Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Kromozomlar düzgün ve güvenilir bir şekilde kızı hücrelere Mitotik hücre bölünmesi sırasında ayrılmış gerekir. Kromozom segregasyon kalitesini Milli Meclis denetim noktası (SAC) içeren birden fazla mekanizma ile kontrol edilir. Bu zarın içinde durur bütün kromozom kinetochores mikrotübüller iğ bağlı sürece mitoz hücre ilerlemeyi önlenmesi için sorumlu olan bir karmaşık geribildirim sisteminin bir parçasıdır. Kromozom ahşap kaplama ve anormal kromozom segregasyon işlevsel olmayan hücre döngüsü kontrol denetim noktaları bir göstergesidir ve hücre bölünmesi genomik istikrar ölçmek için kullanılabilir. SAC deregülasyon normal bir hücre dönüştürme hataları biriktirme esnasında kromozom segregasyon aracılığıyla bir malign hücre içine neden olabilir. Kinaz ve fosfataz gibi Protein fosfataz 2A arasındaki etkileşimler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmiş SAC uygulanması ve karmaşık kinetochore oluşumunu (PP2A). Bu iletişim kuralı kromozomlar fare embriyonik fibroblastlar vardı bir PP2A-B56γ yasal alt birimi nakavt fareler izole içinde kalmış, canlı hücre görüntüleme açıklar. Bu yöntem yalnızca bir hücre sitokinez durumu, dinamik bir kronolojik zamanmekansal görselleştirme kromozomların yerine bir görüntüsünü sağlayan diğer hücre döngüsü kontrol görüntüleme teknikleri Akış Sitometresi veya immunocytochemistry gibi eksikliklerin üstesinden gelir. mitoz sırasında.
Giriş
Aşağıdaki iletişim kuralında, kromozom segregasyon ve fare embriyonik fibroblastlar Histon 2B-GFP ve canlı hücre görüntüleme BacMam 2.0 etiketleme kullanarak hücre döngüsü sırasında Mitotik ilerleme görselleştirmek için uygun bir yöntem açıklanmaktadır.
Hücre döngüsü kontrol denetim noktaları kromozom segregasyon izlemek ve hücre 1,2,3genetik bütünlük bakımından önemli bir rol oynamaktadır. Yanlış ayrılmış kromozomlar birikimi anöploidi için hangi en sağlam tümörleri 4özelliğidir yol açabilir. Bu nedenle, kromozomlar gerisin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmalarda yapılan tüm deneylerde gıda ve İlaç Dairesi (FDA) araştırma tesisinde kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. yalıtım ve kültür fare embriyonik fibroblastlar (MEFs)
- Fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) PP2A-B56γ-fare zorlanma ve vahşi türü littermates standart protokol 7,8,9tarafından izole et.
- ExpandMEFs için 3 pasajlar, donma ve deneyler 8için ihtiyaç kadar saklayın.
2. kodlamayla Mefs ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MEFs vahşi türü ve PP2A-B56γ-fareler bir 2-şey odası kapak cam tohumlari ve takmak için izin. 2 günde MEFs % 0.1 kullanarak senkronize FBS 24 h için. Günde 3, MEFs medya ile 200 ng/mL üzerinde nocodazole ve 30 PPC CL-HB regentwere inkübe 37 18 h için° C ve % 5 CO2. 4 günde bir iplik disk confocal mikroskop sistemi (şekil 1) kullanarak hücreleri görüntüsü. Canlı hücre görüntüleme mitoz (Şekil 2) NEBD ilerledi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Doğru kromozom segregasyon sağlamak hücre döngüsü kontrol denetim noktaları dönüşüm 1,2,3anöploidi ve hücre önlemek. Bu da çalışmanın, PP2A-B56γ o inactivation bulduk zayıflamış Milli Meclis denetim noktası içinde sonuçlandı. Canlı hücre görüntüleme kromozom mis ayrışma sırasında mitoz PP2A-B56γ MEFs içinde nocodazole 9ile tedavi gözlemlemek için bize izin.
Bu iletişim kuralı i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Teşekkürler
Dr. Guo-Chiuan Hung ve Dr Bharatkumar Joshi el yazması geliştirilmiş değerli yorum için teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM / F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030081 | |
| MEM Esansiyel Olmayan amino asit çözeltisi (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu salin | Gibco | 14190144 | |
| Tripsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal sığır serumu | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Kriyojenik flakon saklama kutuları | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Kriyojenik şişeler | Corning/costar | 431416 | |
| T75 şişeleri | Cellstar | 658175 | |
| 2 iyi odacıklı kapak camı | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Hücre Gözlemcisi Eğirme Diski Konfokal Mikroskop sistemi | Carl Zeiss | Mikroskopi Zeiss Hücre Gözlemcisi SD | |
| Su Banyosu | Thermoscientific | 280 serisi | |
| İnkübatör | Sanyo ticari çözümler | MCO-18AIC (UV) | |
| Sınıf II Biyolojik güvenlik kabini | Fırıncı Şirketi | SterilGard | |
| Axiovision yazılımı | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ yazılımı | Ulusal Sağlık Enstitüsü | Ver. 1.51r |
Kaynaklar
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
