Yöntem makalesi

Gümüş nano tanecikleri ve onların antibakteriyel faaliyetleri ve sitotoksik özellikleri değerlendirilmesi ile modifiye çok duvarlı karbon nanotüpler sentezi

DOI:

10.3791/57384

⸱

10 Mayıs 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, antimikrobiyal Nanomalzemeler asidik multiwalled karbon nanotüpler oksidasyonunu ve gümüş nano tanecikleri sonraki indirgeyici birikimi tarafından sentezlenen. Antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisite testi hazırlanan Nanomalzemeler ile gerçekleştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, bir oksijen tabanlı fonksiyonel grup oluşturmak için sulu sülfürik asit çözümünü çok duvarlı karbon nanotüpler (MWCNTs) tedavi edildi. Gümüş MWCNTs sulu bir çözüm AgNO3 oksitlenmiş MWCNTs üzerinde gümüşten indirgeyici birikimi tarafından hazırlanmıştır. CNTs benzersiz renk göz önüne alındığında, minimum inhibitör konsantrasyonu veya mitokondrial toksisite deneyleri onlar deneyleri ile müdahale beri toksisite ve antibakteriyel özellikleri değerlendirmek için onları uygulamak mümkün değildi. İnhibisyon bölge ve Ag-MWCNTs için en az bakteri konsantrasyonu ölçüldü ve canlı/ölü ve Trypan mavi deneyleri CNTs rengiyle engel olmadan toksisite ve antibakteriyel özellikleri ölçmek için kullanıldı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı bu formu biyofilmler bakterilerin büyümesini inhibe olabilir çevre dostu antibakteriyel Nanomalzemeler yapmaktır. Bu antibakteriyel Nanomalzemeler sık kullanılan kimyasallar veya antibiyotik kimyasal bileşiklerin toksisite ve antibiyotik direnç sorunların üstesinden potansiyeline sahip. Bir biyofilm polisakkaritler, proteinler, nükleik asitler ve yağlar1,2/ oluşan bir sulu ekstraselüler polimer (EPS) maddedir. Biyofilmler yabancı maddelerin görüntülemelerini önlemek ve bakteri şiddetle3,4büyümeye yardımcı olur. Biyofilmler neden koku ve kronik enfeksiyon hastalıkları5,6. Methylobacterium spp., örneğin, su her zaman mevcut olduğu veya sürekli olarak, Klima Isı değiştiriciler, duş odaları ve tıbbi cihazlar gibi bakteriyel eradikasyon sağlamak zor nerede yerlere kalarak büyür. Bu tür biyofilmler neden koku ve kronik enfeksiyon hastalıkları5,6.

Tipik olarak, kimyasal madde veya antibiyotik kimyasal bileşikler biyofilmler oluşturan bakterilerin büyümesini engellemek amacıyla kemoterapide kullanılırlar. Antibiyotik dirençli bakteri ve kimyasal maddelerin vivo içinde güvenliği konusunda endişeleri ortaya çıkması yeni malzemeler biyofilmler oluşumunu önlemek için ve bakterilerin büyümesini inhibe geliştirmek gerek ilerliyorsunuz.

Bu çalışmada, antimikrobiyal Nanomalzemeler antibiyotik direnci ve toksisite ücretsiz olan sentezlenmiş. Gümüş bir iyi bilinen antimikrobiyal madde ve Nanobilim ve nanoteknoloji son gelişmeler için aktif araştırma metal nano tanecikleri7,8antimikrobiyal etkileri açmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda küçük boyutu ve nano tanecikleri yüksek yüzey hacim oranı artan antibakteriyel etkinliği9,10,11' neden bildirdi.

Burada sunulan Nanomalzemeler gümüş nano tanecikleri artan Antimikrobiyal Özellikleri ve karbon nanotüpler bir yüksek en boy oranıyla böylece yüzey alanı birim hacim başına artan ile birleştirir. Fabrikasyon gümüş nanopartikül-karbon nanotüp kompozit önemli Antimikrobiyal Özellikleri ve insan ve hayvan hücreleri için en az toksisite sergiler. Önceki çalışmalarda sentetik süreçlerinde NaBH4, formamide, dimethylformamide ve hidrazin gibi tehlikeli azalan bakiyeli aracıları kullanın. Karmaşık, tehlikeli ve zaman alıcı bir süreçtir. Rapor sentetik işlemi burada önemli ölçüde daha az tehlikeli bir indirgeyici etanol kullanır.

İnhibisyon bölge ve Ag-MWCNTs için en az bakteri yok edici yoğunlaşması (MBC) ölçüldü; Canlı/ölü ve Trypan mavi deneyleri toksisite ve antibakteriyel özellikleri ölçmek için kullanıldı. Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) ve mitokondrial toksisite (MTT) deneyleri deneyleri ile müdahale karbon nanotüpler alışılmadık rengini nedeniyle yapıldı değil. Son olarak, memeli hücreleri etkilemeden Methylobacterium spp. gelişimini önlemek için en az konsantrasyon tespit edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MWCNT oksidasyon

  1. MWCNT 30-50 mg 50 mL şişe içine ölçmek. Yavaş yavaş H28 mL kadar ekleyin4: HNO3 çözüm (% 90'ı ilk konsantrasyon, 3:1 vol/vol) pipet ile 1 mL pipet ipuçları tarafından.
    Dikkat: Bir kimyasal duman mahallede bu hazırlık yapılmalıdır.
    1. 30 dk tamamlamak ekzotermik reaksiyon için izin.
  2. MWCNT şişe dibinde yerleşir kadar çözüm 60-80 ° C ve 160 W 1 h için solüsyon içeren temizleyicide.
    Dikkat: böylece su şişe tanıttı değil sonicator su üstüne şişenin üst düşük olmalıdır.
  3. Çözüm bir santrifüj tüpü aktarın.
    1. Bir micropipette ile 30 mL distile su dropwise MWCNT-COOH ekleyin.
      Dikkat: Saf su ilavesi sırasında güçlü bir ekzotermik reaksiyon oluşur. Distile su yavaş yavaş ekleyin ve soğutma için zaman sağlar.
  4. MWCNT-COOH çözüm, 12.000 x g ve oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi.
    Dikkat: bir santrifüj çalışırken, santrifüj bir tüp ile örnek tüp karşısında aynı ağırlık koyarak dengeli korumuş.
  5. Süpernatant pipet ve 1 mL pipet ucu ile kaldırın. 5 mL etanol bir pipet ve 1 mL pipet ucu ile de ekleyin. Şişeyi ek pipetted etanol ile duvarları durulayın. Belgili tanımlık eriyik vasıl 12.000 x g ve oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi.
    1. PH pH kağıt ile süpernatant belirlemek. Yıkama ve süpernatant pH nötr olana centrifuging yineleyin.
  6. Tüm süpernatant kaldırın. 1 mL distile su çökelti ve MWCNT-COOH eşit olarak çözümde dağıtmak için ekleyin. Çözüm-60 ° c vakum altında kuru kadar şeytanibir.

2. gümüş nanopartikül ifade MWCNTs üzerinde

  1. MWCNT-COOH 10 mg 50 mL konik tüp içinde yerleştirin ve 30 mL distile su ile oranında seyreltin. Çözüm 60 ° C ve 160 W 1 h için solüsyon içeren temizleyicide.
  2. Bir 50 mL konik tüp içinde 6 mL 0,1 N AgNO3 yerleştirin ve 18 mL distile su ile oranında seyreltin. Çözüm 60 ° C ve 160 W 1 h için solüsyon içeren temizleyicide.
    Dikkat: Ag toplam kütlesinin % 20 fazla olamaz öyle ki AgNO3 MWCNTs toplam kütlesi ile orantılı olarak ekleyin.
  3. AgNO3 çözüm dropwise MWCNTs çözüm bir pipet ve 1 mL pipet ucu ile 60 ° C ve W. AgNO3ekledikten sonra devam etmek için 1 h sonicating 160 karisimin sonicating ekleyin.
  4. Belgili tanımlık eriyik vasıl 12.000 x g ve oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Çözüm santrifüj kapasitesi ve süpernatant iki ek kez kaldırın.
  5. 1 mL distile su Ag-MWCNTs karışıma ekleyin ve çökelti çözümde eşit olarak dağıtmak. 5 mL etanol de ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında devam etmek tepki.
  6. Belgili tanımlık eriyik vasıl 12.000 x g ve oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
  7. PH pH kağıt ile süpernatant belirlemek. Yıkama ve süpernatant pH nötr olana centrifuging yineleyin.
  8. Ag-MWCNTs için 1 mL distile su ekleyin ve eşit olarak çözümde dağıtmak. Çözüm için 24 h vakum altında-70 ° C'de şeytanibir.

3. bölge inhibisyon Test

  1. R2A agar 18.12 g ve 1 L bir balonun içinde distile su karışımı. Karışımı bir otoklav 121 ° C'de 15 dakika sterilize.
  2. Oda sıcaklığında soğumaya jel izin. 10 mL jel Petri yemekler sertleştirme katı ortam hazırlamak için önce yerleştirin.
  3. Yer 100 µL katı ortamda bakteri. Bir dağıtıcı kullanarak katı ortamda bakteri yaymak.
    Dikkat: Bir alkol lamba ile yaktı bir kimyasal duman başlıklı bu yordamı yürütülmelidir.
  4. 48 h 30 ° C'de yemekleri kuluçkaya.
  5. R2A suyu 3,12 g 1 L bir balonun içinde distile su ile karıştırın. Karışımı bir otoklav 121 ° C'de 15 dakika sterilize.
  6. Yetişkin kolonileri bir döngü ve iğne kullanarak bir sıvı ortamına aktarmak ve bir kuluçka 180 rpm ve 30 ° c kuluçkaya
  7. OD (optik yoğunluk) değer UV spectrophotometry 600 tarafından kayıt Bakteriyel büyüme ölçmek için saatlik bazda nm.
    Not: R2A büyüme Methylobacterium spp. için tercih edilen agar olduğundan R2A agar bu testi yerine standart Mueller Hinton agar kullanıldı
  8. Hazırlanan R2A agar alt agar hazırlamak için bir petri içinde yer 10 mL.
    1. 3,12 g R2A suyu ve agar 8 g 1 litre saf su ile karıştırın. Bu jel alt agar üzerinde 15 dk. yer 10 mL için 121 ° C'de bir otoklav karışımı sterilize.
  9. Ag-MWCNTs çözüm bir micropipette ile steril kağıt diskte 50 µL yükleyin.
    1. Kuru ve Ag-MWCNTs örnek UV için 30 dk ışığı altında bir vakum odasında sterilize.
  10. Yer Ag-MWCNTs örnek agar üzerinde.
  11. 48 h 30 ° C'de agar plaka kuluçkaya.
  12. Ölçü birimi bölge inhibisyon12.
    Not: Kullanılan yazılımlar için yönergeler başvurular içinde yer almaktadır.

4. antibakteriyel Test

  1. 3.1-3.7 bakteriyel kültür hazırlamak için adımları yineleyin.
  2. Maksimum doz pipet ve 100 µL mikro pipet ucu ile taze sıvı orta 3 mL içine bakteri 100 µL aşılamak.
  3. Beş hazırlamak kontrol çözümü 15 mL konik tüpler 50 µL örnekleri. Her tüp için aşağıdakileri ekleyin: 1) metanol; 2) 1000 µg/mL MWCNT-COOH; 3) 50 µg/mL Ag-MWCNTs; 4) 40 µg/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 µg/mL Ag-MWCNTs.
  4. Denetim yukarıda açıklandığı gibi UV spectrophotometry tarafından belirlenen maksimum etkinleşinceye kadar 180 rpm ve 30 ° C kuluçkaya.
  5. Her örnek OD değerini ölçmek ve mikrofon konsantrasyonu hesaplayın. OD değer örnek suyu bakteriyel hücre sayısı için doğrudan ilgilidir.
  6. Bir dağıtıcı ile sağlam bir ortamdaki kültürlü bakteri yaymak.
  7. Yemek için 48 h 30 ° C'de kuluçkaya.
  8. Bakteri kolonileri ve antibakteriyel etkinliği12belirlemek için ölçü CFU değerleri sayısı.
    Not: Kullanılan yazılımlar için yönergeler başvurular içinde yer almaktadır.

5. canlılığı tahlil

  1. Kültür hücreleri kuluçka--dan kaldırma sonra orta emiş ve üç kez PBS 5 mL dropwise yıkama ile yıkayın.
  2. Tripsin-EDTA 1 mL PBS içinde 1 dakika sonra yıkanır hücre ve emme ekleyin.
    1. Sıkışmış hücre kaldırma için plaka dokunun.
  3. DMEM (Dulbecco'nın modifiye kartal orta) 5 mL ekleyin ve sonra hücreleri kaldırın. 200 x g 3 dk de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
    1. 1 mL DPBS ve karışımı ekleyin.
    2. Çözüm 10 µL hücrelerde Hücre sayımı otomatik bir makine ile saymak.
      Not: Yönergeler kullanılan hücre sayımı makine için başvurular13' te yer almaktadır.
  4. Yer 1 × 105 AML12 hücre DMEM solüsyon içeren bir altı-şey plaka bir kuyu başına. Orta % 10 (v/v) fetal sığır serum ve % 1 steril antibiyotik içerir.
  5. 8-12 h 37 ° c % 5 CO2/95% hava ortamında için levha kuluçkaya.
  6. Bir aspiratör ile kuyulardan süpernatant aspirasyon.
    1. Denetim, NMS-DMSO (Dimetil sülfoksit) ve 30-40 µg/mL Ag-MWCNT DMEM, 1 ml oluşan her örnek ekleyin.
    2. 8 h için % 5 CO2/95% hava ortamında 37 ° C'de kuluçkaya.
  7. 5 mL de PBS süpernatant ve yıkama örnekleriyle kaldırın.
  8. Hazırlanan canlı/ölü seti (4 mM calcein AM içinde DMSO PBS 10 ml 5 µL ile 2 mm EthD-1 20 µL) 1 mL dropwise hücreye ekleyin.
  9. Room temperature 30-45 dakika veya 10 dk. ölçü floresan için 37 ° C 100 X veya 300 X standart floresan mikroskobu ile kuluçkaya.

6. Trypan mavi tahlil

  1. Örnekleri adımları 5.1 5.6.2 yukarıdaki aracılığıyla göre hazırlayın.
  2. Süpernatant kaldırın.
  3. 1 x DPBS 1 mL ile tabak yıkama ve dikkatle boşaltmak.
  4. Plaka ve kültür hücrelerden ayırmak için 3 dakika için kuluçkaya tripsin 1 mL ekleyin. Hücre kültür orta tabak yıkama ve hücreleri toplamak için kullanın. Kendine hakim hücre bir 15 mL tüp içinde yerleştirin.
  5. Tüp 200 x g ve 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi.
  6. Süpernatant atmak. 1 mL taze Orta hücre Pelet ekleyin ve hücreleri yeniden dağıtmak.
  7. Trypan mavi 10 µL dağınık hücre 10 µL ile ekleyin ve Hücre sayımı otomatik bir makine ile hücreleri saymak.
    Not: Kullanılan hücre sayımı makine için yönergeler başvurular içinde yer almaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri Ag-MWCNTs (şekil 1A ve 1B) oluşumu onaylayın. Onların başarılı sentez yüzey sorumlu değişiklik tarafından doğrulandı. MWCNTs yatırılır Ag parçacıkların boyutunu hesaplanmıştır (şekil 1 c). Ortalama partikül büyüklüğü yaklaşık 3,83 yapıldı nm. Sentezlenmiş Ag-MWCNTs XRD desen şekil 1 diçinde gösterilir. Tepe 20-30° MWCNT için karşılık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yatırılan Ag nano tanecikleri ile MWCNTs hazırlanması için basit bir yöntem raporu. Bu gümüş içeren nanomaterial önemli antibakteriyel etkinliği ve gümüş nano tanecikleri kontrolsüz emilimini vücuttaki en az potansiyel gösterir. Biz göstermek sentezlenmiş Ag-MWCNTs 30 µg/mL Methylobacterium spp. karşı antibakteriyel etkinliği memeli karaciğer hücreleri için ihmal edilebilir sitotoksisite ile etkili bir düzeyde olduğunu. Genişleme ticari sektöründe daha önce gerekli ek geliştirmeler ve Biyogüvenlik değerl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Chung-Ang Üniversitesi araştırma hibe (2016) ve Nano-malzeme teknoloji geliştirme programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, ICT (No. 2017M3A7B8061942) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Korea(NRF) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.1 N gümüş nitratSIGMA-ALDRICH1090811000
Karbon nanotüp, çok duvarlıTokyo Chemical Industry Co., LTD308068-56-6
R2A agarMBcellMB-R1129
R2A et suyuMBcell MBcellMB-R2230<
em>Methylobacterium spp.KCTC12618Kore Tip Kültürleri Koleksiyonu'ndan Daejeon Kore 12618, Daejon, Kore
CANLI/ÖLÜ Hücre görüntüleme KitiThermoFisher BİLİMSELR37601
AML12Chungnam Üniversitesi, Dajeon, Kore'den
insan PBMCATCCPCS-800-011
TEMJEOLJEM-2100F
XRD RigakuD/MAX 2500Cu K foton kaynağı (40kV, 100mA)
JuLI BrNanoEnTekJULI-BRSC 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
  3. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  4. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
  5. Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
  6. Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
  7. Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
  8. Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
  9. Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346(2005).
  10. Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
  11. Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
  12. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
  13. NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antibakteriyel AktiviteNanokompozit SenteziG m Birikiminhibisyon ZonuMinimum Bakterisid KonsantrasyonuTrypan Blue AnaliziCanl l Analizi

İlgili makaleler