Method Article

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

DOI:

10.3791/57386

⸱

May 2nd, 2018

 ,  , 
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multicopy plazmid Prokaryotlarda son derece bol miktarda bulunmaktadır ancak bakteri evriminin içindeki rollerine kötü anlaşılır kalır. Biz son zamanlarda Gen kopya numarası multicopy plazmid tarafından sağlanan hücre başına artış plazmid kodlanmış genler evrimi hızlandırmak gösterdi. Bu çalışmada, biz multicopy plazmid gen evrim teşvik yeteneğini test etmek için deneysel bir sistem mevcut. Basit moleküler biyoloji yöntemleri kullanarak, nerede bir antibiyotik direnci gen Escherichia coli MG1655, kromozom veya multicopy bir plazmid üzerinde içine yerleştirilebilecek bir modeli sistemi inşa edilmiştir. Antibiyotiklerin konsantrasyonları artan altında farklı suşları yaymak için bir deneysel evrim yaklaşım kullanmak ve bakteriyel nüfus yaşama zamanla ölçüyoruz. Böylece gen sadece direnç mutasyonları edinimi ile görüşmek antibiyotik molekül ve direnç gen seçimdir. Bu "evrimsel kurtarma" yaklaşım antibiyotik direnci edinimi tanıtmak için multicopy plazmid potansiyelini test etmek için basit bir yöntem sağlar. Deneysel sistem sonraki adımda antibiyotik direnci moleküler üsleri karakterizedir. Mutasyonlar tanımlamak için antibiyotik direnci edinimi için sorumlu tüm nüfus ve klonlar elde örnekleri derin DNA sıralama kullanın. Son olarak, altında eğitim gen mutasyonların rolü onaylamak için biz onları ebeveyn arka planda yeniden ve direnç fenotip elde edilen suşların sınayın.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterilerde antibiyotik direnci önemli bir sağlık sorunu1' dir. Temel düzeyde, antibiyotik direnci patojen bakteri yayılmasını evrimin doğal seleksiyon2,3tarafından basit bir örnektir. Basitçe söylemek gerekirse, kullanma-in antibiyotik dirençli suşların için seçim oluşturur. Bir anahtar Evrimsel Biyoloji, bu nedenle, antibiyotik direnç gelişmeye bakteriyel nüfus yeteneğini etkileyen faktörleri anlamak için sorundur. Seçim deneyler bakterilerin Evrimsel Biyoloji araştırmak için çok güçlü bir araç olarak ortaya çıktı ve bu alanda inanılmaz geniş bir evrimsel sorunları4....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. deneysel sistem antibiyotik direnci Gene kodlama inşaatı

Not: Burada E. coli MG1655 plazmid veya Kromozom kodlanmış antibiyotik direnci gen alıcı suşu kullanıldı. Antibiyotik direnci geni kromozom veya bir başka türlü isogenic zorlanma (şekil 1) içinde multicopy bir plazmid kodlanmış olduğunu.

  1. MG1655 kromozom λ fajının Tümleştirme sitesi (attB)20 antibiyotik direnci gen ekleme.
    1. Kromozom attB sitesi PCR tarafından her iki tarafında, 500 bp-uzun bölgeleri yükseltmek. Oligonucleotides YbhC-F kullanın (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAA....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki çalışmalarda, evrim direnç üçüncü kuşak sefalosporin ceftazidime12 veriyor doğru β-lactamase gen blaTEM-1 araştırılmıştır. Çünkü her ne kadar TEM-1 ceftazidime direnç görüşmek değil, blaTEM-1 mutasyonların etkinlik TEM-1 sefalosporinler ceftazidime29gibi hidrolize aralığını genişletebilirsiniz, bu gen seçildi. Antibiyotik direnci enzimler β-laktamaz veya değişiklik etkinliği onların kapsama alan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz moleküler biyoloji, deneysel evrim ve evrim bakterilerde antibiyotik direnci ve multicopy plazmid rolünü araştırmak için tasarlanmış derin DNA sıralama birleştiren yeni bir iletişim kuralı mevcut. Her ne kadar bu iletişim kuralı teknikleri farklı alanlardan birleştiren, onu geliştirmek için gereken tüm yöntemleri basit ve düzenli Mikrobiyoloji laboratuvar olarak gerçekleştirilebilir. Protokol en kritik adımlarda muhtemelen modeli sistem suşları inşası ve yeniden yapılanma (ki tam olarak aynı yöntemi kullanarak gerçek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Instituto de tarafından desteklenen Salud Carlos III (Plan Estatal de ben + D + ben 2013-2016): CP15-00012, PI16-00860 ve CIBER (CB06/02/0053), ortak '' Europe ulaşmanın bir yolu '' Avrupa Kalkınma bölgesel Fonu tarafından finanse hibe (ERDF). JAE Madrid (2016-T1/biyo-1105) ve ben hükümet Atracción de talento program tarafından desteklenmektedir + D Excelencia, İspanyol "gayri resmi" de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM: Instituto de Miguel Servet bursu tarafından desteklenmektedir Salud Carlos III (MS15/00012) ortak Avrupa Sosyal Fonu tarafından finanse edilen "senin geleceğine yatırım" (ESF) ve ERDF.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ThermocyclerBioRadC1000
ElektroporatörBiorRad1652660
Elektroporasyon küvetleriSigma-AldrichZ706078
NanoDrop 2000/2000cThermo Fisher ScientificND-2000260nm/280nm ve 260nm/230nm İnkübatör Memmert absorbans oranlarını ölçerek DNA kalitesini belirleyin
UF1060
İnkübatör (çalkalayıcı)Cole-Parmer LtdSI500
Elektroforez güç kaynağıBioRad1645070Agaroz jel elektroforezi
Elektroforez odasıBioRad1704405Agaroz jel elektroforezi
PippettesBiohit725020, 725050, 725060, 725070
Çok kanallı pippetlerBiohit728220, 728230,
728240
Plaka okuyucu Synergy HTXBioTekBTS1LF
Aşılama döngüleriSigma-AldrichI8388
96 kuyulu plakalarFalcon351172
LB BD DifcoDF0446-17-3
LB agarFisher bilimselBP1425-500
Phusion PolimerazThermo Fisher ScientificF533S
Gibson MeclisiNew England BiolabsE2611S
Resctriction enzimleriFermentas FastDigest
AntibiyotiklerSigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep KitiQiagen27104Plazmid ekstraksiyon kiti
Sihirbaz Genomik DNA Saflaştırma KitiPromegaA1120gDNA ekstraksiyon kiti
DNeasy Kan & Doku KitleriQiagen69506gDNA ekstraksiyon kiti
Elektroporasyon küvetleriSigma-AldrichZ706078
Petri kaplarıSigma-AldrichD9054
KriyotüplerClearLine390701
96 oyuklu plakalar (-80º C depolama)Thermo Fisher Scientific249945
QuantiFluor dsDNA SistemiPromegaE2670DNA konsantrasyonunun miktar tayini
AgaroseBioRad1613100Agaroz jel elektroforezi
50x TAE tamponuBioRad1610743Agaroz jel elektroforezi
T4 Polinükleotid KinazThermo Fisher ScientificEK0031
T4 DNA LigazTermo Fisher BilimselEL0014

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. M....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multicopy PlasmidsAntibiotic ResistanceExperimental EvolutionEscherichia coliGene Copy NumberPlasmid ConstructionDeep DNA SequencingEvolutionary RescueAntibiotic SelectionMutation Analysis

Related Articles