Yöntem makalesi

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

DOI:

10.3791/57382

⸱

12 Mayıs 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurilik nöronal altgrupları seçici manipülasyon esas olarak iki farklı yöntemlerle elde: 1) Intersectional genetik, mademki ikili ya da üçlü transgenik fareler bir muhabir veya efektör seçici ifade ulaşmak için oluşturulur Gen (örneğin, Rosa26 odağı üzerinden) istenen spinal nüfus. 2) Cre-bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV); kesici enjeksiyon Burada seçim muhabir veya efektör gen için kodlama Cre-bağımlı AAV vektörel çizimler Cre recombinase istenen nöronal subpopulation içinde ifade farelerin omurilik içine enjekte edilir. Bu iletişim kuralı Cre-bağımlı rAAV vektörel çizimler oluşturmak açıklar ve nasıl lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce L3-L5 kesimleri ile rAAVs. L3-L5 innervated hindlimbs duyusal bilgileri iletmek bu çevresel duyusal sinir hücreleri tarafından lomber spinal segmentler kendiliğinden davranış ve enjeksiyon tarafına Ipsilateral hindlimb uygulanan duyusal testler için yanıt olabilir duyusal işleme işlenmiş nöronlarda işlevi sorguya çekmek için analiz. Biz kümelerinden oluşan omurilik sinir hücreleri genetik olarak analiz etmek için bu tekniği nasıl kullanılacağını gösteren örnekler sağlar. Virüs-aracılı transgene ifade Cre transgenik farelerde klasik muhabir fare kaynaklı transgene ifadesine göre başlıca avantajları şunlardır: 1) çeşitli muhabir veya efektör proteinlerin kodlama farklı Cre-bağımlı rAAVs olabilir Böylece birkaç birden fazla transgenik fare satırları oluşturma gereğini üstesinden tek Cre transgenik satır enjekte. 2) kesici enjeksiyon enjeksiyon yeri ve enjeksiyon sonra zaman Cre ifade hücreleri manipülasyon sınırlar. Ana dezavantajları vardır: 1) muhabir gen ifade rAAVs iş daha fazla değişken. 2) cerrahi spinal sinir hücreleri ilgi transduce için gereklidir. İki yöntem daha uygun olduğu ele alınması nöron nüfus ve araştırma soru üzerinde bağlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorsal spinal kord çevre vücut ve beyin arasında bilgi değişimi için gerekli olduğunu. Isı, soğuk, gibi duyusal uyaranlara dokunmak veya zararlı uyaranlara hangi nöronlar bu bilgileri omurilik dorsal boynuz, özel çevre nöronlar tarafından tespit edilir. Burada, eksitatör ve inhibitör interneurons karmaşık bir ağ gelen ve sonunda röle duyusal bilgi yolu ile spinal projeksiyon nöronlar supraspinal için1,2siteleri. Omurilik tarafından yapılan hesaplamaları Inter- ve projeksiyon nöronlar kapı duyusal bilgi, böylece hangi bilgilerin bastırılır veya hangi yoğunlukta geçirilen belirleme. Değişiklikleri inhibisyonu ve uyarma, arasında değişen bir denge gibi duyusal uyaranlara entegrasyonundaki aşırı duyarlılık ya da allodynia (normalde non-feci stimülasyon sonra acı hissi) gibi duyusal işlev bozuklukları neden olabilir. Bu değişiklikleri çeşitli kronik ağrı altta yatan neden3,4devletler olduğu düşünülür. Böylece, duyusal işleme yüksek öneme sahip spinal devreleri vardır ve bu nedenle bir canlı çevre ve benlik algısı. Son varış ve moleküler, genetik bir kombinasyonu ve genetik olarak tanımlanan omurga nöron altgrupları kesin manipülasyon sağlar cerrahi teknikleri ile bilim adamları şimdi temel spinal devreleri anlamaya başlıyor farklı duyusal yöntemleri işlenmesi için sorumludur.

RAAV kesici enjeksiyon vahşi-türü veya transgenik fareler içine büyük katkıda bulundu işleme, analiz ve omurilik sinir hücreleri5,6,7, belirli alt kümeleri işlev anlayışı 8 , 9 , 10 , 11. bu teknik teslimat işaretçisi proteinlerin sağlar (GFP gibi / GFP füzyon protein), muhabir proteinler (örneğin, GCaMP) veya (örneğin, bakteriyel toksinler, channelrhodopsin veya pharmacogenetic reseptörleri) efektör proteinler arasında bir dağınık şekilde spinal sinir hücreleri sınırlı şekilde. Cre-bağımlı rAAVs yerel enjeksiyon transgenik fareler Cre recombinase spinal sinir hücreleri belirli alt kümesinde ifade içine ilgili nöronal nüfus belirli analiz sağlar. Biz etiket, ablate, inhibe veya bu gösteren nöronlar onlar ağrı kontrol spinal kapı önemli bir parçası ve iletim7kaşıntı spinal glycinergic etkinleştirmek için bu tekniği istihdam. Bu deneylerde Cre-bağımlı rAAV kesici enjeksiyon GlyT2::Cre fareler içine glycinergic nöronlar lomber spinal kord seçici manipülasyon etkin. Böylece, eş zamanlı glycinergic nöronlar hayvan yaşam için kritik içeren supraspinal devreleri manipülasyon önlenebilir.

RAAVs kesici bir enjeksiyon enjeksiyon sitesine enfeksiyon sınırlar, viral iletim sadece yerel nöronlar zamanda aksonal projeksiyonlar enjeksiyon siteye bağlanmak nöronlar gelişebilir. İkinci kez belirli bir çekirdek beyinde nöronal giriş sağlayan izleme CNS alanları için kullanılır. Zaman nöronlar tanımlanmış nüfusu belirli bir sitede eğitimi aksonal projeksiyonlar enfeksiyon ancak, aynı zamanda bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu sorunları çözmek için biz son zamanlarda AAV serotipleri ve serotipleri ve en aza indirmek ya da retrograd iletim en üst düzeye çıkarmak için kullanılan rehberleri tanımlamak için ifade kaset kapsamlı bir analiz yaptık. Omurilik devrelerde bu özel araştırma bağlamında analiz ettik retrogradely dorsal kök gangliyon (DRG), ventromedial rostral medulla (RVM) ve somatosensor korteks nöronlar transduce yeteneği farklı serotipleri ve rehberleri 12. bu protokol için özetlenen teknik bu nedenle enjeksiyon yerinde omurilik sinir hücreleri çözümlemek veya spinal kord enjekte sitenin giriş sağlamak projeksiyon nöronlar analiz etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokolünde rAAV üç iğne sol tarafındaki lomber spinal kord içine üç lomber segmentlere (L3-L5) nöron iletimi sağlamak için gerçekleştirilir. L3-L5 kesimleri duyusal girdi çoğunluğu enjeksiyon siteye hindlimb Ipsilateral alırsınız. Böylece genetik olarak etiketli nöron alt türündeki devre işlevi için fonksiyonel kanıt sağlayan fonksiyonel genetik olarak etiketli L3-L5 nöronlarda manipülasyon sağlam davranış değişiklikleri, uyandırmak için yeterli olduğunu ispat.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Swiss Kanton veteriner ofisi (Zürih) tarafından kabul edildi ve uygun olarak ve tüm ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri ile uyum vardır.

Not: İlgili üreticileri ve/veya satıcı ile birlikte tüm malzemeler Malzemeler tablolistelenir.

1. nesil Cre-bağımlı AAV vektörel çizimler

Not: Cre-bağımlı vektörleri farklı rehberleri ile çeşitli satın alınabilir ( Tablo malzemelerigörmek) veya istenen ifade yapısı kullanılabilir değilse, bu varolan AAV yapıları değişiklik yaparak oluşturulabilir. Dikkat, organizatörü ve serotip viral iletim yayılmasını üzerinde bir etkisi olabilir (bkz. 12). Bu iletişim kuralı ilk bölümünde kısaca iki farklı Cre-bağımlı AAV vektörlerin kazanç için uygun üretimi ve işlev deneyler, kaybı sırasıyla açıklar.

  1. Pharmacogenetic harekete geçirmek (işlevinin kazanç)
    1. PAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq) sipariş-mCherry ( Tablo malzemelerigörmek) tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar (DREADD) tarafından harekete geçirmek için-harekete geçirmek aracılı.
    2. Bakteriyel bıçak kültür aldıktan sonra bakteri dışarı çizgi LB plakaları (Luria-Bertani sıvı ortamda çözünmüş bakteriyolojik-grade agar) uygun antibiyotik ile desteklenmiştir. Geceleri 37 ° C üzerinde kuluçkaya ve ertesi gün bir koloni seçin.
      Not: AAV içeren vektör genleri kararsız olabilir ve özellikle viral ters terminal içinde viral genom rekombinasyon (ITR), yinelenen denetim plazmidleri E. coliamplifikasyon sırasında oluşabilir. Biz böyle suşları recA-eksik bastırılmış-/ kullanarak öneririz rekombinasyon AAV genom içeren plazmid içinde önlemek için MDS42 veya Stbl3.
    3. Seçilen satıcı tarafından verilen talimatları uygulayarak bakteri yükseltmek DNA-Maxi-Kit ve yüksek kaliteli plazmid DNA piyasada bulunan bir DNA-Maxi-Kit ile hazırlamak (örneğin, Tablo malzemelerigörmek). Plazmid DNA hazırlık kalite kontrolünü bütünlüğü ve plazmid DNA bir aliquot bir kısıtlama Özeti aracılığıyla plazmid DNA kimliğini doğrulayarak gerçekleştirin.
      Not: Orada tanıma site kısıtlaması endonükleaz SmaI ITRs içinde için. SmaI Özet ITRs bütünlüğünü doğrulamak için kalite denetiminde içerir.
    4. DNA kaliteli rAAV üretmek için bir viral vektör çekirdek tesise göndermek.
      Not: Yüksek titresi yüksek kaliteli viral preps viral hazırlık contaminations neden fenotipleri semptomlarıdır kaçınmak için büyük önem taşımaktadır. Biz bu nedenle AAV üretim laboratuvarda iyi kurulmuş olmadıkça bir kurulan vektör çekirdek tesiste üretilen seçim rAAV olmasını öneriyoruz.
  2. Ablasyon (fonksiyon kaybı)
    Not: Bakteriyel toksinler, uyuşturucu ve toksin reseptörleri hücre ablasyon veya nöronal susturmak arabuluculuk için kullanılabilir. Cre-bağımlı bir şekilde pAAV.EF1α.flex.DTA hızlı difteri toksini parçası A (DTA) için oluşturmuş.
    1. Cre-bağımlı viral vektör oluşturmak için uygun bir organizatörü (örneğin, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). ile Cre-bağımlı vektör seçin Polimeraz zincir tepkimesi ile sivil savunma ve NheI veya uyumlu kısıtlama endonükleaz tanıma (bkz: koruyucu ve ark. onların çıkıntılar eklemeyi astar tarafından (örneğin, DTA) seçtiğiniz kodlama dizisi yükseltmek 7)
    2. Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak, vektör DNA kısıtlama digests yerine (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) ve PCR güçlendirilmiş (NheI-DTA-ASCI) restriksiyon ile sivil savunma ve NheI ekleyin. Arıtılmış parçaları ligate.
    3. Seçim yetkili bakteri tedarikçi tarafından verilen protokolüne göre uygun bakteri, içine tüp ligasyonu tepki dönüştürmek ve bakteri LB plakalar üzerine plakası. RecA-eksik bastırılmış-/ kullanmak için klonlama suşları, MDS42 veya Stbl3, gibi ve sonraki plazmid DNA amplifikasyon.
    4. Gün'den sonra dönüştürme, klonlar almak ve onlara uygun antibiyotik gecede 37 ° C'de ile takıma LB ortamda aşılamak Ertesi gün, plazmid DNA kültürlü bakterilerden ayıklayın. Başarılı kısıtlama digests tarafından klonlama ve ayıklanan plazmid DNA sıralama doğrulayın.
    5. Yüksek kalite, bakteriyel plazmid DNA yükseltmek (bkz. Adım 1.1.3). Güçlendirilmiş DNA virüs üretim için bir viral vektör çekirdek tesise göndermek.

2. omurilik hücreleri iletim

  1. Virüs çözümü hazırlanması
    Dikkat: Virüsler bulaşıcı reaktifler vardır ve ilgili kurallarına göre ele alınmalıdır. Çoğu durumda, rAAVs Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL1) ele alınabilir.
    1. Enjeksiyon gününde, buz üzerinde istenen arıtılmış şunun bir hisse senedi aliquot defrost ve buz kadar enjeksiyon önce doğrudan üzerinde tutun. Donma-çözülme-döngüsü tekrarlanan, kaçmak aynı derecede bunlar Virüsün etkili titresi azaltacaktır.
      Not: gerekirse, fetişlerin virüs aliquot 4 ° C'de 3 güne kadar tutulabilir.
    2. Steril % 0,9 virüs parçacıkları seyreltik NaCl veya fosfat tamponlu tuz (PBS).
      Not: Uygun titresi deneysel amaçlar üzerinde bağlıdır ve deneysel olarak tespit edilmelidir. İyi bir toplam viral yük ile başlayan 3 x 109 genom (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL enjekte) kopyalanır. Hesap alarak aşırı ve kılcal damar içine yüklenirken bazı kaybı, yaklaşık 2.5 µL virüs çözüm her fare için gerekli olacaktır.
  2. MİKROPİPETLER hazırlanması için kesici iğne
    1. 'İnce çeperli cam kılcal çekin' (dış çapı 1 mm) şaft ~5.5 mm uzunluğunda oluşturmak için bir micropipette çektirmenin sığ. Tablo 1de olduğu gibi adapte P(A) ile 3.0 mm ısıtıcı filament ve 00 programının ayarlarını kullanın.
      Not: Çekerek önceden yapılabilir. Çekti kılcal kil daha sonra micropipette yapışmasına neden toz önlemek için modelleme üzerinde kapalı bir kap içinde saklanmalıdır. MİKROPİPETLER ısıyla gerekli değildir.
    2. 25-35 mikron bir iç çapı ile açılış ipucu oluşturmak için yaklaşık 4.5-5 mm uzunluğu laminektomi Forseps ile çekti kılcal şaft küçük. Mikroskop ile bir ölçüm ölçeği kullanarak, ne kadar büyük açılması, ya da her micropipette için ölçmek için bir hisse kapılıyorum birkaç MİKROPİPETLER iç çapını ölçün.
      Not: Daha küçük bir ipucu tıkanma için yol açabilir; büyük bahşiş doku hasarı ve spinal kord nüfuz için zorluklara neden olabilir.
  3. Cerrahi kurulum ve araçları hazırlanması
    1. Ekipman temiz ve kullanılmak üzere hazır olduğundan emin olun. Çalışma alanının % 70 etanol ile silerek dezenfekte ve sterilize ısıyla veya onları dezenfeksiyon araçları. Herhangi bir dezenfektan kullanılmak üzere viral vektör zarar vereceğini microliter şırınga bırakmayın.
  4. Anestezi ve ameliyat için hayvan hazırlanması
    Not: Ameliyat toplam süresi 60-90 dk kadardır.
    1. Cerrahi işlem kolaylaştırmak için 6 - 10 - hafta yaşlı fareler seçin.
      Not: deneysel tasarım gerektirirse, genç ya da yaşlı hayvanlar enjeksiyon mümkündür. Herhangi bir zorlanma ve her iki cinsiyette prensip olarak kullanılabilir, ama davranışları farklı transgenik fare satırları arasındaki karşılaştırma için aynı arka plan zorlanma (Örneğin, C57BL/6J) kullanın. Cinsiyet farklılıkları bekleniyor veya araştırılması için kadın ve erkek ayrı gruplar halinde analiz.
    2. % ~ 5 isoflurane kullanarak anestezi neden. Hayvan stereotaksik çerçeve ısı Mat yerleştirin ve anestezi, 1-%2,5 isoflurane korumak (hava akımı oranı 900 mL/dk). Ameliyat boyunca solunum hızı izlemek.
    3. Ameliyat sırasında kornea kurutma önlemek için yağ göz merhem uygulamak.
    4. Hayvanın arka tıraş ve saç ıslak mendil ile dikkatli bir şekilde çıkarın. İyot solüsyonu ile traş cilt dezenfekte ve kuru cilt izin.
    5. Analjezik tedavi vermek (örneğin, 0.1-0.2 mg/kg buprenorfin subkutan).
  5. Lomber Spinal Kord düzeyinde Vertebral sütunun pozlama
    Not: spinal kord ve vertebral sütunun fark gelişimi nedeniyle, ilgili düzeyleri hizalanmamış ama lomber spinal kord L4 torasik vertebra T13 aynı düzeyde kesimdir.
    1. En Kaudal kaburga çifti vertebral sütun palpating tarafından bulun. Bir neşter kullanmadan, sadece rostral en Kaudal kaburga çiftine başlayan deri içine bir 1,5-2,5 cm boyuna kesim olun.
    2. Forseps ile cilt kaldırın ve makas ile temel kas ayırarak. Ameliyat maruz dokuları nemli steril % 0,9 ile tutmak NaCl.
    3. İyi forseps ve küçük makas kullanarak, hemen yanında orta hat sonraki, ince zar tabaka haline bir kesi yapmak ve spinöz süreçlerden kesilmiş. Temel paraspinous kas ayrıdır ama spinöz süreçlerine bağlı.
  6. Lomber Spinal Kord düzeyinde vertebra tanımlaması
    Not: vertebral sütunun maruz bir kez, intertransverse bağ ve dorsal spinöz işlemleri görünür olmalıdır. Çeşitli anatomik yerler (şekil 1B) hedefe doğru omur teşhis etmek için yardım.
    1. Cilt geri kuyruk iliyak kret ortaya çıkarmak için doğru çekin. Aynı düzeyde görünür intertransverse ligamentler en Kaudal çifti L6 spinöz proses katılır. Kaudal omur ilgi tanımlamak için rostral yönüne içinde geriye doğru say.
    2. Vertebral sütun muayene et. En Kaudal kaburga çifti sadece T13 omur rostral bulunur ve leğen kemiği kalça düzeyinde L6 omur düzeyinde bulunur.
    3. Tendon vertebral sütunun sol tarafındaki en beyaz ve en medial nerede nokta bulun. T13 omur sadece rostral bulunur. Lomber spinal kord segment L4 bu omur içinde yer alır.
  7. Vertebral sütun ve maruz kalma Lomber Spinal Kord fiksasyonu
    1. Hayvan stereotaksik çerçeve spinal kelepçeler için yükseltmek için toplanan dokuların bir yastık üzerine yerleştirin.
    2. Hareketleri nedeniyle nefes vertebral sütunun önlemek için hedef omur düzeltmek. Bu amaç için hedef omur bitişik kelepçeler hizalamak, bir kelepçe bulunduğu saptamak ve vertebral sütunun ikinci kelepçe tamir ederken Adson Forseps ile tutun.
      Not: Sütun enjeksiyon uçağa dik olmalı ve böylece yukarıdan baskı üzerine hareket etmez sıkıca sabit. Gerekirse, kelepçeler ikinci bir çifti vertebral sütunun sabit olabilir. Bu durumda, kelepçeler için hedef omur bitişik iki omurga için iki çift saptamak yararlıdır.
    3. Paraspinous kas faiz vertebra yukarıda kaldırın. Bir neşter kullanmadan, bir paralel kesi vertebral sütunun paralel tendonlar için sadece medial yanı sıra dikey kesi rostral ve Kaudal hedef omur olun. Çok derin kesmemeye dikkat et. Gözyaşı/uzak rongeurs kullanarak kas kes. Forseps omur üstünde ya da yukarıda dura intervertebral alanı içinde kalan doku kaldırmak için gerektiği gibi kullanın.
    4. İntervertebral uzayda dorsal kan damarı spinal kord orta hat işaretleme görünür olmalıdır. Tek taraflı enjeksiyonlar için kısmi bir laminektomi omur hedef yan ortasına bir delik delme tarafından gerçekleştirin. Delme aparatı 0,5 mm küresel kesici ile iyi bir diş hekimliği kullanın ve spinal kord yaklaşırken özellikle dikkatle matkap. Kalan herhangi bir kemik parçaları 26 G eğimli iğne ile omurilik ortaya çıkarmak için kaldırın.
    5. 26 G eğimli iğne kullanarak, beyin zarı delinmiş delik ve intervertebral alanı rostral ve hedef omur, tüm yaklaşık 200 µm lateral dorsal kan damarı için Kaudal sorgulamaktı. Beyin omurilik sıvısı deliklerden kaçan ve spinal kord biraz şişkin.
  8. Enjeksiyon şırınga hazırlanması
    Not: Enjeksiyon şırınga enjeksiyon başlamadan hemen toz parçacıkları micropipette tıkanma riskini azaltmak için hazırlanmalıdır.
    1. Cam kılcal kiti montaj çıkarılabilir iğne sıkıştırması kullanan bir microliter şırınga üzerine monte. Sıkı sıkı ve güvenli uyum sağlar somun bağlayın.
    2. Microliter şırınga steril distile su ile doldurun ve dışarı pistonu ile basarak başlatın.
      Not: su kolayca ucunu dışarı gelmez böylece çok fazla direnç varsa, micropipette büyük olasılıkla engellendi ve değiş tokuş.
    3. Şırınga elektronik kontrollü bir microinjector bağlı bir micromanipulator üzerine monte. Micropipette şeyle dokunmamasını dikkat et.
    4. Microinjector kullanarak, hava su ve virüs arasında bir kabarcık oluşturmak için yaklaşık 1 µL kadar çizin.
    5. Stereotaksik çerçeve kullanarak damlacık micropipette ucunu taşımak dikkatli 2.5 µL damlacık virüs çözüm parafin film, bir parça üzerine yerleştirin ve onu çizin. O zaman dikkatle basın dağıtmak kadar biraz virüs çözümü ucunda ortaya çıkıyor.
    6. Şırıngayı geri çekmek ve bir kalemi, bir ölçek ile micropipette işaretleyin ve virüs çözümü düzeyini unutmayın; Bu infüzyon programlanmış gibi ilerliyor izleme kolaylaştıracaktır.
  9. Kesici iğne
    1. Bir beyin zarı delik yukarıda micropipette ucunu taşımak ve sonra hafif bir göçük dura içinde belirtildiği kadar aşağı. Spinal dorsal boynuz için enjeksiyon hedeflemek için doku mekanik stabilizasyon için izin vermek 500 µm 100 µm ardışık adımlarla (1 mm/s hız) ve daha sonra 200 µm yukarı aşağı iner.
      Not: Ucu son derinliği 300 µm bu durumda olduğunu, ancak hedef alan bağlı olarak adapte edilebilir.
      1. Doku penetrasyon için dayanıklı ise, micropipette dura üzerinde yakalamak. Bu durumda, geri çek ve biraz delik kaplamasını veya iğne dura düzgün penetrasyon girişimi tekrarlanmadan önce sorgulamaktı kullanmayı yeniden için hareket ettirin.
    2. 300 hedef enjeksiyon hacmi pompa programı nL bir enjeksiyon hızı 50 nL/dk ve Başlat düğmesine basın, infüzyon başlamak için.
    3. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra virüs düzeyi düşmüştür olup olmadığını görmek ve basınç yavaş yavaş şırınga çekiyoruz önce equilibrate için izin vermek ek bir 3 dk için yerinde micropipette bırakmak için ölçek kontrol edin.
    4. Adım 2.9.1.-2.9.3 tekrarlayın. diğer iki enjeksiyon siteler için.
  10. Dikiş ve kurtarma
    1. Omurilik kelepçeler ve yastık altında fare kaldırın.
    2. Kesintiye uğramış dikiş, yüzeysel doku katmanları ile absorbe dikiş ve cilt ile absorbe olmayan Dikiş dikiş katmanlarla yarada kapatın. İyot dezenfektan dikilmiş yaraya uygulayın.
    3. Anestezi bitirmek ve ev onun kafes dönmeden önce normale dönene kadar hayvan ısı mindere bırakın.
  11. Ameliyat sonrası bakım
    1. Ameliyat günü, ertesi gün ve daha sonra 2-3 günde hayvan sağlığını izlemek. Hayvan sağlamak normal bir yürüyüş, sağlıklı bir görünüm (ağırlık, gözler, kürk ve davranış) vardır ve yara iyileşiyor.
    2. Analjezik tedavi devam (örneğin, 0.1-0.2 mg/kg buprenorfin subkutan) gerektiği gibi üç kere-de gün.

3. davranışsal ve morfolojik analizleri

  1. Davranış Analiz
    Not: hayvanlar ölçümleri yeni deneysel çevreye uyum izin başlamadan önce ilgili kurulum için en az 30 dk karşılamak izin.
    1. von Frey Test
      1. Yer hayvanları tek tek bireysel bölmeleri yaklaşık 10 cm x 10 cm bir metal ızgara katta.
      2. Enjeksiyon yeri ile dinamik bir von Frey filament plantar Ipsilateral hindpaw yüzeyine teşvik. Hangi hayvan pençe uyarıcı çekilirse kuvvet unutmayın.
      3. Beş kez tekrarlayın ve ortalama para çekme eşik üzerinden her hayvan için altı ölçümleri hesaplayın.
    2. PIN Prick testi
      1. Bireysel bölümler yaklaşık hayvanlar koyun 10 cm x 10 cm bir metal ızgara katta.
      2. Penetrasyon cilt olmadan körelmenin 26-G iğneyle enjeksiyon yeri plantar Ipsilateral hindpaw yüzeyine teşvik. Davranış olarak sıfır (herhangi bir tepki) ya da (reaksiyon) puan.
      3. 9 kez ile elektrodlar arasında 3 dk aralıklarla tekrarlayın ve her hayvan için 10 ölçümleri yanıtından yüzdesi hesaplamak.
    3. Enjeksiyon DREADD-ligand klozapin-N-oksit (Kao)
      1. Kao Dimetil sülfoksit (0.2 mg/µL, hisse senedi bir çözüm oluşturmak için DMSO) oda sıcaklığında saklanan geçiyoruz.
      2. Deneme günü, hisse senedi steril % 0,9 çözümde sulandırmak için 0.2 µg/µL NaCl ve 10 µL/g vücut ağırlığı intraperitoneally enjekte. Denetim hayvanlar ile araç enjekte (% 0,2 DMSO içinde % 0,9 NaCl).
        Not: deneyim göre en yüksek etkileri davranışları beklenen 1-3 h sonra enjeksiyon olabilir ve etkileri tamamen 24 h sonra çökmek. Söz konusu olduğunda harekete geçirmek glycinergic nöronların az ağrı ve kaşıntı yanıt-e doğru katmak davranışlar görülmektedir. DREADD-aracılı etkinleştirme nöronların tarafından uyarılmış davranışları üzerinde spinal nöronların alt hedeflenen bağlı olacaktır.
    4. Kaşıntı ikna etmek için Pruritogens enjeksiyon
      1. Pruritogens %0,9 dağıtılması NaCl 8 mg/mL (klorokin) veya 10 mg/mL (histamin) çözümler için. 2 h sonra Kao yönetim, enjekte pruritogen ya da araç çözüm 10 µL subkutan spinal enjeksiyon yeri plantar Ipsilateral hindpaw yüzeyine içine. Alternatif olarak, pruritogen intradermally bir gün önce tıraş tarafından neden caydırıcı davranış azaltmak için traş buzağı içine enjekte.
    5. Spontan Nocifensive veya Pruritogen bağlı kaşıntı davranışları analiz etmek için kameraya
      1. Hayvanlar ayrı ayrı--dan onların anılan sıraya göre ev-kafes kattaki odada biraz şeffaf bölmeleri (yaklaşık 10 cm çapında) yerleştirin.
      2. Hayvanlar kayda kendiliğinden 5 min ve 30 dk pruritogen kaynaklı davranışları kaydetmek için video kaydı. 5 dk depo gözlerindeki devre dışı videolar analiz.
    6. Ağrı kaşıntı davranışları karşı
      1. Gözlemleyin ve Not i gözü kapalı, yalama ve davranışları ısırma.
        Not: İ gözü kapalı ve etkilenen sitenin yalama ısırma ise ağrı, yanıtlarını kabul kaşıntı ile ilişkilidir.
      2. Normal hızda videolar analiz, fare yalama veya etkilenen sitenin ısırma harcanan zamanı ölçmek veya yavaş yalamak ve refleksleri ısırma arasında daha kesin bir ayrım için ölçmek. Alternatif olarak, yalama/ısırma/i gözü kapalı nöbetleri saymak.
  2. Morfolojik analiz
    1. Bir ila üç hafta sonra enjeksiyon virüs veya davranışsal deney sonunda morfolojik çözümlemesi.
      Not: Biz eGFP ifade sürede 48 h olarak enjeksiyon sonra tespit var ama ifade önemli ölçüde içinde ertesi gün ve hatta hafta arttığını da bulundu. Güçlü muhabir ifade içeren hücreler için kuluçka (dan kesici enjeksiyon perfüzyon kadar) bir hafta yeterli olabilir. Zayıf transgene ifade, zayıf rehberleri veya zayıf fluorophores, virüs içeren hücreler için daha uzun bir ifade tespit düzeyleri sağlamak için gerekebilir.
    2. Doku fiksasyon
      1. Her fare transcardially ilk ile buz gibi yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glikoz 20 mM, KCl 2.5 mM ve CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), 20 ml 100 mL ile sonra sıvı (içinde 0.1 M sodyum fosfat tampon, pH 7,4) % 4 Buz gibi paraformaldehyde.
        Dikkat: Paraformaldehyde zehirli ve bakımı ile ele alınması gerekir.
      2. Hemen lomber spinal kord teşrih ve doku ile % 4 paraformaldehyde 2 h için buza sonrası düzeltin. Kısa bir süre sonrası sabit doku 0.1 M sodyum fosfat tampon (pH 7,4) ile yıkayın ve ardından çözümde %25 sukroz (0.1 M sodyum fosfat tampon, pH 7,4) gecede 4 ° C'de kuluçkaya
      3. Bir cryostat üzerinde 30 mikron, cryoprotected doku kesmek ve mikroskop slaytlarda bölümleri bağlayabilirsiniz.
    3. Ayirt boyama
      1. PBS içinde kısa yıkama sonra çözüm engelleme 300 μL uygulamak (% %0,3 10 Normal eşek serum Triton-PBS) bölümlerinde oda sıcaklığında 1 h için.
      2. 300 μL çözüm kapatmaktır birincil antikorların ilgili kombinasyonları ile slaytlar kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek) gece 4 ° C'de Bölüm 5 dk her PBS için 3 kez yıkayın.
      3. Oda sıcaklığında 1 h için engelleme çözüm ikincil antikor ilgili kombinasyonları ile slaytlar kuluçkaya. Bölüm 5 dk her PBS için 3 kez yıkayın.
      4. Kısaca slaytları GKD2içinde O durulama sonra floresan montaj orta kullanarak coverslips mount.
      5. Floresan görüntüleri 20 x 40 x amacı ile donatılmıştır ve confocal mikroskop kullanarak elde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir işaretleyici protein kodlama rAAV kesici iğne ile elde edilebilir ifade düzeyleri göstermek için ilk AAV1 enjekte. CAG.eGFP lomber spinal kord vahşi tipi farelerin içine. Üç enjeksiyonları aralıklı yaklaşık 1 mm ayrı üretilen lomber spinal segmentler L3 L5 için neredeyse sürekli bir enfeksiyon (şekil 1A-C). Omurilik yüzeyinden 300 µm derinlikte virüs enjeksiyon omurilik dorsal boynuz hücrelerinde baskın enfeksiyon yol açar. Ancak, enfekte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAVs kesici enjeksiyon yüksek zamansal ve mekansal çözüm ile spinal hücreleri analizini sağlayan güçlü bir teknik araştırma laboratuvarında hale gelebilir. Bu iletişim kuralı hindlimb için onların periferik aksonlar uzanan duyusal sinir hücreleri tarafından innervated üç ana omurga segmentleri iletim sağlar. Üç transducing sağlam ve tekrarlanabilir davranış veri üretir. Ayrıca mümkün daha geniş bir duyu alanı tek bir kesici enjeksiyon sonra test sağlar. Örneğin, aynı enjeksiyon rejimi pençe test etmek için izin verir (vo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hanns Ulrich Zeilhofer cömertçe Bu eser destek için teşekkür ederiz. Hendrik Wildner Olga Mayenfisch Vakfı tarafından desteklenmiştir. Carmen Birchmeier Lmx1b antikor için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman
mikropipet çektirme: DMZ-Universal-Elektrot-ÇektirmeZeitzNA
anestezi ünitesi: Oxymat3 oksijen konsantratörüWeinmannNA
anestezi ünitesi: VIP 3000 Veteriner BuharlaştırıcıMidmarkNA
Isı matı: Mio Star Thermocare 100Migros
Elektrikli tıraş makinesiPhilipsBT9290
cerrahi mikroskop (OPMI pico)ZeissNA
Küçük hayvan stereotaksik aparatıKopfNA
Neurostar StereoDrive (isteğe bağlı)NeurostarNA
Model 51690 Cunningham fare omurga adaptörüHarvard Aparatı72-4811
Nanomit Harvard Aparatı ile PHD Ultra şırınga pompası70-3601
Hamilton 701 RN 10 & mu; l cam mikrolitre şırıngaHamilton7635-01
Hamilton Çıkarılabilir iğne (RN) sıkıştırma bağlantısı 1 mmHamilton55750-01
ince diş hekimliği delme aparatı: Osada başarısı 40OsadaOS-40
küresel kesici, 0,5 mmBusch12001005B
elektronik von Frey anesteziyometresiIITC23905
esnek von Frey kıllarıIITC#7
LSM710 Pascal konfokal mikroskopZeissNA
0.8 NA & kez; 20 Plan-apokromat objektifZeissNA 1.3
NA & kez; 40 EC Plan-Neofluar yağa daldırma objektifiZeissNA
strong>NameCompanyKatalog NumarasıComments
Cerrahi Aletler
Neşter Sapı #4, 13cmGüzel Bilim Aletleri10004-13
Ekstra İnce Bonn MakasGüzel Bilim Aletleri14084-08
Adson forseps, 1 x 2 diş, 12 cmGüzel Bilim Aletleri11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, kavisli, 0,7 mm fincanGüzel Bilim Aletleri16121-14
Dumont #2 laminektomi forsepsGüzel Bilim Aletleri11223-20
Olsen-Hegar iğne tutucular, tırtıklı, 8,5 mm kelepçe uzunluğuGüzel Bilim Aletleri12002-12
İnce forseps #5Güzel Bilim Araçları11254-20
NameCompanyKatalog NumarasıComments<
strong>Sarf Malzemeleri ve Kimyasallar
İnce duvarlı cam kılcal, 1mm dış çapWorld Precision InstrumentsTW 100-3
Şırıngalar (1, 5 ve 20 ml)B. Braun(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G eğimli iğneB. Braun4665457
Steril neşter bıçaklarıB. BraunBB523
Cerrahi sütürler Safil Quick+ 4/0, emilebilirB. BraunC1046220
Cerrahi sütürler Premilene 5/0, emilmeyenB. BraunC0932191
Steril PBS veya salin (%0,9)NA
Etanol, %70 (dezenfektan)NA
İyot çözeltisi (örneğin Braunol)B. Braun18380
Anestezikler (örneğin Attane izofluran)Provet2222
AldasorberProvet333526
analjezikler (örn. buprenorfin: temjezik)BireyselGTIN: 7680419310018
Oftalmik merhem (örneğin vita-pos)Pharma medicaGTIN: 4031626710635
Pamuklu çubuklar (örn.itibaren)IVF Hartmann1628100
Yüz dokuları (örn. itibaren)Uehlinger AG2015.10018
Superfrost plus mikroskop slaytlarıThermoScientificJ1800AMNZ
NameCompany Katalog NumarasıComments
Fareler
C57BL/6J fareler (vahşi tip)Jackson LaboratuvarıRRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J fareler (RORβ Cre)Jackson LaboratuvarıRRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J fareleri (R26Tom)Jackson LaboratuvarıRRID: IMSR_JAX:007914
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Viral vektörler
AAV1. CB7 olarak adlandırılır. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)Penn Vektör ÇekirdeğiAV-1-PV1963
AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)Penn Vektör ÇekirdeğiAV-1-ALL854
AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)		Penn Vektör ÇekirdeğiAV-1-ALL864
AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)Penn Vektör ÇekirdekÖzel üretim
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))Penn Vektör ÇekirdekÖzel üretim
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361
pAAV.EF1α. flex.hChR2(H134R)-eYFPAddgene20298
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Bacteria
MDS42ScarabGenomics
Stbl3ThermoScientificC737303
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Reagents
EndoFree Plazmid Maxi KitiQuiagen12362
NucleoBond PC 500Machery & Nagel740574
klozapin-N-oksit (CNO)Enzo Yaşam BilimleriBBL-NS105-0025
klorokin difosfat tuzuSigmaC6628
histaminSigmaH7125
DapiInvitrogenD3571
İsimCompany<strong>Katalog NumarasıComments
Antikorlar (seyreltme)
Tavşan anti-GFP (1:1000)Moleküler ProblarRRID:AB_221570
Tavşan anti-NeuN (1:3000)AbcamRRID:AB_10711153
Keçi anti-Pax2 (1: 200)R & D SistemleriRRID:AB_10889828
Kobay anti-Lmx1b (1: 10 000)Dr Carmen BirchmeierMuller et al. 2002
Tavşan anti-GFAP (1: 1000)DakoCytomationRRID:AB_10013382
Eşekte yükseltilen ikincil antikorlar (1:800)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesNA
717614700000<

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413(2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313(2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306(2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cre ba ml Vekt rlerntraspinal EnjeksiyonDorsal BoynuzGlyT2 Cre FareleriStereotaksik CerrahiViral Transd ksiyonN ronal Altpop lasyonlarDuyusal leme

İlgili makaleler