Yöntem makalesi

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

DOI:

10.3791/57354

⸱

1 Temmuz 2018

 ,  , 
1College of Life Sciences, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamanmekansal hücre altı localization(s) bir protein hakkında bilgi fizyolojik fonksiyonları hücrelerdeki anlamak için önemlidir. Çılgınca floresan proteinler ve floresan füzyon proteinlerin üretimi doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri hücrelerdeki görselleştirmek için etkili bir araç kullanılmıştır. Bunları ortak ilgi sözcüğünden sonra ifade protein ile tanınmış organel işaretleri ile karşılaştırmak özellikle yararlıdır. Yine de, bitkilerde protein ortak ifade için Klasik yaklaşımlar genellikle birden çok bağımsız ifade plazmid içerir ve bu nedenle düşük ortak ifade verimliliği, ifade düzey varyasyon ve yüksek saat içerir dezavantajları var genetik geçiş ve eleme harcama. Bu çalışmada, bitkiler birden çok chimeric floresan proteinlerin ortak ifade için sağlam ve Roman yöntemi açıklanmaktadır. Bu birden fazla yarı bağımsız ifade kaset oluşan bir tek ifade vektör kullanarak geleneksel yöntemlerle sınırlamalar üstesinden gelir. Her protein ifade kaset kendi fonksiyonel proteini ifade öğeleri içerir ve bu nedenle bu esnek farklı ifade talebi karşılamak için ayarlanabilir. Ayrıca, kolay ve derleme gerçekleştirmek uygun ve en iyi duruma getirilmiş tek adımlı reaksiyon ek sindirim ve ligasyonu adımları olmadan kullanarak ifade plazmid DNA manipülasyonu parçaları. Ayrıca, dolu birarada olabilir ile mevcut floresan protein elde edilen biyo-görüntüleme teknolojileri ve uygulamaları, perde ve BiFC gibi. Bir doğrulama yöntemi, bu yeni sistemin fluorescently erimiş Co express katmaninin sıralama reseptör ve salgı taşıyıcı membran proteinlerinin çalıştırmaya başladık. Sonuçlar, onların bakış açısı hücre altı yerelleştirmeler geçici ifade ve bitkilerde genetik dönüşüm tarafından önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chimeric floresan füzyon proteinler hücre içi dinamikleri ve hücre altı yerelleştirme çalışma ve daha fizyolojik fonksiyonları ve çalışma mekanizmaları1,2, anlamak için yararlı araçlar kabul edilmiştir 3 , 4. eş express tanınmış organel muhabir proteinlere, kronolojik zamanmekansal mantığı, dağıtım ve function(s) hücreleri4 endomembrane sistemi içinde daha iyi göstermek için söz konusu protein ile özellikle faydalıdır , 5 , 6 , 7 , 8.

Chimeric floresan füzyon protein onların anılan sıraya göre avantajları ve sınırlamalar9,10,11olan bitkiler ile geçici ifade ve istikrarlı genetik dönüştürme, ifade edilebilir. Geçici bir protein ifadesidir biolistic bombardıman-, Polietilen glikol (PEG) içeren uygun bir yaklaşım-, veya DNA geçici ifade Elektroporasyon aracılı önceki ve Agrobacterium-yaprak infiltrasyon aracılı olduğu gibi bitki hücreleri, Şekil 1A, B12,13,14,15,16' da gösterildiği gibi. Ancak, ortak ifade tek bitki hücrede birden çok chimeric floresan füzyon proteinlerin çeşitli bağımsız ifade plazmid karışımı gerektirir. Böylece, birkaç plazmid aynı anda tek bir plazmid için karşılaştırıldığında aynı hücrelere girerek önemli ölçüde azaltılmış olasılığı nedeniyle ortak ifade düzeyi düşük tesislerinde protein ortak ifade birden çok plazmid istihdam sakıncaları vardır ve Plazmid hücre17,18aktarılan her türde kontrolsüzce rasgele miktarı nedeniyle protein ifade düzeyleri varyasyonları. Buna ek olarak, protein ortak ifade9,10,11tek Agrobacterium içine birkaç bağımsız ifade plazmid tanıtmak için teknik olarak zordur. Bu nedenle, Agrobacterium- Şekil 1Badımında gösterildiği gibi aracılı protein geçici ifade tütün infiltrasyonu tarafından bırakır sadece bir kerede bir plazmid ifade yeteneğine sahip. Buna ek olarak, floresan füzyon protein ifade Transgenik bitkilerin üretimi genellikle ikili dönüşüm vektör taşıyan Agrobacterium tarafından sağlanır. Ancak, gen transferi ve bitki genleri içine ekleme aracılık eder ikili vektör yalnızca bir tek floresan füzyon proteini (Şekil 1B)9,10,12ifade yeteneğine sahiptir. Aynı anda birkaç chimeric floresan proteinler ifade eder bir transgenik bitki üreten birden fazla mermi genetik geçiş ve ay sonra yıl genlerin sayıda bağlı olarak ortak ifade için gerçekleştirebileceğiniz tarama gerektirir.

Bir tek ifade vektör bitki birden çok proteinlerin ortak ifade için önceki birkaç tarafından bildirilmiştir istihdam19,20,21çalışmaları. Ancak, birden fazla mermi enzimatik sindirim ve DNA molekülleri ve omurga vektörel çizimler ligasyonu DNA protein Co ifadesi veya aşırı ifadesi için son plazmid nesil için genellikle gereklidir. Burada, birden çok chimeric floresan proteinler tesislerinde ortak ifade etmek için yeni ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bitkiler hem geçici ifade için birden fazla protein ortak ifade ve bir onur moda istikrarlı dönüştürme sağlar son derece verimli ve kullanışlı bir yöntemdir. Birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein ifade kaset protein ortak ifade içeren ve böylece geleneksel yöntemlerle sakıncaları üstesinden gelir bir tek vektör kullanır. Ayrıca, hangi DNA'manipülasyonlar ve derleme bir en iyi duruma getirilmiş basit tek adımlı DNA sindirim ve ligasyonu ile tepki ek adımlar olmadan elde edilir son derece çok yönlü sistemidir. Çalışma prensibi Şekil 2' de gösterilmiştir. Ayrıca, tamamen chimeric floresan füzyon protein üzerinde temel alan geçerli, moleküler, hücresel ve biyokimyasal yaklaşımlar ile uyumlu olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. primer tasarım stratejisi ve DNA amplifikasyon

  1. Moleküler klonlama, DNA parçaları için astar tasarım. Astar 20 bp gen özel bağlayıcı sıraları ve (örneğin bkz. Tablo 1 ) tamamlayıcı örtüşen sıra bitişik DNA moleküllerinin olan 20-25 bp 5' uç çıkıntı dizileri, oluştururlar.
    Not: Sonraki derleme her DNA parçaları, farklı protein ifade kaset, bağlantı ve tüm son ifade vektör ile entegrasyon bağlıdır üzerinde bitişik örtüşen sıralarının tanıma.
  2. DNA parçalarının yarı bağımsız protein ifade kaset standart PCR reaksiyonları ile ilgili onların astar tarafından inşası için gerekli ve yüksek olan organizatörü, floresan muhabir, hedef gen ve Sonlandırıcı, dahil olmak üzere, yükseltmek sadakat polimeraz.
    Not: Bu çalışmada DNA amplifikasyon için kullanılan şablonları önceki çalışmalar15,22,23türetilmiştir. Tavlama sıcaklığı ve PCR reaksiyonları süreyi uzatma astar ve gen bağımlı vardır.

2. DNA parçası montaj ve inşaat Protein ifade kaset

  1. DNA Elektroforez tarafından ilk turda PCR ürünlerinin kalitesini incelemek ve spektrofotometre tarafından ölçmek. % 1'özel jel elektroforez tarafından DNA bozulma ve diğer yabancı maddelerden oluşmuş olup olmadığını kontrol edin. OD260/OD280 PCR ürünlerinin 1.6 ve 1.8 arasında olmalıdır.
  2. Farklı DNA parçalarının mix (0.05 - 0.1 pmol her parça için) bir yeni son hacmi 5 µL PCR tüp içine.
    Not: Mix DNA molekülleri birlikte bir PCR tüpte aynı protein ifade kaset için tasarlanmış. DNA derleme bağlanması için gereken DNA molekülleri artan sayıda nedeniyle verimliliği azaltır bu yana DNA'lar farklı ifade kaset üzerinden birlikte, karıştırma önlemek.
    Not: Protokol burada duraklatılmış.
  3. 5 x ISO hisse senedi arabellek hazırlamak: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM dithiothreitol; % 25 Polietilen glikol (PEG) 8000; ve 5 mM Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD).
  4. ISO stok tampon, T5 eksonükleaz aktivitesi, yüksek-sadakat DNA polimeraz 62.5 birimleri, Taq polimeraz 5.000 adet 7,5 adet x 1 mL 2 x 400 µL 5 ana karışım yapmak (bkz. Tablo reçetesi) ve sterilize edilmiş çift distile H2O.
    Not: Bu önceki çalışmalar24,25,26uyarlanmıştır; Bu birimler optimize edilmelidir.
  5. 2 ana karışım tüp ve mağaza-20 ° C'de başına x aliquot 100 µL
    Dikkat: Sık dondurma ve çözme 2 x ana karışımı düşük DNA montaj verimliliği neden olabilir.
  6. 2 x ana karışımı 15 µL 5 µL DNA karışıma ekleyin ve 50 ° c 60 dk için kuluçkaya.

3. bitkilerde birden çok Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade vektör inşaatı

  1. Tüm yarı bağımsız protein ifade kaset tarafından ikinci tur PCR ürünü kullanarak yükseltmek (0.5 - 1.0 µL) ilk turda izotermal derleme tepki olarak şablon ve en dıştaki astar (Örneğin, 1 FP35S ve 1-RNOS ifade için gelen Kaset 1).
    1. Yüksek sadakat polimeraz 50 µL tepki birimindeki birimini kullan 1 30 döngüsü tarafından takip (94 ° C 30 s, 30 55 ° C s ve 68 ° C için 2 dk), ardından 68 ° c 5 min için son bir uzantısı.
  2. Protein geçici ifade ve genetik dönüşüm için sırasıyla, 4 adet Sma ekleyerek tasarlanmıştır son protein ifade omurga vektörel çizimler pUC18 ve pCAMBIA1300, linearize ben bir son 10 µL tepki hacim içine kuluçka 1 için- 25 ° C'de 2 hr Restriksiyon enzimi 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
  3. Protein ifade kaset ve Doğrusallaştırılmış son vektör ekimolar DNA moleküllerinin 5 µL son tepki hacim içine karıştırın. Sonra ikinci tur DNA rekombinasyon 15 µL 2 x ana arabellek ve 50 ° c 60 dk için kuluçka ile karıştırılarak gerçekleştirin.
  4. Yetkili E. coli dönüştürmek için ikinci tur izotermal Rekombinasyon tepkimesi son ürünleri kullanmak standart prosedürler27göre hücreleri (Örneğin, DH5α). Olumlu kolonilerin koloni PCR ile DNA sıralama tarafından iki kez kontrol edin. Bir mini plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak E. coli olumlu plazmid ayıklamak ve-80 ° C'de depolayın
    Uyarı: Uzun süreli depolama için plazmid TE arabellekte çözünmüş veya çift distile H2O onları E. coli suşları içinde tutmaktan daha istikrarlı.

4. Biolistic-bombardıman geçici eş ifade birden çok Chimeric floresan füzyon protein tesislerinde aracılı

  1. Tütün BY-2 süspansiyon hücreleri ve Arabidopsis Juvenil bitkiler bombardıman için hazır olun.
    1. Kültür BY-2 hücreleri tarafından iki kez her hafta bir shaker 25 ° C'de subculturing Murashige ve Skoog (MS) ortamda 130 rpm'de ayarlayın. Ödemeli 30 mL 3 d kültürlü BY-2 hücreleri üzerine 70 mm autoclaved filtre kağıdı ile vakum pompası bir parçası için 40 mbar vakum basıncı ayarlayarak filtre uygulamak.
    2. Hücreleri aşağıdaki adımları boyunca kurumasını önlemek için birkaç damla BY-2 hücre sıvı kültürel orta bir kabında filtre kağıdı yerleştirmeden önce ekleyin (bir sonraki adım).
    3. BY-2 hücreleri ile filtre kağıdı üzerine yeni bir Petri kabına (85 mm x 15 mm) aktarın.
    4. Yüzey sterilize Arabidopsis thaliana (Col-0) tohumları vortexing bir karışım % 0.05 içeren % 70 (v/v) etanol ile ara 20 10 dk için.
    5. Spin aşağı bir tezgah üst santrifüj 2 için maksimum hızda kullanarak tohum s, süpernatant kaldırmak ve % 100 etanol ile tohum bir kez 30 s. pipet steril başlıklı yeni bir steril filtre kağıdı üzerine tohumlar dışarı için yıkayın. Sonra tohum kurumasına ve onları ½ MS agar levha yayıldı.
    6. Aşağıdaki ayarlarla bir bitki büyüme odasına aktarmadan önce 48 saat için 4 ° C'de plakaları saklamak: 16 h 120-150 µm m-2 s-1 yoğunluğu ile 22 ° C. 8 h karanlık ışık
    7. 7 - gün eski örnek bitkiler bombardımanı verimliliğini artırmak için yeni ½ MS orta plaka merkezinde 30 mm çapında çember içine aktarın.
      Dikkat: ne zaman transfer ve yeni ½ MS tabağa yerleştirerek bitkiler örtüşen önlemek.
    8. Bitki veya nem korumak ve bitkileri dışarı sırasında aşağıdaki adımları kurutma önlemek için doku yüzeyi ½ MS sıvı orta birkaç damla ekleyin.
  2. Plazmid DNA ile ceket altın parçacıkları.
    1. Girdap altın microcarrier çözüm iyice, 3 dk. için hazırlamak yeni 1,5 mL tüp.
    2. Sırayla aşağıdaki çözümleri tüp ve girdap ekleyin: 25 µL (1.5 mg) altın parçacıkları, girdap 10 s; 25.46 mg/L spermidine, girdap 10 s 10 µL; 5 1µg/µL plazmid DNA µL, girdap 3 dk; 25 277.5 mg/L CaCl2 çözüm µL, girdap 1dk.
      Dikkat: Bu adımı sırasında vortexing devam et.
    3. Spin aşağı bir tezgah üst santrifüj maksimum hızda 5 s ve dikkatle dışarı süpernatant pipet Pelet bozmadan kullanarak altın microcarriers. Mutlak etanol 200 µL ile yıkama ve Pelet girdap tarafından 5-10 s. Spin için aşağı 5 s ve Kaldır etanol için maksimum hızda yeniden askıya alma.
    4. Altın parçacıkları 18 µL mutlak etanol ve aliquot 6 µL parçacıklar süspansiyon üzerine üç macrocarriers ortasına yeniden askıya. Kuru hava alsınlar.
  3. DNA partikül bombardımanı ile bitkiler aktarın.
    1. Partikül dağıtım sistemi aşağıdaki gibi ayarlayın: 1100 PSI, 28 mm Hg vakum, 1 cm boşluk mesafe ve 9-cm parçacık uçuş mesafesi.
    2. Hücre/bitkiler agar orta plaka üzerinde için üç kez üç farklı konumlarda ile bombardıman ve hücre/bitkiler karanlıkta bombardımanı hemen sonra bırakın.
      Dikkat: işletim parçacık teslim sistemi yüksek basınçlı gaz ve yüksek hızlı parçacıklar sistemi ile ilişkisi nedeniyle koruyucu gözlük giymek.
  4. 6 ila 72 saat önce floresan sinyallerini gözlenmesi için bitki büyüme odası karanlıkta alı hücreler/bitkiler bulundurun. Bitki büyüme odası 24 h karanlık ve 22 ° c için ayarla
    Dikkat: Organizatörü, gen ve bitki/doku-bağımlı ifade verimliliği ve floresan sinyal şiddeti vardır.

5. birden fazla Chimeric floresan proteinler Agrobacteriumtarafından ortak ifade istikrarlı transgenik Arabidopsis nesil-dönüşüm aracılı.

  1. Agrobacterium yetkili hücre (PMP90) buz çözme ve için 30 dakika bekleyin, sonra (yukarıda hazırlanan yetkili hücrelere) 2 µL ikili vektör (100-200 ng) ekleyin. Karışımı 10 dakika buz üzerinde durur.
  2. Karışım önceden soğutulmuş 0.1 cm Elektroporasyon küvet aktarın. Küvet Elektroporasyon sistemi yerleştirin ve aşağıdaki ayarlarla Elektroporasyon gerçekleştirmek: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.
  3. SOC sıvı orta 1 mL küvet Elektroporasyon hemen sonra ekleyin, hücreleri yeni bir 1,5 mL tüp içine pipette ve 28 ° c 200 devirde bir yatay orbital Shaker 120 min için kuluçkaya.
  4. Hücreleri 2,348 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi, süpernatant çoğunluğu atmak, yavaşça bir pipet ucu pelleted hücrelerle yeniden askıya alma, 50 mg/L Hygromycin B içeren LB tabağa bacaklarını ve 28 ° C'de 2-3 gün kuluçkaya.
  5. Çiçek DIP28 yöntemi için daha önce açıklandığı gibi birden fazla protein ifade kasetleri ile entegre ikili vektör pCAMBIA1300 içeren Agrobacterium, Arabidopsis thaliana Col-0 bitkilerle dönüşümü istikrarlı transgenik bitkiler üretmek.
  6. Transgenik Arabidopsis tohum yüzeyinin % 0.05 içeren % 70 (v/v) etanol ile karıştırılarak sterilize ara 20. 10 dk. Spin bir tezgah üst santrifüj 2 için maksimum hızda kullanarak tohum aşağı için girdap s, süpernatant kaldırmak ve bir kez için %30 100 etanol ile tohum yıkama s.
  7. Pipet steril başlıklı steril bir filtre kağıdı üzerine tohumlar dışarı. Bundan sonra kurutma ve Hygromycin B pozitif ettiklerinizden eleme için içeren ½ MS ağar kaplamalar üzerine aç bacaklarını.
  8. Plakayı 4 ° C'de 2 gün kuluçkaya. Ardından, onları içine belgili tanımlık bitki büyüme odası ve kültür için 7 gün aktarın.
  9. 7 - gün eski hayatta kalma Juvenil bitkiler floresan mikroskop altında floresan sinyallerini denetleyerek seçin, sonra bitkiler için daha fazla tarama homozigoz bitkilerin toprak içine transfer.

6. ilaç tedavileri

  1. İlaç tedavisi, her ilaç uygun çalışma konsantrasyonları kuluçka hücreleri veya bitkiler önce sıvı MS ortamda sulandırmak.
    1. Wortmannin tedavi: 1 mM wortmannin hisse senedi çözümler DMSO wortmannin toz çözülerek hazırlamak ve hisse senetleri-20 ° C'de depolayın Bitki hücreleri ya da çocuk bitki 16,5 µM wortmammin içeren sıvı MS orta aktarmak ve 30-45 dk önce görüntüleme için kuluçkaya.
    2. Brefeldin A (BFA) tedavi: 1 mM DMSO BFA toz çözülerek BFA hisse senedi çözümler hazırlamak ve hisse senetleri-20 ° C'de depolayın Bitki hücreleri veya Juvenil bitkiler 10 µg/mL BFA 30-45 dk önce görüntüleme için içeren sıvı MS orta içine aktarın.

7. confocal mikroskop düşsel ve Protein hücre altı ortak yerelleştirme Analizi

  1. Juvenil bitki veya süspansiyon hücre geleneksel cam slayt üzerine aktarın ve kapak slayt görüntüleme için üstte mikroskobu tarama standart confocal lazerle kırmadan. Kullanma ertesi gün koyma: 63 X su amaç (N.A 1.4), 0 arka plan, 700 kazanç, 0.168 mm piksel boyutunu ve photomultiplier tüp dedektörü. GFP öğesini proteinler 485, heyecanlandırmak nm ve floresan, 525 nm. 514 RFP öğesini proteinler için heyecanlandırmak nm ve 575 algılamak nm.
  2. Pearson-Spearman korelasyon (PSC) Co yerelleştirme yukarıda açıklanan8olarak eklentisi ile floresan sinyallerini kullanarak görüntü J yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/) Co yerelleştirme oranını hesaplamak. Pearson korelasyon katsayıları veya Spearman'ın sıralama korelasyon katsayıları (Şekil 4) sonuçlarında gösterilir. Üretilen r değerleri -1 ile 1'e olur. + 1 ve -1 tam pozitif ve negatif korelasyon, sırasıyla, iki sinyalleri gösterir, ancak 0 iki sinyallerin tespit yok korelasyon gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birden çok chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak bir ifade için sağlam ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bu geleneksel, engellerin üzerinden tatili yaklaşımlar kullanmak birden çok ayrılmış plazmid protein ortak ifade için Şekil 1A, B, yolu ile gösterildiği gibi geçici ifade veya istikrarlı genetik dönüşümü. Bu yeni yöntem, protein ortak ifade aynı anda (Şekil 1 cD)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sağlam chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem göstermiştir. Geçici ifade ve genetik dönüşümü için kullanılabilir ve geçerli floresan protein bazlı biyo-görüntüleme, moleküler ve biyokimyasal uygulamaları ve teknolojileri9,10ile,13 uyumludur . Buna ek olarak, protein ortak ifade için birkaç bireysel ifade plazmid kullanan geleneksel yöntemleri zorluklar üstesinden gelir. Buna e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yararlı tartışmalar ve yorumlar için Wang laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NSFC, grant no. 31570001) ve doğal Bilim Vakfı Guangdong Eyaleti ve Guangzhou City (no. 2016A030313401 ve 201707010024 vermek) H.W. için desteklenir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KOD-FX PolimerazTOYOBOKFX-101
Sma I NEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 eksonükleazMerkez üssüT5E4111K
Phusion Yüksek Kaliteli DNA polimerazNEBM0530S
Taq DNA polimerazNEBB9022S
Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı (MS)SigmaM5524
EtanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidinBBIA614270-0001
Altın mikro taşıyıcı parçacıklarıBio-Rad165-22631.0 & mikro; m
CaCl2BBICD0050-500
MakrotaşıyıcılarBio-Rad165-2335
Yırtılma diskiBio-Rad165-2329
Durdurma ekranıBio-Rad165-2336
TriptonOXOIDLP0042
Maya ÖzüOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlikozBBIA600219-0001
Higromisin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimetilsülfoksit (DMSO)BBIA600163-0500
T100 Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096
Büyüme odasıPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He parçacık dağıtım sistemiBio-Rad165-2257
Gen PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Tezgah Üstü SantrifüjEppendorf5427000097
Konfokal mikroskopZeissLSM 7 DUO (780& 7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometrelerThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 GüçKaynağı TanonEPS 300
Floresan mikroskopMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpisilinBBIA100339
Etilen Diamin Tetraasetit AsitBBIB300599

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
  4. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
  6. Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
  7. Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
  8. Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
  9. Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
  10. Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
  11. Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246(2017).
  12. Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
  13. Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
  14. Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
  15. Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
  18. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  19. Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218(2014).
  20. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
  21. Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28(2007).
  22. Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
  23. Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
  24. Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
  25. Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
  26. Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
  27. Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
  28. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
  29. Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
  30. Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
  31. Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
  32. Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
  33. Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
  34. Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
  35. Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
  36. Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071(2017).
  37. Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
  38. Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
  39. Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Ko ekspresyonuTekli Ekspresyon Vekt rPartik l BombardmanKonfokal MikroskopiFRET AnaliziBiFC AnaliziVSR 2 LokalizasyonuSCAMP4 LokalizasyonuBitki H cre Biyolojisi

İlgili makaleler