Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu video enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (TEM-EDX) iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için iletim elektron mikroskobu kullanımını sunar: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Askorbik asit (AA) ve β-gliserofosfat (β-GP) ile tedavi sonrası bu hücre satırları Qafqaz için nükleer silahların yayılmasına karşı gelen tam osteojenik transdifferentiation geçmesi ve apatit çekirdekleşme tetiklemek matris veziküller (MVs) üretmek hücre dışı matriks (ECM).
Alizarin Red-S (AR-S) boyama ve mineraller ultraviyole (UV) ışık kullanarak hücre lysates veya veziküller ardından EDX Nefelometri ve iyon eşleme TEM Imaging'i kullanma kompozisyon analizi dayalı, biz o osteosarkom sonucuna SAO'lar-2 ve osteoblastik hFOB 1.19 hücreler ayrı Qafqaz profilleri ortaya koyuyor. SAO'lar-2 hücreleri hFOB 1.19 hücreleri daha verimli bir şekilde mineralize ve UV ışığı altında görünür olmayan ancak onlar-si olmak daha fazla Ca ve F oyuncu değişikliği hidroksiapatit (HA) açısından benzerdirler büyük maden yatakları üretmek.
Bu teknikleri kullanarak elde edilen sonuçları Qafqaz sürecinin hücre türüne bağlı olarak farklı olduğunu sonuçlandırmak sağlamak. Hücresel düzeyde, kökeni ve veziküller özelliklerini mineraller türünü kazanmakla, öneriyorum.
Giriş
Kemik bağ dokusu iki kısımdan oluşur bir türüdür: organik (hücreleri ve kollajen lifler) ve mineral (kalsiyum ve fosfat bileşikleri). Ana mineral kemikleri apatitler1bileşenleridir. Qafqaz yetkili hücreler kemik (dokusunu), diş (odontoblasts) ve kıkırdak (kondrosit) farklı türde hücre dışı matriks (ECM) proteinler üreten ve matris bırakmadan Qafqaz ilk adımları düzenleyen veziküller (MVs) (Şekil 1). MVs kalsiyum ve fosfat apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak biriken ve daha sonra bağlamak kollajen2,3' e 100-300 nm çapında veziküller vardır. Sonra hücre dışı ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hücre kültür ve tedavi
- Laminar akış başlık altında tüm gerekli malzemeleri koymak ve onları UV ışık altında sterilize. Kültür Medya: 1:1 karışımı insan fetusu hFOB 1.19 SV40 büyük T antijen transfected için jambon F12 ve DMEM medya ile 2.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin, 0.3 mg/mL G418 ve % 10 ile Fetal sığır Serum (FBS) (v/v) desteklenen değil dokusunu ve 1.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve % 15 ile takviye ile McCoy'un 5A orta FBS (v/v) insan osteosarkom SAO'lar-2 hücreleri için.
- Kültür bir atmosferde % 5 CO2 34 ° C'de hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 hücreleri 37 ° c % 5'lik bir a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TEM-EDX matris veziküller (MVs) hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan ve Qafqaz sürecinin farklı şekilde devam edebilirsiniz bu tekniği kullanarak elde edilen sonuçları göstermek Mvs tarafından üretilen mineral vitro görüntüleme sağlar hücreleri çeşitli türleri. İki hücre satırları aynı osteoblastik transdifferentiation tedavi alınan henüz AR-S tarafından kanıtlanan uyarılan SAO'lar-2 hücreleri 1,19 dokusunu, hFOB çok daha etkili biçimde mineralize boyama (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Geçerli kağıt AR-S için boyama, UV ışık fluorapatite tanımlaması iletişim kurallarını açıkladığımız ve TEM-EDX vitro görüntüleme hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan MVs ve minerallerin MVs. tarafından üretilen Tüm yöntemleri ortak bazı sorun giderme adımlarını takip ederek yukarıda belirtilen adrese mümkündür. En iyi sonuçları elde etmek için birkaç önemli adımlar dikkatle yapılmalıdır. İlk olarak, (asidik olan) AA kültür ortamının pH 7.4 korumak için β-(alkali olan) GP tarafından takip eklemek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.
Teşekkürler
MK ve ASK manuel işlemler yapıldı ve LB çizimleri hazır ve film yaptı. ASK LB yazdı makale yazdı ve MK tablo hazırladı. SM, RB ve SP eleştirel tablo, komut dosyası ve el yazması okuyun. Yazarlar Hanna Chomontowska onun mükemmel hakkında yardım almak için ultramicrotomy yanı sıra Szymon Suski ve Henryk Bilski TEM-EDX analizi ile mükemmel onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar dr Patrick bahçeleri mesleki İngilizce dil düzeltme ve Barbara Sobiak talimatları kayıt için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser hibe N N401 140639 bilim ve Yükseköğretim Lehçe Bakanlığından ASK, LB ve 2016/23/N/NZ1/02449 MK, AB FP7 projesi BIOIMAGINE için....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif< / güçlü > | |||
| Jambon' s DMEM / F12 medya karışımı | PAA | E15-813 | 1: 1, insan fetüsü için hFOB 1.19 SV40 büyük T antijeni transfekte osteoblastlar (ATCC CRL-11372) |
| McCoy ' İnsan | PAA | E82312-0025 | Saos-2 hücreleri (ATCC HTB-85) |
| Antibiyotik karışımı (penisilin / streptomisin) | Sigma | P0781-100ML | 100 U / mL |
| her biri G-418 | Sigma | 68168 | 0.3 mg / mL |
| FBS | Gibco | 10270 | hFOB 1.19 için% 10 ve Saos-2 |
| AA | için %15 Sigma | A-5960 50 | & mikro; g/mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | HA için 7.5 mM |
| Biyo-Jel HTP Jel | Bio-Rad | 130-0420 | bizim |
| tarafımızdan sentezlenen | |||
| tarafımızdan sentezlenen | CA | ||
| Sodyum fosfat tamponu Na2< / sub>HPO4< sub> / NaH2< sub>PO4< / sub> karışımı | Sigma | S7907/S8282 | 0.1 M, pH 7.2 |
| PBS | pH 7.0, tarafımızdan hazırlanmıştır | ||
| Sigma | A5533-25G'de | AR-S | 0.5 g/100 mL, pH 5.0 |
| Kollajenaz tip IA | Sigma | C2674 | 500 U/mL |
| SCL tamponu | tarafımızdan üretilen | ||
| deiyonize su | |||
| Etanol | POCh | BA6480111 | mutlak% 99.8 ve çözeltiler% 25, 50, 75,90% |
| 50 etanol içinde uranil asetat | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0.25 g/10 mL |
| PD orta | pH 7.4, tarafımızdan hazırlanmıştır | ||
| Fiksasyon karışımı (paraformaldehit/glutaraldehit) | Sigma | 158127/G-6257 | %3:%1 |
| Sabitleme sonrası OsO4 | Sigma | 75633 | %1 |
| LR Etanolde beyaz reçine | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1: 2, 1: 1,% 100 |
| Aseton | CHEMPUR | 111024800 | saf |
| Alet< / güçlü > | |||
| Kriyojenik şişeler | Corning Inc. | 430487 | 1.2 mL |
| Plastik Petri kültürü kapları | Falcon | 353003 | 100 mm |
| Plastik tüpler | Falcon | 352096 ve 352070 | 15 ve 50 mL |
| Serolojik pipetler | Falcon ve VWR | 357521 ve 612-3700 | 1 ve 10 mL |
| Plastik mikrosantrifüj tüpleri | Sigma | Z688312 ve Z628034 | 1.5 mL siyah ve 2 mL şeffaf |
| Plastik uçlar | VWR | 613-0364, 613-0239 ve 613-1050 | 0.1-10 ve mikro; L doğal, 1-200 ve mikro; L sarı ve 200-1000 & mikro; L mavi |
| Plastik | raflar Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | tüpler için yeşil, mikro tüpler için turuncu ve TEM probları için mavi |
| Laminar Hera Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | HEPA filtre (DIN EN 1822'ye göre H14) |
| İnkübatörler Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34& derece; hFOB 1.19 ve 37 derece için C; Saos-2 için C |
| Çeker ocak | TEM boyamaları için | POLON | WCS-2 |
| Cam şişeler | SIMAX | 1632414501050 ve 1632414501100 | 50 ve 100 mL |
| Kuvars cam tüpler | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 mm |
| Pompa | IBS Integra Biosciences | Vakumlu | |
| Fırın | Memmert | UNE 400 | 56 için VACUSAFE konfor° C |
| Porselen çok kuyulu plaka | Rosenthal technik | 229/12 | 12 kuyulu |
| Cam kaplar | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
| Cam şişeler | Pocord | DIN22 | 10 mL |
| Plastik kutu | Agar Scientific Ltd. | karanlık için | |
| Snap Fit Jelatin Kapsüller | Agar Scientific Ltd. | G3741 | boyut 1 |
| Formvar / Karbon 300 Mesh Ni ızgaralar kutuda | Agar Scientific Ltd. | Parlak tarafta | S162N3 |
| Silikon hücre sıyırıcı | Sigma | SIAL0010-100EA | boyut 1.8 / 25 cm |
| İğneli şırınga | BogMark | 007 | şırınga 1 mL 40 U, iğne 0.5 x 16 |
| Şırınga | Chirana | CH005L | 5 mL |
| Santrifüj | MPW Tıbbi Aletler | MPW-350R | 130 x g ve 500 x g |
| UV translüminatör | UVP | Görünür ve UV ışığı için | |
| Ultramikrotom | LKB | NOVA | 700Å bölümler |
| Blok tutucu | LKB | E6711 | yuvarlak şekil |
| Elmas bıçak | DiATOME | Ultra 45° | Boyut 3 |
| Kirpik tutucu | sığır, tarafımızdan hazırlanmıştır | ||
| Forseps | ROTH | 2855.1 | ızgaralar için antistatik |
| Spatula seti | ROTH | E286.1 | tozlar için antistatik |
| Görüntüleme | |||
| Ters Çevrilmiş Işık Mikroskobu | PowerShot G1 ile donatılmış Canon AxioObserver Z9 | ile ZeissFaz kontrastı, İletilen ışık, 20 x objektif, RGB filtreler, | |
| İletim Elektron Mikroskobu | TEM Jeol Co., Oxford Instruments ve SiS-Olympus | JEM-1400 ile donatılmış, tam kapsamlı INCA Enerji Dağıtıcı X-ışını mikroanaliz (EDX) Sistemi ve 11 Megapiksel MORADA G2 kamera | büyütme, TEM için 50.000X ve STEM ve EDX için 15.000X |
| Kamera gövdesi ve lensleri | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D | video kayıtları için |
| Mikrofon | MXL Mikrofonlar | Ses | kayıtları için |
Kaynaklar
- Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
- Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
- Anderson, H. C. Matrix v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
