı içinde hesaplamak (stimülasyon frekans ± 0.5 Hz), multitaper yöntemi ile teta (5-12 Hz) bandında toplu PSD için (NW = 3, pencere boyutu 8,192) 10 s dönemini için (Örneğin, araç < http://chronux.org/>).
7. Baskın PSD tepe ≤ nerede kayıt dönemini hariç analiz (non-theta dönemini, MATLAB işlevi find.m kullanarak) 5 Hz.
8. LFP güç spectra raster (MATLAB işlevleri sortrows.m ve pcolor.m kullanarak) hesaplanan sürüklenme sadakat göre tüm kaydedilmiş dönemini için arsa. Yük güç spectra ve sürüklenme "Dosya > Aç" tıklayarak sadakat saklanan değişken inç türü güç = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:End)).

ChR2 MS 1 bölümünde açıklandığı gibi GABAergic hücrelere hedefleme Şekil 2Agösterilmektedir. Dorsal hipokampus CA1 alanının üzerinde implante bir optik fiber üzerinden MS GABAergic hücrelerinin akson uyarılması Optogenetic teta salınımlarını uyarıcı Ipsilateral (Şekil 2B) frekansta kontralateral yanı sıra entrains Yarımküre (Şekil 2C). Teta titreşimler tarafından hangi etkinliği olarak göreli teta LFP güç stimülasyon frekans, yaniçevresinde her kayıt dönemi için hesaplanan optogenetic stimülasyon (Şekil 3A), daha fazla veya daha az verimli entrained, sürüklenme sadakat (Şekil 3B). Sürüklenme sadakat 0.3, yani, kendiliğinden ışık kapalı kayıtları, daha yüksek yukarıda kayıt dönemini yaklaşık % 80 gözlendi. Optostimulation sigara-theta frekanslarda daha az olduğunu etkili (Şekil 3 c).

Açık yani, parametrik manipülasyon teta salınım frekansı teta düzenli acil değişikliklerden eşlik etti: genlik zamansal düzenlilik ve Teta salınım frekansı yüksek dönemini sırasında artış oldu sürüklenme sadakat. Salınımlarını kararlılığını da parametrik tren ışık darbeleri, hangi dönemlerinde farklı dispersiyonu (Şekil 4) ile Gauss dağıtımları takip uygulayarak düzenlenmiş.

Salınım frekansı üzerinde Optogenetic kontrol teta frekans ve afferents (5A rakam) hareketi sırasında artan tarafından MS ile frekans kontrolü ile anlaşma içinde çalışan hızlı arasında ilişki ortadan kaldırılmıştır. Optostimulation da hareketsizlik (Şekil 5B) sırasında teta salınımlarını indüklenen. Sözde piramidal hücrelerde CA1 alanında Tercihli ateş aşama kaydedildi ve interneurons spontan teta (Şekil 6) karşılaştırıldığında entrained optogenetically teta salınım göre değişmez.

Hippocampus teta-aracılı, düzenleme, hareket, yanal septum yolu için katkısını çalışmaya biz optogenetically inhibe bu yolu. Halorhodopsin (eNpHR3.0) bilateral hipokampal piramidal hücrelerde (Şekil 7A), oysa ChR2 MS GABAergic hücrelerdeki ifade edildi ve Teta salınımlarını entrained optogenetically (Şekil 7B) olduğunu ifade edildi. Teta sürüklenme azaltılmış değişkenlik hız ama değil ne zaman hipokampus LS yolu için inhibe çalışan (Şekil 7C).

Şekil 1: resimde optik lifler, elektrotlar ve ameliyat. (A)bir optik fiber Illustration. (B) bir optik fiber hipokampal LFP kayıt hipokampal teta salınımlarını sürüklenme sırasında için yapıştırılmış bir tel dizi Illustration. (C) hipokampal hücresel aktivite kayıt için bir silikon sonda üzerinde microdrive monte edilir. (D) minyatür vida kafatasında konumlandırılmış. Bakır teller için zemin ve başvuru vida beyincik üzerinde konumlandırma daha önce presoldered. (E) Çimento kapak ve vidaları bağlanmak için uygulanır. Üst mavi daire kranyotomi silikon inceleyebilirsek implantasyon için yapılacağı yeri gösterir. Daha düşük mavi daire nerede kranyotomi hipokampüs optik lif implantasyonu kez yapıldı gösterir. (F) bir optik fiber hipokampal CA1 bölge hedeflemesini rostral kaudal bir açıda yerleştirilir. Hücre somata uyarılması (isteğe bağlı) isterseniz ikinci bir lif medial septum implante olması. (G) Silikon sonda hipokampal CA1 alanının üzerinde sadece indirilir. (H) microdrive ve bağlayıcı implant ve zemin çimentolu ve başvuru telleri lehimli. (ben) bakır mesh implant çevreleyen ve Faraday kafesi hizmet için inşa edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: optogenetic hipokampal teta sürüklenme için hazırlık. (A)ChR2 PV-Cre fareler (üst düzeni) PV+ medial septal hücrelerinde dile getirdi. MS (1, 2) parlak floresan somata başarılı yapı ifade onaylar. Proje MS lifleri yolu ile fornix (f) ve Pilus (fi) için hippocampus (3-6); ACA: anterior komissür; ön bölümü. HDB: çapraz grup yatay kol çekirdeği; Veya: tabaka oriens. Mavi ışık ile optogenetic uyarılması için optik fiber piramit katmanın Hipokampal alanın CA1 üzerinde (alt düzeni) yerleştirilir. Ölçek çubukları: 500 µm (resim 1, 3, 4) ve 50 µm (resim 2, 5, 6). (B) hipokampal LFP spontan teta salınımlar (sol) ve 7 Hz (orta) veya 10 Hz (sağda) optogenetic sürüklenme sırasında. Mavi çizgili ışık uygulama zaman pencereleri gösterir. Not bir okla gösterilen hafif darbe tarafından araştırma aşamasında. Not gama zarflar sırasında kendiliğinden ve sürüklenmiş teta, fizyolojik teta ritim bir göstergesidir. Faz ters tabaka oriens arasında (str. veya.) ve stratum radiatum (str. rad.) Ayrıca sürüklenme sırasında yapılmaktadır. (C) sürüklenme sırasında Ipsilateral (üst araziler), aynı zamanda kontralateral (alt araziler) güvenilir optogenetic uyarım. Düzenleri liflerinin pozisyonlarda elektrot pozisyonları için saygı göstermek. Örnek LFP izlemeler teta ve ışık darbeleri uygulanması sırasında ortada gösterilir. Doğru güç spectra hipokampal LFP ipsi ve stimülasyon Frekansa göre renk kodlu kontralateral stimülasyon sırasında. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: optogenetic hipokampal teta sürüklenme vefa. (A) örnek hipokampal LFP izlemeler sırasında düşük ve yüksek sürüklenme sadakat. (B) güç spektral yoğunlukları 10 s dönemini teta frekans (solda), önde gelen göre sipariş satırları ile spontan teta ve 7 Hz (orta) ve sürüklenme sadakat göre sipariş satırları ile 10 Hz (sağda) optogenetic stimülasyon sırasında. İlgili örnek güç spectra (bir okla gösterilen) yukarıda çizilir. Güvenilir sürüklenme sadakat dönemini unutmayın. Sağ tarafta, kümülatif olasılığını sürüklenme sadakat teta frekanslar için gösterilir. (C) sürüklenme teta ritmik uyarılması gerekir. Hipokampal ağ etkinliğini başarıyla arasında 6-12 Hz frekansları kullanılarak entrained. Daha düşük frekanslarda (Örneğin, 2 veya 4 Hz) veya daha yüksek frekanslar (Örneğin, 20 Hz) sürüklenme güvenilir değil. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: theta salınımlarını düzenlilik parametrik manipülasyon. (A)stimülasyon kötü frekans ile 7,8 Gauss dağılımı aşağıdaki Hz teta aralığında değişen frekanslarda uygulandığı. Arası pulse aralıklarında standart sapma σ iletişim kurallarından genelinde yükseltilmiştir 3,19 için σ = 15,09 =. Toplamda 11 protokolleri oluşturulan ve uygulanan, her stimülasyon dönemi: 1 min Toplam süre. O, olasılık dağılımı 5 iletişim kurallarının gösterilir rakam sol tarafta. Hipokampal LFP ilgili iletişim kurallarının uygulaması sırasında 1-14 Hz aralığındaki güç spektral yoğunluğu ortasında şekil çizilir. Uygulama ilgili iletişim kurallarının teta dönemlerde olasılıklardan sağda gösterilmiştir. (B) uygulanan varyansını arası darbe aralıkları tespit eşzamanlı teta dönemi varyansını (Pearson r 0,94, p = 0.0002 =). (C) teta genlik değişkenliği ve arası darbe arasındaki ilişkiyi aralığı (Pearson r 0.61, p = 0,08 =). Bu rakam ref. 70değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Optogenetic teta ritmik sürüklenme sırasındaki davranış biçimi hipokampal LFP belirler. (A)Optogenetic stimülasyon frekansı tespit teta frekans hareket sırasında. Bu nedenle, hız ile ilgili afferents hipokampal teta frekans etkisi değil ve spontan teta (siyah) sırasında olduğu gibi sonuç olarak hız teta frekans (mavi) ile ilişkili değil. Veri ± s.e.m. (B) sessiz uyanıklık sırasında demek olarak sunulan, hipokampal teta hareketi yokluğunda elde edildi. Yukarıda gösterilen hipokampal LFP izlerini öncesi ve sırasında başarılı sürüklenme ve sürüklenme sırasında kaydedilen örnek hızı izlemeler aşağıda gösterilmiştir (yukarıda tasvir hipokampal LFP izleme kırmızı izleme karşılık gelir). Mavi çizgili ışık stimülasyon bakliyat zaman pencereleri işaretleyin. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: hipokampal hücresel aktivite sırasında teta sürüklenme. (A)hücresel hareketlilik silikon sondalar (düzeni) kullanarak kaydedildi. Tek interneurons ve piramidal hücreleri izole ve onların anılan sıraya göre dalga göre tespit. Burada gösterilen ortalama dalga formu (orta) ve auto-correlogram örnek izole piramit hücre olduğunu. (B) tercih edilen deşarj piramit hücreleri (Pyr) aşamasıydı değil farklı sırasında spontan (siyah, n = 29 nöronlar) ve entrained optogenetically (mavi, n = 30) teta (p 0,79 =). (C) gösterildi burada olduğunu otomatik correlogram (solda) ve Tercihli ateş aşaması sırasında spontan bir hızlı pişirme interneuron ve optogenetically entrained teta. Karşılık gelen hipokampal LFP ritim spontan (sol) ve sürüklenmiş (sağda) teta sırasında. (D) tercih edilen akıntı hızlı pişirme interneurons aşaması sırasında farklı değildi (siyah içinde) spontan ve entrained optogenetically (mavi, n = 28 nöronlar) teta (p 0,97 =). Ortalama auto-correlogram sol tarafta gösterilir. (E) ortalama auto-correlogram str. oriens hücreleri. (F) spontan (siyah) ve entrained optogenetically sırasında str. oriens interneurons tercih edilen deşarj aşaması farklı değildi (mavi, n = 10 nöronlar) teta (p = 0.56). Histogramlar tercih edilen deşarj aşamalarının sağ tarafta gösterilir. (G) ortalama ateş oranları teta sürüklenme piramidal hücrelerde tarafından etkilenmemektedir (p = 0,98), hızlı pişirme interneurons (p = 0,96) veya str. oriens interneurons (p 0,85 =). Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: kombinasyonu ile LS çıkış hipokampal teta sürüklenme ve optogenetic inhibisyonu hipokampal subcortical. (A)eNpHR3.0 (halorhodopsin) hipokampal piramidal hücrelerde (üst düzeni) dile getirdi. Yapı başarılı ifade hippocampus (üst Images) somata ve akson LS (alt resim) içinde parlak floresans tarafından doğrulandı. Optik lifler bilateral LS (alt düzeni) implante edildi. Ölçek çubukları: 500 µm (soldaki resim), 50 µm (Sağdaki fotoğraf). (B) hipokampal teta başarıyla LS yolu için hipokampus inhibisyonu sırasında entrained. Burada 9 Hz mavi ışık uyarılması sırasında çıkış inhibisyonu için güç spektral yoğunluğu gösterilmiştir. (C) önemli hipokampal subcortical çıkış yolu inhibisyonu hipokampal teta sürüklenme hızı üzerinde etkilerini engeller. Burada gösterilen hızı değişkenliği optogenetic (mavi kenarlıklarla beyaz bar), sürüklenme ile üzerine düşmesiyle yoktur olduğunu hipokampus LS yolu (sarı çubuk mavi kenarlıklı) için eşzamanlı inhibisyonu üzerine. İlgili ortalama temel hız sol tarafta gösterilir. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.