Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

8.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57423

⸱

24 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

Bu makalede

Özet

Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.

Özet

Bu video enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (TEM-EDX) iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için iletim elektron mikroskobu kullanımını sunar: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Askorbik asit (AA) ve β-gliserofosfat (β-GP) ile tedavi sonrası bu hücre satırları Qafqaz için nükleer silahların yayılmasına karşı gelen tam osteojenik transdifferentiation geçmesi ve apatit çekirdekleşme tetiklemek matris veziküller (MVs) üretmek hücre dışı matriks (ECM).

Alizarin Red-S (AR-S) boyama ve mineraller ultraviyole (UV) ışık kullanarak hücre lysates veya veziküller ardından EDX Nefelometri ve iyon eşleme TEM Imaging'i kullanma kompozisyon analizi dayalı, biz o osteosarkom sonucuna SAO'lar-2 ve osteoblastik hFOB 1.19 hücreler ayrı Qafqaz profilleri ortaya koyuyor. SAO'lar-2 hücreleri hFOB 1.19 hücreleri daha verimli bir şekilde mineralize ve UV ışığı altında görünür olmayan ancak onlar-si olmak daha fazla Ca ve F oyuncu değişikliği hidroksiapatit (HA) açısından benzerdirler büyük maden yatakları üretmek.

Bu teknikleri kullanarak elde edilen sonuçları Qafqaz sürecinin hücre türüne bağlı olarak farklı olduğunu sonuçlandırmak sağlamak. Hücresel düzeyde, kökeni ve veziküller özelliklerini mineraller türünü kazanmakla, öneriyorum.

Giriş

Kemik bağ dokusu iki kısımdan oluşur bir türüdür: organik (hücreleri ve kollajen lifler) ve mineral (kalsiyum ve fosfat bileşikleri). Ana mineral kemikleri apatitler1bileşenleridir. Qafqaz yetkili hücreler kemik (dokusunu), diş (odontoblasts) ve kıkırdak (kondrosit) farklı türde hücre dışı matriks (ECM) proteinler üreten ve matris bırakmadan Qafqaz ilk adımları düzenleyen veziküller (MVs) (Şekil 1). MVs kalsiyum ve fosfat apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak biriken ve daha sonra bağlamak kollajen2,3' e 100-300 nm çapında veziküller vardır. Sonra hücre dışı ortama apatitler serbest bırakmak için MVs parçalanır. Apatitler kollajen lifleri ile temas halinde büyümeye ve kemik matris oluşturmak devam. Qafqaz Pben ve Ca2 + ekstraselüler ortamda sürekli tedarik tarafından sürekli. Kısa bir süre önce bazı veriler bizim model4,5desteği. Yumuşak dokular fizyolojik koşullar altında mineralize değil. Ancak, ektopik kalsifikasyon vasküler kalsifikasyon3gibi patolojik şartlar altında meydana gelebilir. Osteoblast fenotip elde damar hücreleri apatitler çekirdekleşme teşvik ve kan damarlarının duvar medial ve intimal katmanlarındaki Qafqaz başlatmak MVs üretebilir. Ektopik kalsifikasyon beri normal endochondral Qafqaz3Qafqaz kemik hücreleri moleküler mekanizmaları anlama, benzer ve kondrosit bazı ipuçları vardır yumuşak dokuların ektopik önkol kemiğinde kireçlenme. sağlamalıdır kurdu.

İskelet doku gelişimi çeşitli enzimler, büyüme faktörleri ve rehberleri veya Qafqaz inhibitörleri tarafından düzenlenir. Uzlaşmaz eylem doku ettiren alkalen fosfataz (TNAP) (Şekil 1) ve ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesteraz ben (NPP1), ankyrin (ANK), ile birlikte inorganik pirofosfat (PPben) konsantrasyonu kontrol eder 6. PPben, HA oluşumu, güçlü bir inhibitörü TNAP; hidrolize NPP1 nükleotit trifosfatlar arasında ANK PPben için ECM hücreden verir iken PPben oluşturmak üzere hidrolize. Pi/ÜFE oranı apatit oluşumu7,8 olası patolojik sonuçları9ile düzenleyen.

MV membran çekirdekleşme sürecinde (Şekil 1) kalsiyum ve fosfat MVs içinde yağış ilk kolaylaştırmak iyon taşıma proteinlerde zenginleştirilmiştir. Fosfat ışınlama 1 (çukur) MVs10,11perivesicular uzayda oluşturulan Pben dahil etmek için yardımcı olur. Annexins bağlama ve Ca2 + ulaşım ve Qafqaz MV lümen12,13' te başlattığı biyofiziksel süreç içinde tutulabilir. Biz daha önce apatit ECM14,15dakika sonra onun yayılma önce MV içinde iç çekirdekleşme intrasitoplazmik keseleri içinde Qafqaz için önerilen hipotez, iyilik. Vitro modelleme indüksiyon Ca2 +/Pben kompleksleri oluşumu PS ve AnxA516yapılan proteoliposomes doğruladı. Bu o birikimi gösteriyor olabilir sahip Ca2 +, Pben, lipid sallar, microvilli gibi membranesrepresent (NC) çekirdekleşme özünü apatit MVs. Annexins ve TNAP içinde AnxA5 ve PS kompleksleri ayrıca kollajen bağlayıcı kapasiteleri MVs kollajen lifleri boyunca koyarak ve ECM Qafqaz yayılmasını teşvik edici olarak yararlı olabilir. Fetuin A ve osteopontin (OPN)17, Qafqaz kolajen iskele üzerinde yayılmasını yavaşlatmak apatit oluşumu inhibitörleri olarak bilinir. Çekirdekleşme ve yayılma farklı olaylar, ikincisi, önceki eski vardır ve her ikisi de patolojik Qafqaz işlemi için uygun olmayabilir.

Kalsiyum fosfat kompleksleri Kimya fizyolojik Qafqaz ve ektopik kalsifikasyon nasıl değişebilir keşfetmek için hücreleri tarafından üretilen mineraller tanımlamak gereklidir. Apatitler kalsiyum ve fosfat genel kristal birim hücre formülü Ca10(PO4)6X2ile mineraller içeren bir grup, burada X = Cl, F, OH. 18aşağıdaki gibi sınıflandırılır: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 ve hidroksiapatit (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

Her hücre kültürünü Qafqaz ayrı bir profil sergileyen bu yana osteoblast hücre hatları seçimi mineral oluşumu ikna etmek için çok önemlidir. Bu raporda, Qafqaz iki insan hücre modelleri tarafından mineraller çekirdekleşme karşılaştırıldığında: osteoblastik hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 osteosarkom hücreleri. Osteosarkom kaynaklı hücreler osteoblastik modelleri olarak yaygın olarak kullanılır ve farklılaşmamış insan fetal hFOB hücreler yaygın olarak normal osteoblastik bir model olarak kullanılır iken SAO'lar-2 hücreleri en olgun osteoblastik karakter19 korunmuş farklılaşma20. Qafqaz profillerini farklı yöntemlerle analiz edildi: Alizarin Red-S (AR-S) boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntü, enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) Nefelometri ve iyon eşleme. TEM-EDX avantaj önceki çalışmalarda kullanılan alternatif teknikleri bu apatit kristallerinin4,5,21' iyon değiştirme nicel ve nitel sonuçlar veren şeydir. TEM-EDX kullanarak genel amacı görüntüleme ve miktar hücreler farklı türdeki çeşitli mineraller Ca, F ve Cl iyonu dağıtım Qafqaz sürecin farklı aşamalarında için basit bir yöntem bulmak oldu. Bu yöntem başarılı bir şekilde, örneğin, coexisting kimyasallar ile çinko nano tanecikleri ve Sucul organizmalar22kombine etkileri etkileşimi izlemek için kullanılmıştır. Başka bir çalışmada, bir bakır photocatalyst sulu çözüm titanyum malzemeleri hakkında kapsamlı İndüktif Eşleşmiş Plazma optik emisyon spektrometresi (ICP-OES), N2 physisorption (bahis), ile karakterize edildi XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman Spektroskopi, TEM-EDX ve fotoelektrokimyasal ölçümler23. Amacımız kökeni ve veziküller ve mineraller Qafqaz kemik farklılaşma sırasında kontrol mekanizmasını anlamak için iki hücre satırı özelliklerini karşılaştırmak için oldu.

figure-introduction-1
Resim 1 . Qafqaz kemik hücreleri içeren hücre dışı matriks (ECM) protein sentezi ve membran matris veziküller (MVs) sürümünden ilk adımların düzenini. MVs kalsiyum kalsiyum bağlayıcı proteinler, annexins ve inorganik fosfat ışınlama (çukur) eylem yoluyla hangi dephosphorylates doku non-spesifik alkalen fosfataz (TNAP), etkinlik tarafından takip fosfat eylem yoluyla birikir PPben böylece apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak Pben. O zaman, MVs parçalanır ve hücre dışı ortama apatitler bırakın. Qafqaz Pben ve Ca2 + hücre dışı orta4,5sabit tedarik tarafından sürekli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hücre kültür ve tedavi

  1. Laminar akış başlık altında tüm gerekli malzemeleri koymak ve onları UV ışık altında sterilize. Kültür Medya: 1:1 karışımı insan fetusu hFOB 1.19 SV40 büyük T antijen transfected için jambon F12 ve DMEM medya ile 2.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin, 0.3 mg/mL G418 ve % 10 ile Fetal sığır Serum (FBS) (v/v) desteklenen değil dokusunu ve 1.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve % 15 ile takviye ile McCoy'un 5A orta FBS (v/v) insan osteosarkom SAO'lar-2 hücreleri için.
  2. Kültür bir atmosferde % 5 CO2 34 ° C'de hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 hücreleri 37 ° c % 5'lik bir atmosferde CO2. Kuluçka makinesi laminar akış hood için hücre kültürleri, her iki hFOB 1.19 veya SAO'lar-2 hücreleri, transfer ve orta 10 mL taze kültür orta FBS ile değiştirin.
  3. Uyarıcılar (resting hücreleri) olmayan hücreler kuluçkaya veya onları 50 µg/mL askorbik asit (AA) 7.5 mM β-Ultrasaf Su daha önce hazırlanan ve 0,22 µm şırınga filtreler aracılığıyla filtre gliserofosfat (β-GP), ardından ile teşvik. Plastik microcentrifuge tüpler kültür ortamının yüzeyine gelen uyarıcılar ekleyin. Yavaşça kültür çanak karıştırın ve 7 gün boyunca kuluçkaya.

2. kalsiyum mineraller tespiti

  1. Hücre kültürleri fosfat tampon tuzlu su ile yıkamak (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).
  2. %2 (g:100 mL) 5 mL ekleyin AR-S PBS, pH 5,0 ve plakalar mineraller leke 30 dk için kuluçkaya.
  3. 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle PBS çanak duvara ekleyin, mineraller yok değil çalışın.
  4. Kalsiyum mineraller bir ters ışık mikroskobu altında gözlemlemek ve fotoğraf çekmek.

3. görsel olarak UV ışık altında probları

  1. Hücre lysates için hücre kültürleri, dinlenme ya da 7 gün için uyarılmış göre collagenase sindirim Protokolü24tedavi.
  2. Orta hücre kültürleri toplamak ve PBS hücrelerle yıkayın.
  3. 3 mL 500 U/mL collagenase 0.25 M sukroz, 0,12 M NaCl, 0.01 M KCl ve 0,02 M Tris-HCl tampon, pH 7,45, 37 ° c 3 h için bir çözümde hücrelerle sindirmek.
  4. Mekanik olarak hücreleri kazımak, onları plastik microcentrifuge tüpler için aktarmak ve 0,5 × 16 iğne ile 1 mL 40 U şırınga ile 10 kat geçirin.
  5. 500 × g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi.
  6. Süpernatant atın ve hücre Pelet sentetik kıkırdak lenf (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1.83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5.5 mM D-glikoz, 63 mM sukroz, 16.5 mM Hepes, pH 7,4) 500 µL içinde askıya alma.
  7. Hidroksiapatit (HA), fluorapatite (FA) ve chlorapatite (CA) tozlar UV transilluminator şişe bir spatula ile aktarmak ve denetimleri kullanın.
  8. Hücre lysates plastik ipuçları ile Plastik tüpler aktarmak ve dikkatle UV transilluminator yer.
  9. Görüntü altında görünür ve UV ışık al.

4. probları TEM-EDX için hazırlanması

  1. Mineraller negatif boyama için hazırlanması
    1. Sentetik üretilen HA, CA ve SK mineraller25 2,5 mg deiyonize su 500 µL içinde askıya alma ve % 5 CO2 1 h için bir ortamda 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. Formvar/karbon 300 Ni kafes ızgaralar kutusundan statik olmayan forseps ile almak, bir porselen çok iyi tabağa yerleştirin ve HA, CA ve SK süspansiyonlar 10 µL ızgaralar üzerinde bırak.
    3. Örnekleri, oda sıcaklığında 30 dk için kuru.
  2. İstirahat hazırlık ve teşvik hücreleri 26 katıştırma için
    1. Orta hücre kültürleri toplamak ve fizyolojik Desensitizasyon (PD) Orta (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7,4) hücrelerle yıkayın.
    2. 5 mL % 3 (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) oxazolidin 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.2, duman başlık altında oda sıcaklığında 1 h için karışımı ile hücreleri tamir.
    3. 5 mL 100 mM sodyum fosfat tampon de hücrelerle yıkama ve arabellek yıkandıktan sonra yavaşça çıkarın.
    4. Karanlık odada 2 mL % 1 (g:100 mL) osmiyum tetroxide 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.2, duman başlık altında oda sıcaklığında 20 dakika örnekleriyle postfix.
    5. Osmiyum tetroxide kaldırın ve kullanmak o.
    6. 5 mL 100 mM sodyum fosfat tampon de hücrelerle yıkayın.
    7. Sonra 5 mL aliquots oda sıcaklığında bir kademeli etanol çözüm serisinin örneklerinde kurutmak: % 25 (VOL) 5 min için % 50 oranında (VOL) 10 dakika için % 75 (VOL) 15 dakika, % 90 (VOL) 20 dk için. Son olarak mutlak etanol iki kez kullanmanız ve 30 dk ve 12 h için kuluçkaya.
    8. Mekanik olarak hücreleri plastik Petri kültür yemeklerini kazımak, plastik microcentrifuge tüpler içine toplamak ve 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
    9. Supernatants kaldırın ve LR beyaz reçine ve hacim oranı 1:2, mutlak etanol karışımından 1 mL hücrelerde askıya alma.
    10. Cam tüpler kullanımdan önce içeriği karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    11. 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
    12. Supernatants çıkarın ve 1 mL LR beyaz reçine ve mutlak etanol 1:1 karışımı kullanarak önceki adımı yineleyin.
    13. Mix iyi ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    14. 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
    15. Supernatants kaldırın.
    16. Son olarak, 1 mL saf LR beyaz reçine örnekleri için iki kez ekleyin ve Plastik tüpler içinde oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    17. Her örneğinin 500 µL jelatin kapsül yerleştirin.
      Not: Örnekleri reçine etiketleri yok etmez küçük bir yaprak kağıt ve bir kalem kullanılarak etiketlenir.
    18. Jelatin kapsül kapatın, plastik microcentrifuge tüpler içine koydum ve 130 x g 1dk swing-out Open End için de santrifüj kapasitesi.
    19. Kapsüller bir vakum pompası ile Plastik tüpler kaldırın.
    20. Örnekleri için fırın taşımak ve 48 h için 56 ° C'de polimerize.
    21. Bloklar onları yuvasına montaj ve onları Piramide süsleme hazırlayın.
    22. Sahibi ultramicrotome koymak, elmas Ultra 45 ° bıçak eklemek ve deiyonize su ile doldurun; arızi hava kabarcıkları gelen bıçak temiz unutmayın.
    23. Sonra deiyonize su banyosu üzerine elmas bıçak kullanma bölümlerine (700 Å) kesti.
    24. Ni ızgara sığır kirpik ve onları Formvar/karbon 300 parlak tarafında mesh yer kullanarak artıkları ayarla ve onları kurutun.
    25. 2.5 oranında (VOL) uranyl asetat içinde belgili tanımlık karanlık bir duman başlık altında mutlak etanol içinde hazırlamak. Uranyl asetat kurşun kabında tutun ve tortu açmamanı unutmayın.
    26. Karanlık odada, ızgaralar, sentetik apatitler ve hücre örnekleri ile 2.5 oranında (VOL) uranyl asetat etanol duman başlık altında oda sıcaklığında 20 dakika içinde counterstain.
    27. Kılavuzlar içinde % 50 etanol (vol. tarafından), sonra deiyonize suyla yıkayın ve 24 saat için oda sıcaklığında kuru. Son olarak, ızgaralar ve metin kutusuna koy.

5. TEM-EDX Analizi

  1. TEM görüntüleme bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile donatılmış tam kapsamlı enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis ile (EDX) sistem ve 11 megapiksel kamera
    1. Bir berilyum tutucu mineraller ve hücreleri gözlem için hazırlayın. Antistatik araçları kullanın.
    2. Vida çifti kaldırın ve Asansör berilyum plaka ve berilyum yıkayıcı hizmetkar kalan uzak.
    3. Kılavuz, parlak tarafı, tutucu üzerinde binin.
    4. Dikkatle berilyum yıkayıcı ve berilyum tabak yerleştirin ve sabitleme vidaları sıkıca vidalayın.
    5. Sahibi vakum odanın içine koymak ve vakum pompası üzerinde açın.
    6. Bir kez bir vakum elde, yavaşça sahibi görüntüleme odanın içine takın ve denge aletinin üstüne açın.
    7. Floresan monitörde mikroskop diyafram parametrelerini ayarlamak. Görüntü astigmat düzeltmesi gerçekleştirmek; Zum, odaklama ve çerçeve ayarla; ve 50, büyütme oranında TEM fotoğraf çekmek 000 X.
  2. KÖK görüntüleme ve x-ışını microanalysis spektral ve kompozisyon analizi için
    1. Enerji dağıtıcı x-ışını (EDX) dedektörü tarama transmisyon elektron mikroskobu (kök) görüntüleme odanın içine yerleştirin.
    2. Odak modu görüntü keskinliğini ayarlamak.
    3. KÖK görüntüler 15, büyütme oranında tutar 000 X.
    4. X-ışını microanalysis için örnek bir nokta seçin ve spectra toplamak.
    5. Örnek (% 100) olarak periyodik tabloda tüm öğeler için tüm atom ağırlıklarının özetliyor ve seçili öğeleri içeriğini belirten veri elde etmek: Ca, F, Cl ve P (olarak atomik %). Sonra her örnek için Ca, F veya Cl p oranları hesaplamak.
  3. İyon eşleme
    1. Kalsiyum, Flor, klor ve iyon eşleme yapmak ve EDX haritalar seçilen öğelerin örnekleri gerçekleştirmek için fosfor gibi öğeleri seçin.
    2. Verileri analiz öğeleri lokalizasyonu belirtmek suretiyle elde etmek: Ca, F, Cl ve P (olarak atomik %) ve Co lokalizasyonu (% olarak) Ca, F veya Cl P ile her örnek için hesaplar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

TEM-EDX matris veziküller (MVs) hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan ve Qafqaz sürecinin farklı şekilde devam edebilirsiniz bu tekniği kullanarak elde edilen sonuçları göstermek Mvs tarafından üretilen mineral vitro görüntüleme sağlar hücreleri çeşitli türleri. İki hücre satırları aynı osteoblastik transdifferentiation tedavi alınan henüz AR-S tarafından kanıtlanan uyarılan SAO'lar-2 hücreleri 1,19 dokusunu, hFOB çok daha etkili biçimde mineralize boyama (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Geçerli kağıt AR-S için boyama, UV ışık fluorapatite tanımlaması iletişim kurallarını açıkladığımız ve TEM-EDX vitro görüntüleme hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan MVs ve minerallerin MVs. tarafından üretilen Tüm yöntemleri ortak bazı sorun giderme adımlarını takip ederek yukarıda belirtilen adrese mümkündür. En iyi sonuçları elde etmek için birkaç önemli adımlar dikkatle yapılmalıdır. İlk olarak, (asidik olan) AA kültür ortamının pH 7.4 korumak için β-(alkali olan) GP tarafından takip eklemek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Teşekkürler

MK ve ASK manuel işlemler yapıldı ve LB çizimleri hazır ve film yaptı. ASK LB yazdı makale yazdı ve MK tablo hazırladı. SM, RB ve SP eleştirel tablo, komut dosyası ve el yazması okuyun. Yazarlar Hanna Chomontowska onun mükemmel hakkında yardım almak için ultramicrotomy yanı sıra Szymon Suski ve Henryk Bilski TEM-EDX analizi ile mükemmel onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar dr Patrick bahçeleri mesleki İngilizce dil düzeltme ve Barbara Sobiak talimatları kayıt için teşekkür etmek istiyorum.

Bu eser hibe N N401 140639 bilim ve Yükseköğretim Lehçe Bakanlığından ASK, LB ve 2016/23/N/NZ1/02449 MK, AB FP7 projesi BIOIMAGINE için Ulusal Bilim Merkezi, Polonya 2016/23/N/NZ4/03313 gelen hibe tarafından desteklenmiştir : BIO-görüntüleme araştırma yenilik ve eğitim, GA No 264173 ve Nencki Enstitüsü, Deneysel Biyoloji, yasal fon tarafından Polonya Bilimler Akademisi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif< / güçlü >
Jambon' s DMEM / F12 medya karışımıPAAE15-8131: 1, insan fetüsü için hFOB 1.19 SV40 büyük T antijeni transfekte osteoblastlar (ATCC CRL-11372)
McCoy ' İnsanPAAE82312-0025Saos-2 hücreleri (ATCC HTB-85)
Antibiyotik karışımı (penisilin / streptomisin)SigmaP0781-100ML100 U / mL
her biri G-418Sigma681680.3 mg / mL
FBSGibco10270hFOB 1.19 için% 10 ve Saos-2
AAiçin %15 SigmaA-5960 50& mikro; g/mL
ß-GPSigmaG9422-100GHA için 7.5 mM
Biyo-Jel HTP JelBio-Rad130-0420bizim
tarafımızdan sentezlenen
tarafımızdan sentezlenenCA
Sodyum fosfat tamponu Na2< / sub>HPO4< sub> / NaH2< sub>PO4< / sub> karışımıSigmaS7907/S82820.1 M, pH 7.2
PBSpH 7.0, tarafımızdan hazırlanmıştır
SigmaA5533-25G'deAR-S0.5 g/100 mL, pH 5.0
Kollajenaz tip IASigmaC2674500 U/mL
SCL tamponutarafımızdan üretilen
deiyonize su
EtanolPOChBA6480111mutlak% 99.8 ve çözeltiler% 25, 50, 75,90%
50 etanol içinde uranil asetatPolysciences Inc.21447-250.25 g/10 mL
PD ortapH 7.4, tarafımızdan hazırlanmıştır
Fiksasyon karışımı (paraformaldehit/glutaraldehit)Sigma158127/G-6257%3:%1
Sabitleme sonrası OsO4Sigma75633%1
LR Etanolde beyaz reçinePolysciences Inc.17411-MUNC 500g1: 2, 1: 1,% 100
AsetonCHEMPUR111024800saf
Alet< / güçlü >
Kriyojenik şişelerCorning Inc.4304871.2 mL
Plastik Petri kültürü kaplarıFalcon353003100 mm
Plastik tüplerFalcon352096 ve 35207015 ve 50 mL
Serolojik pipetlerFalcon ve VWR357521 ve 612-37001 ve 10 mL
Plastik mikrosantrifüj tüpleriSigmaZ688312 ve Z6280341.5 mL siyah ve 2 mL şeffaf
Plastik uçlarVWR613-0364, 613-0239 ve 613-10500.1-10 ve mikro; L doğal, 1-200 ve mikro; L sarı ve 200-1000 & mikro; L mavi
Plastikraflar Light LabsA-7055-Z, A-7053-Ctüpler için yeşil, mikro tüpler için turuncu ve TEM probları için mavi
Laminar Hera SaveThermo Scientific Co.KS12HEPA filtre (DIN EN 1822'ye göre H14)
İnkübatörler Hera CellThermo Scientific Co.15034& derece; hFOB 1.19 ve 37 derece için C; Saos-2 için C
Çeker ocakTEM boyamaları içinPOLONWCS-2
Cam şişelerSIMAX1632414501050 ve 163241450110050 ve 100 mL
Kuvars cam tüplerSIMAX638422010100Ø 10 mm, L 100 mm
PompaIBS Integra BiosciencesVakumlu
FırınMemmertUNE 40056 için VACUSAFE konfor° C
Porselen çok kuyulu plakaRosenthal technik229/1212 kuyulu
Cam kaplarSIMAX63241701002525 mL
Cam şişelerPocordDIN2210 mL
Plastik kutuAgar Scientific Ltd.karanlık için
Snap Fit Jelatin KapsüllerAgar Scientific Ltd.G3741boyut 1
Formvar / Karbon 300 Mesh Ni ızgaralar kutudaAgar Scientific Ltd.Parlak taraftaS162N3
Silikon hücre sıyırıcıSigmaSIAL0010-100EAboyut 1.8 / 25 cm
İğneli şırıngaBogMark007şırınga 1 mL 40 U, iğne 0.5 x 16
ŞırıngaChiranaCH005L5 mL
SantrifüjMPW Tıbbi AletlerMPW-350R130 x g ve 500 x g
UV translüminatörUVPGörünür ve UV ışığı için
UltramikrotomLKBNOVA700Å bölümler
Blok tutucuLKBE6711yuvarlak şekil
Elmas bıçakDiATOMEUltra 45°Boyut 3
Kirpik tutucusığır, tarafımızdan hazırlanmıştır
ForsepsROTH2855.1ızgaralar için antistatik
Spatula setiROTHE286.1tozlar için antistatik
Görüntüleme
Ters Çevrilmiş Işık MikroskobuPowerShot G1 ile donatılmış Canon AxioObserver Z9ile ZeissFaz kontrastı, İletilen ışık, 20 x objektif, RGB filtreler,
İletim Elektron MikroskobuTEM Jeol Co., Oxford Instruments ve SiS-OlympusJEM-1400 ile donatılmış, tam kapsamlı INCA Enerji Dağıtıcı X-ışını mikroanaliz (EDX) Sistemi ve 11 Megapiksel MORADA G2 kamerabüyütme, TEM için 50.000X ve STEM ve EDX için 15.000X
Kamera gövdesi ve lensleriNikonNikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		video kayıtları için
MikrofonMXL MikrofonlarSeskayıtları için
osteosarkomu için s 5A orta FA CA Bizim PBS filmM-20 Tempo

Kaynaklar

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Matriks Vezik lleriMineralizasyon AnalizihFOB 1 19 H creleriAlizarin K rm z s BoyamaUltraviyole I kyon HaritalamaApatit N kleasyonu
Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.