Fare ve insan elde edilen birincil Gastrik epitel Monolayer kültür yenilenme çalışmaları için

Özet

Burada biz kurmak ve 3 boyutlu (3D) Gastrik organoids insan ve fare türetilen ve yöntemi 3D organoids aktarmak için bir 2-boyutlu monolayer kültür bir protokol tanımlamak. Yenilenme çalışmaları bir roman çizik-yara tahlil olarak Gastrik epitel monolayer kullanımı da açıklanmıştır.

Özet

Vitro çalışmalar, mide yarası onarma genelde mide kanseri hücre hatlarında bir çizik-yara tahlil hücresel proliferasyonu ve göç kullanımını içerir. Bir kritik böyle deneyleri, ancak, onların homojen karışım-in hücresel türleri kısıtlamasıdır. Onarım birkaç hücre tipleri arasındaki etkileşimin talepleri karmaşık bir süreçtir. Bu nedenle, bir kültür hücresel alt türlerinden yoksun çalışmaya Eğer biz onarım süreci anlamak için aşılması gereken bir sorundur. Mide organoid modeli mademki türdeş olmayan hücre türleri topluluğu benzer biçimde, Gastrik epitel veya diğer yerel doku içinde vivoyansıtan bu sorunu hafifletmek. İşte bir roman, insan türetilmiş vitro çizik-yara tahlil gösterdi veya sonra bir Gastrik epitel monolayer sağlam ya organoids ya da bir tek hücre süspansiyon olarak transfer edilebilir fare 3 boyutlu organoids ayrışmış organoids. Gastrik yenilenme eğitim için bir roman çizik-yara tahlil sisteminde kullanılan organoid kaynaklı Gastrik epitel monolayers kurmak için protokol hedefidir.

Giriş

Çizik-yara deneyleri kullanımı onarım ve rejenerasyon^1,2,3,4,5,6eğitim için popüler bir yöntemdir. Önerilen metodoloji özellikle mide yenilenme ve Helicobacter pylori kolonizasyon eğitim için kullanılabilir. Geçmişte, mide kanseri hücre hatları Helicobacter pylori (H. pylori) enfeksiyon^1,2 çalışma için bir araç olarak kullanılmış olan ve ana kadar son zamanlarda mide kanseri hücre hatları AGS hücreleri gibi tercih^{1 vardı. ,2,3,4}. Bir mide kanseri hücre kültürleri Gastrik epitel hücre çeşitliliği özetlemek için onların başarısızlığı kısıtlamasıdır. Bu sınırlama, adres deneyin için işte kuruluş ve birincil insan ve fare-kaynaklı 3 boyutlu fundic mide organoids (FGOs) transferi için değiştirilmiş bir yöntemiyle ilk alan yara iyileşme deneyleri için Gastrik epitel monolayer gösterdi Schlaermann ve arktarafından açıklanan. ⁷ biz Gastrik epitel monolayers türetilen güdülmesini 3D Gastrik FGOs veya tek hücre FGO elde tutmak yakından bu Gastrik epitel temsil eden bir polarize hücresel kompozisyon göstermek içinde vivo. Mide kanseri hücre hatları bu teknik görüntüler hücre kompozisyon göstermek değil ki, geçerli protokol alternatif çizik-yara tahlil yöntemleri üzerinde bir avantaj sahiptir. Monolayers bütün organoids veya tek hücre süspansiyon Disosiye organoids üzerinden kurulan ve kaplama bir membran matrisi kullanarak veya kollajen-kaplama olabilir mademki bu metodoloji optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı genel amacı bir organoid Gastrik epitel monolayer kültürler bir roman yara iyileşme tahlil için türetilmiş kurmaktır.

Protokol

Kirlenmesini önlemek için iletişim kuralı bütünüyle bir steril doku kültürü başlık içinde gerçekleştirin. İnsan fundic doku kol gastrektomi onaylı Cincinnati Üniversitesi IRB protokolüne göre geçiren hastaların toplanan (IRB protokol numarası: 2015-4869).
Tüm fare çalışmaları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) bir Amerikan Derneği değerlendirme ve Akreditasyon, laboratuvar hayvan bakım (AAALAC) tesis tutar tarafından kabul edildi.

1. insan kaynaklı 3D mide Fundic Organoids kurulması

Not: Bu protokol araştırma daha önce yayınlanan bu laboratuvar⁸' üzerine kuruludur.

1. % 50 Wnt klimalı ve %20 R-spondin şartına medya oluşan 3D organoid ortam hazırlamak.
   1. Wnt klimalı ortam hazırlamak, Wnt büyüme orta L hücrelerde kültür (Dulbecco kartal orta (DMEM), % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1'değişiklik ' ın penisilin/streptomisin) 7 gün boyunca orta hasat ve 0,22 µm filtre kullanarak filtre uygulama.
   2. R-spondin klimalı ortam hazırlamak. Değiştirilmiş HEK-293T R-spondin secreting hücre R-spondin büyüme orta hattı büyümek (Dulbecco kartal orta (DMEM), % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1'değişiklik ' ın penisilin/streptomisin). 2 h sonra eki orta bu hücrelerden OPTIMEM büyüme için orta, % 1 değiştirin penisilin/streptomisin. Hücreleri 7 gün boyunca kültür. O zaman R-spondin klimalı ortam hasat ve 0,22 µm filtre kullanarak filtre uygulama.
      Not: Bu protokol daha önce yayımlanmış ve daha ayrıntılı bir iletişim kuralı için ^6,7,8' e bakın.
2. Büyüme faktörü azaltılmış, fenol red ücretsiz membran matris için 16 h 4 ° C'de buz çözme Buz gibi Ca^{2 +}/Mg^{2 +}dokusunda toplamak-DBPS büyük bir plastik kap içinde ücretsiz. Buz üzerinde başlangıç adım 1.4 kadar saklayın.
   Not: Doku kol gastrektomi geçiren hastaların toplanır.
3. Forseps kullanarak, 100 mL Ca^{2 +}/Mg^{2 +}içeren steril bir ölçek şiddetle doku yıkama-Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) ücretsiz. Yıkama için yaklaşık 30 s veya enkaz ve kan kaldırıldı kadar. Daha sonra steril gazlı bez kullanarak, uzak epitel müköz katmandan silin.
4. Büyük forseps kullanarak, sıkıca kas katmanı doku ve gücü ile kavramak, uzakta büyük eğri Kan durdurucu sargı forseps kullanarak epitel kazımak. Steril, polistren petri kabına alıntı epitel parçaları toplamak.
5. Epitel doku doku sindirim optimize etmek için jilet kullanarak yaklaşık 2.0 x 2.0 mm² boyutlu parçaları kıyma. Doku parçaları ile Ca^{2 +}/Mg^{2 +} yıkama-antibiyotik ile desteklenmiş DBPS ücretsiz (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} -DPBS, %1 penisilin/streptomisin, 0.25 mg/mL Amfoterisin B ücretsiz 10 mg/mL gentamisin, 50 mg/mL sefaloridin), kadar yıkama kan ücretsizdir. Birden fazla yıkamak gerekiyorsa gerçekleştirin. Yıkama yıkama steril bir gazlı bez ile atık kabı dikkatle süzerek atmak.
6. Toplamak bir 125 mL cam alt şişe ile 25 mm heyecan bar ve Önceden ısıtılmış kuluçka medya yuvarlak içine parçaları yıkanmış (2 mM L-glutamin, % 1 ile desteklenmiş Bazal medya penisilin/streptomisin, 10 mM HEPES tampon, 1 mg/mL Collagenase Type 1, 2 mg/mL hücre kültürü «««sınıf) sığır Serum albümin. Yuvarlak alt balon lastik septa ile kapatın.
7. 20 G spinal iğne septa yerleştirin ve bir oksijen tankı kauçuk hosing ile bağlayın. Herhangi bir kirletici maddeleri filtre uygulamak için filtre oluşturmak için tüp içine doku kağıt yerleştirin. Düşük oksijen çıkım açın. 10-15 çıkış iğneler septa rüptürü önlemek için septa yerleştirin.
8. Set kelepçeler kullanılarak bir yüzük standına güvenli ve 37 ° C 30-45 dk için bir heyecan plaka için kalibre bir su banyosu yerleştirebilirsiniz. Sonra doku 15dk için kuluçka kuluçka medya ve görsel olarak Disosiye bezleri için onay 50 µL kaldırın. Bezleri yoğun değildir ya da dokudan ayrılmış değil, bir ek 5-10dk için bırakın.
9. Hemen kuluçka, ekleyin 50 mL Önceden ısıtılmış DMEM/F12 kuluçka ortamına steril serolojik pipet kullanarak veya doğrudan kuluçka karışım içine dökme tarafından.
10. Bezi karışımı steril bir gazlı bez ile dört 50 mL konik tüpler içine filtre. Filtrate buz ayıklanan bezleri konik tüp altına yerleşmek izin vermek 15 dakika tutun. Değil kapatılan bezleri rahatsız kaldırmak ve üstlerden süpernatant serolojik pipet kullanarak 40 mL atmak dikkatli olun. Kalan 10 mL antibiyotiklerle takıma DPBS 10 ml resuspend.
11. Karışım 5 mL hücre kültür testi tüpler içine eşit dağıt. 65 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın. Bezi Pelet çözdürülen membran matris bir pipet ya da 200 µL geniş pipet ucu kullanarak resuspend. Mix kadar homojen.
    Not: Buz üzerinde bu adımı gerçekleştirmek için ve karıştırma sırasında polimerizasyon membran matris önlemek için önemlidir. Ayrıca, bezi yoğunluğu 50 µL için örnekleme tarafından kontrol edin önemlidir. ~ %70 confluency en uygun yoğunluğudur.
12. Daha sonra geniş uçlu pipet kullanarak membran matrisinin 50 µL bezlerinde plaka. Kaplama sırasında herhangi bir kabarcıklar üreten kaçının.
13. Membran matris polimerize, 10-15 dk 37 ° C'de için kuluçkaya izin vermek için Bir 12-şey kültür tabağına kaplama, 1 mL hFGO medya ekleyerek (Gelişmiş Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta/F12 orta takıma 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin, 0.25 mg/mL Amfoterisin B ile 10 mg/mL gentamisin, 50 mg/mL sefaloridin, 10 mM HEPES Tampon, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, % 50 Wnt şartına orta, % 20'r-spondin-şartına orta 100 ng/mL ile desteklenmiş kemik morfogenetik protein inhibitörü, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal büyüme faktörü, 200 ng/mL Fibroblast büyüme faktörü 10, 10 mM Nikotinamid ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü) iyi başına. Yoksa bir 12-şey kültür plaka kullanarak eklemek yeterli medya membran matris kabarcık daldırın.
14. Bir % 5 CO₂ oksijen hücre kültür kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür. Medya her 4-5 gün değiştirin.

2. fare kaynaklı 3D mide Fundic Organoids kurulması

Not: Bu protokol önceden yayınlanmış ⁶oldu. Membran matris buz çözme ve tüm reaktifler başlamadan hazır olun.

1. Araştırma kuruluşu tarafından onaylanmış bir araştırma gerçekleştirildiği yöntemiyle fareler kurban. Mide fare kaldırmak ve göre daha önce yayımlanmış protokolleri ⁶incelemek. 20 mL buz soğuk Ca^{2 +}/Mg^{2 +}yıkama-DBPS ücretsiz.
   Not: C57BL/6 fare, 8-10 hafta, yaşlı fundic mide organoid kültürler için kullanılır. Fareler karbondioksit mide kaldırma önce el ile servikal çıkığı ardından Solunduğunda euthanized.
2. Mide kas katmandan şerit ve görünür herhangi bir kan damarları daha önce ⁶yayınlandı.
3. Fundus test ve steril bir jilet kullanarak forestomach ayrı. Kesme fundus parçalara yaklaşık 2.0 x 2.0 mm. kullanma forseps, küçük Cerrahi makas kullanarak bir 15 mL konik tüp EDTA kuluçka arabellek içeren parçaları toplamak (Ca^{2 +}/Mg^{2 +}-DPBS, 5 mM EDTA ücretsiz) ve 4 ° c 2 h ile için kuluçkaya nazik ajitasyon.
4. Steril bir Hood, konik tüp bırakın ve yaklaşık 5 dakika süreyle buz parçaları bir pipet parçaları el değmemiş bırakarak mümkün olduğu kadar kuluçka arabellek kaldırmak için kullanın. 5 mL arabellek sallayarak ekleyin (D-Sorbitol, 1,47 g Sükroz 100 ml Ca^{2 +}/Mg^{2 +}1 g-DPBS ücretsiz) ve 2 dk. izin yönelik büyük parçaları yerleşmek ve 1000 p pipet kullanarak acele ile yerleşmek için henüz küçük parçaları kaldırmak el ile bir güçle sallamak en üst katmanda.
5. 65 x g de 4 ° C'de 5 min için kaldırılan parçaları spin.
6. Hava kabarcıkları kaçınırken süpernatant kaldırmak, membran matrisinde resuspend ve homojen gelene kadar karıştırın.
7. Membran matris şey başına 50 µL at plaka ve sonra 20 dakika 37 ° C'de kuluçkaya için geniş uç pipet kullanın.
8. Yeterli mFGO büyüme ortamı ekleyin (Gelişmiş Dulbecco'nın modifiye kartal orta/F12 orta takıma 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin, 10 mM ile HEPES tampon, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, % 50 orta, Wnt şartına % 20 R-spondin-klimalı 100 ng/mL kemik morfogenetik protein inhibitörü, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal büyüme faktörü, 10 ng/mL Fibroblast büyüme faktörü 10 ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü ile desteklenmiş orta) kabarcık daldırın için.
9. 37 ° c, % 5 CO₂ oksijen hücre kültür kuluçka hücreler kültür. Medya her 4-5 gün değiştirin.

3. kollajen kaplama 2D Transfer için

Not: aksi belirtilmedikçe steril doku kültürü mahallede tüm yordamları gerçekleştirin. 3D organoids için monolayer aktarmadan önce 24 h kaplama kollajen başlar. Sıçan kuyruğu kollajen buz üzerinde tutun ve ışıktan korumalı. Kolajen kaplı levha 2 hafta kadar iyidir. Kaplamalı plakalar hemen kullanmıyorsanız, parafilm ve store gerekinceye kadar 4 ° C'de plaka sarın.

1. Sıçan kuyruğu kollajen 50 µg/ML 20 mM Asetik asit kullanarak sulandırmak.
2. Yeterince seyreltilmiş kollajen ile pınarı yüzeyini kapsar. Standart bir 12-şey plaka bir kuyuda kollajen yaklaşık 1 mL ile kat. Gece, oda sıcaklığında bir steril başlıklı bırakın.
3. İki kez ile 1 mL Ca^{2 +}/Mg^{2 +}yıkama-DPBS iyi ücretsiz ve steril başlıklı oda sıcaklığında 2 h için açığa bırakın.

4. membran matris kaplama 2D Transfer için

Not: aksi belirtilmedikçe steril doku kültürü mahallede tüm yordamları gerçekleştirin. 3D organoids için monolayer aktarmadan önce 2 h kaplama membran matris başlar. Membran matris buz üzerinde tutun. Kaplamalı plakalar hemen kullanılacak olan ve uzun süre saklanamaz.

1. 1:10, 15 mL konik tüp bir hücre kültür sınıf su ile membran matrisinde seyreltik oranı. Buzda sulandırmak.
2. Bir pipet kullanarak standart bir 12-şey plaka her şey için 100 µL seyreltilmiş membran matris ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hatta bir kat için kuyu boyunca seyreltilmiş membran matris eşit dağıt.
3. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
4. Bir pipet kullanarak kalan su kaldırmak ve 3D organoids aktarmadan önce oda sıcaklığında 1 h için kuru.

5. 2D Gastrik epitel hücre Monolayers 3D m/hFGOs ve aktarımı

1. 3D fare veya insan-FGOs 6-7 gün boyunca kültürlü kaynaklı sonra 3D organoids aktarımı için 2D monolayer başlar.
   Not: gerekli bir monolayer her şey için 300 olduğu gibi organoids veya tek hücre 300 organoids türetilmiş kullanmak için önerilir. Sağlam bir kültürde bu 150 organoid/iyi bir 12 iyi kültür tabak içinde yaklaşık almak için bekleniyor.
2. Tabak aktarmadan önce kaplanır emin olun.
   Not: Membran kaplı matris plakaları bir yarı saydam jel katman var, ancak, kolajen kaplı levha kaplama açık belirtisi yoktur.
3. Doğrudan 1 mL steril Ca^{2 +}/Mg^{2 +}pipetting tarafından 3D membran matris kabarcık plaka çıkarmak-DBPS ücretsiz kabarcık Merkezi.
4. Bir pipet kullanarak, membran matris ve organoid karışımı hücre kültür testi tüpler içine toplamak. 2 membran matris baloncuklar tüp başına oranında toplamak. 40 g ve 4 ° c x 5 dk santrifüj
5. Vakum sistemiyle süpernatant kaldırmak ve mümkün olduğunca fazla membran matris. Ca^{2 +}/Mg^{2 +}4 mL resuspend-DBPS ücretsiz, süpernatant kaldırmak ve 2 - 3 kez tekrarlayın. Bütün organoid Aktarım Protokolü için 5.10 adıma geçin. Adım 5,7 tek hücre süspansiyon protokolü için devam ediyor.
6. Hücre dekolmanı çözümü 37 ° c önceden sıcak ve her test tüpü 1 mL ekleyin. Tüpler ters çevirme ya da yukarı ve aşağı bir pipet ile pipetting karışımı yavaşça. 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
7. Ca^{2 +}/Mg^{2 +}2 mL ekleyin-DBPS doğrudan her tüp için ücretsiz.
8. 26 G iğne kullanın ve karışım 2 - 3 kez şırınga. Görsel için tek hücreleri denetleyin. Hala varsa organoids veya hücre kümeleri 1-2 kez daha şırınga.
9. 4 ° C'de 5 min için 40 x g, santrifüj Pelet 2D FGO medyada resuspend (2D fare FGO büyüme orta: gelişmiş Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta/F12 orta Fetal buzağı Serum, 10 mM 2 mM L-glutamin, 10 mM penisilin/streptomisin, % 10 takıma HEPES tampon, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal büyüme faktörü, 1 µM TGF-β inhibitörü ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü ile desteklenmiştir. 2D insan FGO büyüme orta: Gelişmiş Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta/F12 orta 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin, 10 mM ile % 10 HEPES tampon, takıma Fetal buzağı Serum, 10 mM Nikotinamid, 1 x N2, 1 x B27, sefaloridin, 50 ng/mL Epidermal büyüme 50 mg/mL ile desteklenmiş 1 µM TGF-β önleyici) faktör ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü.
10. Levha kaplamalı plakalar üzerinde resuspension. Tabak 37 ° C'de kuluçkaya Medya sarı dönüşürse ortamı her 4 gün veya daha önce değiştirin. Monolayer yaklaşık 4 gün form olarak gerektirir.

6. yara tahlil 2D Gastrik epitel hücre Monolayers kullanarak sıfırdan

1. Kültür % 100 confluency ulaşmıştır jilet kullanarak, monolayer kaşı.
2. 15 dakika oda sıcaklığında % 3.7 formaldehit kullanarak monolayers saptamak. %0,5 non-iyonik deterjan/PBS için oda sıcaklığında 20 dk ile permeabilize.
3. Sonraki monolayers oda sıcaklığında 1 h için % 2 eşek serum ile blok ve 1: 1000 seyreltme h⁺, K⁺ile kuluçkaya-ATPaz birincil antikor gecede 4 ° C'de yıkama %0,1 non-iyonik deterjan/PBS ile ve eşek 1: 100 seyreltme ile kuluçkaya Anti-fare 488 ikincil antikor ve 10μg/mL Höchst hücre çekirdeği, oda sıcaklığında 1 h için leke.
4. 2D insan kaynaklı mide monolayer kültürlerde yüzey müköz çukur hücreleri tanımlamak için 20 μg /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC eşleniği olan hücreleri leke. Confocal mikroskop üzerinde görüntü monolayers.
5. Her kaç h. çizik monolayer kalitesine bağlı olarak 24-48 h ve hastalar arasında varyasyon arasında yeniden epithelialize yara görüntülerini almak.

Sonuçlar

Organoids ya corpus/vücut insan ya da fundus fare mide dokuların (şekil 1A) elde edilmiştir. Ya collagenase ya da EDTA sindirim mide dokusunun insan veya fare türetilmiş sonra sırasıyla, bezleri membran matris gömülü ve 6-7 gün (şekil 1A) kültürlü. Şekil 1B sonra Gastrik epitel monolayer (huGEM) için membran matris kaplı odası slaytlarda transfer edilmiş insan kaynaklı mide organoids (huFGOs) oluşumu...

Tartışma

Geçerli protokol çizik-yara deneyleri için kullanılan insan ve fare türetilmiş Gastrik epitel monolayers kurulması ayrıntıları. Değiştirilmiş bir protokol ilk Schlaermann ve ark⁷tarafından yayınlanan ve protokol ikamet kök hücre izolasyon birincil insan (veya fare) doku kavramı üzerinde bağlıdır. Özellikle, biz burada protokolü bir birleşmesi kurmak için optimize edilmiş ve hangi ifade eder ve ana hücre içinde Gastrik epitel vivo içindebulunan soy Gastrik epitel monolayer polariz...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gelişmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle / F12 ortamı (bazal ortam)	Yaşam Teknolojileri	12634-010
GlutaMAX (L-glutamin)	Yaşam Teknolojileri	25030-081
Penisilin / Streptomisin	Termo Bilimsel	SV30010
Amfoterisin B / Gentamisin	Termo Bilimsel	R01510
Kanamisin	Termo Fisher	RO1510
HEPES Tampon	Sigma Aldrich	H0887
n-Asetilsistin	Sigma Aldrich	A9165
N2	Yaşam Teknolojileri	17502-048
B27	Yaşam Teknolojileri	12587-010
BMP İnhibitörü (Noggin)	Pepro Tech	250-38
Gastrin	Tocris	3006
EGF	Pepro Tech	315-09
FGF10	Pepro Tech	100-26
Nikotinamid	Sigma Aldrich	N0636
Y-27632 ROCK İnhibitörü	Sigma Aldrich	Y0503
TGF-β İnhibitör	Tocris	2939
Ca < sup> 2 + < / sup> / Mg < sup> 2 + < / sup> -ücretsiz DPBS	Fisher	21-031CV
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle Medium (DMEM)	Yaşam Teknolojileri	12634-010
Fetal Sığır Serumu	FBS
OPTIMEM	Invitrogen
0.22 & mikro; M filtre	Fisher	099-720-004
37 & derece C Su Banyosu
Kollajenaz Tip 1	Worthington
Sığır Serumu Albümini	Sigma Aldrich	A9418
Kimwipes (kağıt mendil)	Fischer Scientific	06-666C
125 mL yuvarlak tabanlı şişe
1 inç (25 mm) karıştırma çubuğu
Kauçuk Septa
Steril Gazlı Bez
Karıştırma Plakası
Halka Standı
Halka Stand Kelepçeleri
Steril petri kabı
18 G 1,5 uzunluğunda iğneler	Thermo Fisher	305196
3,5 inç uzunluğunda 20 G omurga iğneleri	Thermo Fisher	405182
12 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş plaka	Midwest Scientific	92012
Büyüme Faktörü Azaltılmış, Fenol Kırmızısı İçermeyen MatrigelTM (Bodrum membran matrisi)	Fisher	CB-40230C
Steril Tıraş Bıçakları
			Geniş uçlu cımbız
Kavisli Hemostatik Forseps
200 ve mikro; L geniş pipet uçları	Thermo Fisher	02-707-134
5 mL hücre kültürü test tüpleri	Fisher	14-956-3C
Kauçuk hortumlu
1 g D-Sorbitol
Sükroz	Fisher	SS-500
Diseksiyon mikroskobu
Diseksiyon Tepsisi
Sallanan Masa
Sıçan Kuyruğu Kollajen Tip 1	Yaşam Teknolojileri	A10483-01
Hücre kültürü sınıfı buzlu asetik asit	Fisher	A38-212
Hücre kültürü sınıfı su	Corning	25-055-CV
2 kuyulu odacıklı slayt	Thermo Fisher	155380
12 kuyulu Transwell (polyester membran ekleri)	Corning	3460
Hücre sıyırıcı	Corning	353086
Accutase (hücre ayırma solüsyonu)	Kök Hücre Teknolojileri	7920
263/8 G şırınga	Thermo Fisher	309625
Jiletli
L Hücreleri	Wnt3a üreten bir hücre hattı olan L hücreleri, Dr. Hans Clevers (Hubrecht Gelişim Biyolojisi ve Kök Hücre Araştırmaları Enstitüsü, Hollanda) tarafından hediye olarak alındı.	N/A
HEK-293T Rspondin salgılayan hücreler	Dr. Jeff Whitsett'ten (Neonatoloji, Perinatal ve Pulmoner Biyoloji Bölümü, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi ve Cincinnati Üniversitesi Tıp Fakültesi, Cincinnati, ABD) modifiye edilmiş bir HEK-293T R-spondin salgılayan hücre hattı elde edildi.	N/A
HK-ATPase Birincil Antikor	İnvitrojen	SC-374094
E-Cadherinn	SantaCruz	sc-59778
UEA1	Sigma Aldrich	L9006
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570
Alexafluor 488 ikincil antikor (Eşek anti-fare 488 ikincil antikor)	ThermoFisher Scientific	R37114

LS004214Oksijen Tankı