Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj^1,izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek^2,3,4,5,6. Çoğu durumda, ölüm de dahil olmak üzere böbrek, akciğer, kalp, uç-organ yetmezliği veya karaciğer olaylar yanı sıra inme^5,6çeşit tarafından oluşur. Bu hasta popülasyonda yüksek ölüm oranı nedenini asla kurmuştur.

Zatürre de topluluk-elde olarak sınıflandırılır veya hastane edinilen (nozokomiyal) ve zatürre neden olabilir ajanlar bakteri, virüs, mantar ve kimyasallar içerir. Bakteri Pseudomonas aeruginosanozokomiyal pnömoni önemli nedenlerinden biridir. P. aeruginosa doğrudan hedef hücreleri^7,8sitoplazma için ekzoenzimlerden olarak adlandırdığı çeşitli efektör moleküllerin aktarmak için bir tür III salgı sistemi kullanır Ayagin Gram-negatif bir organizmadır. Pulmoner endotel hücreleri enfeksiyon sırasında ekzoenzimlerden endotel bir formu Mikrotubul ilişkili protein tau^{9,10,11,12 de dahil olmak üzere çeşitli hücre içi proteinlerin hedef.} , ağır pulmoner ödemi kaynaklanan endotel bariyer arıza lider, pulmoner fonksiyon ve oftentimes, ölüm düşmüştür.

Daha önce belirtildiği gibi ilk pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj takip ilk 12 ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Bu fenomeni açıklamak için bir potansiyel uzun ömürlü toksin bazı tip zavallı uzun vadeli sonuca yol açar ilk enfeksiyon sırasında oluşturulan bir mekanizmadır. İki gözlem bu olasılığı destekler. Bakterilerin antibiyotik¹³tarafından öldürdükten sonra bir hafta için çoğalırlar başlangıçta P. aeruginosa ile kabul edilen ilk, kültürlü pulmoner endotel hücreleri başarısız. İkincisi, uzun ömürlü prionlar ve aracıları prion özelliklere sahip çeşitli insan ve hayvan hastalıklarında, özellikle sinir sistemi^14,15ile ilişkili hastalıklar gösterdi.

Uzun ömürlü sitotoksik ajanlar potansiyel üretim akciğer enfeksiyonu sırasında İnceleme yöntemleri hiç tarif edilmistir. Burada özetlenen basit vitro deneyleri bir dizi kullanılabilir Sitotoksin üretim ve enfeksiyon bir ortak zatürre neden Ajan, P. aeruginosakullanarak aşağıdaki etkinlik araştırma için. Bu deneyleri enfeksiyon zatürre neden diğer aracıları kullanarak aşağıdaki olası Sitotoksin indüksiyon araştırmak için kolayca adapte olmalı ve üretilen supernatants-meli da var olmak tamamen Sitotoksin etkilerini araştıran için yararlı organ ya da hayvan. Son olarak, büyük olasılıkla burada özetlenen deneyleri hayvan ve insan biyolojik sıvıları Sitotoksin üretimi sırasında zatürree için test etmek için adapte olacaktır.

Tüm hayvan yordamları incelendi ve kurumsal ve hayvan bakımı Komitesi South Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmış ve tüm federal, eyalet ve yerel düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Sıçan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVECs) birincil kültürleri akciğer biyoloji için University of South Alabama'nın merkezi hücre kültür çekirdek tesisinden elde edilmiştir. Hücre yukarıda açıklanan yordamları¹⁶kullanılarak hazırlanmıştır.

1. nesil sitotoksik Supernatants

Not: Burada, P. aeruginosaiki farklı soyu kullanırız: ekzoenzimlerden ExoU ve ExoT enfeksiyon ve ∆PcrV, bir tür III salgı sistemi yoksun ve sırasında hedef hücrelere aktarma yetenekli bir bozulmamış türü III salgı sistemi olan PA103 ekzoenzimlerden aşı takip hedef hücrelere aktarma aciz.

1. Bakteri Vogel-Bonner (VB) ağar kaplamalar¹⁷ üzerine çizgi ve 37 ° C'de gecede büyümek
   1. Tabak hazırlamak için aşağıdaki hisse senedi çözüm (Vogel-Bonner tuzları; 10 x hisse senedi) olun: ölçmek 2 g MgSO₄, 20 g sitrik asit (ücretsiz), 100 g K₂PO₄ve 35 g NaH₂PO₄. GKD₂O 1 L ve basınçlı kap 15dk yavaş egzoz ile için ekleyin.
   2. 450 mL GKD₂O 7.5 g agar ve yukarıdaki gibi basınçlı kap koyun.
   3. Isıyla her iki çözüm de soğutmak için 50 ° C su banyosu yerleştirin.
   4. 10 x VB hisse senedi tuz solüsyonu 50 mL agar için ekleyin.
   5. Carbenicillin 400 µg/ml (için kullanılan P. aeruginosa suşlarının) ve de şişeye dönen tarafından karıştırın.
   6. Bireysel steril kültür yemekleri, VB agar çözümde yer 5 mL agar kuvvetlendirmek ve 4 ° C'de bakteriyel tohum güne kadar saklamak izin verir.
   7. Bakteriyel tohum gün, önceden bir tabak 37 ° c sıcak ve bakteri steril bir döngü kullanarak plaka üzerine çizgi. Yer 37 ° C kuluçka plaka bir gecede.
2. Pozitif floresan griffona simplicifolia ile boyama tarafından PMVEC saflık doğrulayın lektin ve floresan ile negatif boyama Helix pomatia lektin (arteriyel endotelyal hücreler için bir işaretleyici). Aliquot hücreleri ve sıvı azot dondurucuda.
3. Deneyler için hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş DMEM) korumak ve hücreleri içeren % 5 CO₂37 ° C kuluçka büyür. Hücreleri pasajlar 5-15 kullanın.
   1. Sitotoksik supernatants nesil, 2 x 10⁶ hücreler bireysel 150 cm yemekleri plaka ve 3-4 gün için izdiham elde kadar büyür. Deney (aşağıya bakın) başına iki tabak kullanın.
   2. Sitotoksik supernatants çözümlenmesi için plaka 1 x 10⁵ 6-iyi bireysel kuyu hücrelere çanağı ve dört gün izdiham elde kadar büyür.
4. Süpernatant üretmek için bir PMVECs iki 150 cm yemekleri adım 1.3.1 fosfat tamponlu tuz ile yıkama, trypsinize ve sonra hücreleri saymak (Biz bir otomatik hücre sayacını kullanın ve üreticinin iletişim kuralı izleyin; Tablo reçetesibakın). PMVECs ile Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) diğer bulaşık yıkama ve P. aeruginosa enfeksiyon (MOI) 20:1 çokluğu, ya suşu ile enfekte. Bu şekilde elde edilir:
   1. P. aeruginosaiçin OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL. Bu seyreltme hazırlamak için 1 mL tek kullanımlık küvet 1 mL HBSS ekleyin. Yeterince bakteri 0,25 OD₅₄₀ bir spektrofotometre kullanarak ölçülen zaman elde edilir kadar 1.1 adımda hazırlanan tabak kapalı kazımak. Bir sonraki adım ne kadar bakteri gerekli olacak bir hesaplama sağlar.
   2. PMVECs kültür tabağına sayısı belirlendikten sonra (1.4 yukarıdaki adım), bakteri PMVECs içeren ikinci, Sigara trypsinized kültür yemek için eklenecek uygun sayısını belirleyin. Örneğin, PMVECs kültür tabak 1.3 x 10⁷ hücreleri içeren, sonra 1.3 x 10⁷ hücreleri x 20 bakteri/hücre x 1 mL/2 x 10⁸ CFUs hazırlamak belirlediyseniz 1.3 mL bakteri =.
   3. 150 cm çanak tüm yüzeyine sıvıyla kaplı, sonra seyreltilmiş bakteri PMVECs plakasına eklemek bakterilerin 1.3 mL HBSS 20 mL, son bir birime oranında seyreltin.
   4. Kuluçkaya boşluklar plaka olarak gözlenen hücre monolayer şekillendirme görülebilir kadar % 5 CO₂ kuluçka için 4-5 h, 37 ° C'de bakteri ile aşılanmış PMVECs (bkz: Şekil 1 uygun düzeyde boşluk oluşumu için).
   5. Süpernatant toplamak sonra hücresel enkaz kaldırmak için masa üstü bir santrifüj 2.000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
      Not: Herhangi bir masa üstü santrifüj üreten yeterli G'lik zorla unlysed hücreleri ve büyük hücreli parçaları-ebilmek var olmak kullanılmış için bu adımı cips için.
   6. Süpernatant süpernatant bakteri kaldırmak için filtreden geçmek sonuna, sonra bağlı 0.2 µm filtresi olan bir şırınga içine dökün.
   7. Bir aliquot, steril süpernatant sitotoksisite sınamak için kullanın (bkz. 2.1) ve kalanı süpernatant ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak.

2. sitotoksik Supernatants Analizi

1. Sitotoksisite tahlil
   1. 6-iyi yemekler PMVECs izdiham kadar büyür. Yıkama wells bir kez HBSS ile daha sonra 1,5 mL (ya PA103 ya da ∆PcrV aşısını hücrelerden toplanan) filtre sterilize süpernatant bireysel wells için ekleyin. Steril HBSS başka bir şey için bir negatif kontrol ekleyin.
   2. 21-24 h CO₂ kuluçka plaka yerleştirin, sonra hücre öldürme/sitotoksisite için gözlemlemek (sonraki adıma bakın). Sitotoksisite daha fazla deneme için sergi supernatants kullanın ve bu da hücre öldürme gösterme atın.
   3. Hücre öldürme Nefelometri
      1. Ölçü laktat dehidrogenaz (karaciğer) serbest piyasada bulunan karaciğer tahlil kitleri ve üretici kullanarak ölü hücrelerden yordamlar önerilir.
      2. Alternatif olarak, hücre öldürme mikroskobik ImageJ yazılımını kullanarak ölçmek. Bunun için kayıt mikroskobik görüntüleri ve sağlam hücreleri içeren kültür yemek alanları, sonra hücreler (hücre ölümü bir monolayer gösterge) eksik bölgelerin ölçmek özel bir ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) makro (bkz: ek kodlama dosya kullanarak ). İsterseniz, el ile aşağıdaki gibi makro adımları izleyin:
         1. Görüntüleri (RGB veya TIFF biçiminde) makro girdi ve doymuş % 15 piksel için karşıtlığı ayarlayın. Kontrast-düzeltilir görüntüleri çoğaltın ve hücre ve gap alanı görüş alanı içinde yüksek karşıtlık görüntüsünü elde etmek için "arka plan çıkarmak" komutunu gerçekleştirir.
         2. Bu görüntü orijinal görüntüden çıkarma ve ortaya çıkan görüntü görüntü hesap makinesi "Ve" işlevi kullanarak orijinal görüntü ile birleştirir. Siyah (boşluk) ve beyaz (hücreler) maskesi ile eşik görev (en az 0, en çok 5) sonuç görüntü dönüştürmek ve gürültü yansımadan kaldırmak için "ikili aşındırmak" işlevini kullanın.
         3. Siyah beyaz piksel "alan kesir" ölçüm kullanarak sonuç görüntü içinde için oranını ölçmek. Arsa ve kesirli alanlar her tedavi süresi noktası için maksimal gap alanının yüzde ifade eder.
         4. Anlamına gelir hesaplamak ve Tukey'nın öğleden hoc testi, p değerleri anlamlı kabul 0,05 daha az ile tek yönlü ANOVA kullanarak karşılaştırın.
   4. İmmunoblot analiz varlığı amiloid, oligomeric tau ve Aβ kültür supernatants kurmak için kullanın. Kültür supernatants en az 10 kat Elektroforez önce konsantre dışında standart prosedürler^10,11,12, kullanan immunoblot çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. Süpernatant konsantre için 1-2 mL süpernatant olan membran 10 kDa molekül ağırlığı cut-off vardır Santrifüjü filtre ünitesi yerleştirin. Filtre ünitenin görüntülenmemesini bir masa üstü santrifüj ve santrifüj 2.000 x konsantrasyon gerekli derecesine kadar g (genellikle 45-60 dakika) elde.
      2. Konsantre süpernatant¹¹ protein miktarını belirlemek ve örnekleri eşit miktarda jel bireysel kuyu yükleyin.
      3. Jelleri çalıştırmak, proteinler nitroselüloz için daha sonra A11 Anti-amiloid antikor, T22 Anti-oligomeric tau antikor veya uygun ikincil antikorlar tarafından takip MOAB2 anti-Aβ antikor lekesi sonda. Standart Kemiluminesan yordamları kullanarak lekesi geliştirmek.
   5. Bir thioflavin T tahlil yapmak için supernatants içinde amyloids ölçmek için thioflavin T Floresan (ThT) kullanın. Bu ölçümler için filtre sterilize supernatants kullanın.
      1. Thioflavin T stok çözeltisi (50 x) 8 mg thioflavin T (ThT) askıya tarafından 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlamak. Karıştırma sonra çözüm parçacıklar kaldırmak için 0,22 µm filtre ile filtre.
      2. Ölçümler için PBS 1 mL spektrofotometre küvet içinde 1 mL 20 µL ThT stokunun ekleyin. Seyreltilmiş örnek bir spectrofluorimeter yerleştirin.
      3. 425 nm uyarma kullanarak ve floresan emisyon 450-575 nm 2 nm aralıklarla üzerinden tarama temel floresans emisyon ölçmek.
      4. 425 nm uyarma kullanarak zaman atlama tarama gerçekleştirmek ve verileri ile 482 nm Emisyon elde her 0,2 s 60 s.
      5. İlk 20 s zaman atlama tarama ölçer floresans boş küvet içinde. 20 s, tarama duraklatmak ve filtre sterilize süpernatant ile 10 µL küvet için ekleyin. Küvet INVERSION tarafından karıştırın ve geri spectrofluorimeter yerleştirin.
      6. Son 40 edinme zaman aşamalı tarama devam s veri.
      7. Zaman atlama tarama tamamlandığında, ayrıntılı olarak 2.1.5.3 aynı ayarları kullanarak bir son floresans emisyon spektrum taraması gerçekleştirin.

Sitotoksin supernatants P. aeruginosabakteri ile enfekte hücre içinde varlığı için tahlil için bir basit vitro tahlil geliştirilmiştir. Temel olarak, enfekte hücreleri kültür ortamından 4 h bakteriyel eklenmesinden sonra toplanır, bakteri filtresi sterilizasyon süpernatant kültürünün tarafından kaldırılır ve daha sonra steril süpernatant hücreleri yeni bir popülasyon için eklenir. Hücreleri sonra süpernatant eklenmesi sonra 21-24 h gözlenir ve hücre öldürme sayılabilir.

P. aeruginosa ilavesi PMVECs konfluent katmanları için hücreleri arasındaki boşlukları oluşumu neden olmaktadır. Vivo, boşluk oluşumu akciğer ödemi ve azalmış akciğer fonksiyon yol açar. Sitotoksin yayın içine hücre kültür supernatants ve yeterli PA103 ile kuluçka süresi için zaman noktası filtreleme için varlığı ile gösterildiği gibi hücre monolayer formunda başlar boşluklar belirtildiği şekilde açıklanan assay olarak, boşluk oluşumu kullanılır Şekil 1. ΔPcrV bakteri hücre boşlukları bu kuluçka koşullarda neden değil. Bir kez boşluklar tespit edilir, süpernatant olduğunu toplanan, filtre sterilize ve naif PMVECs sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için eklendi. Onların anılan sıraya göre supernatants PMVECs sonra 21-24 h için bir kuluçka yerleştirilir ve sonra gözlenen ve fotoğraflandı. Şekil 2' de gösterildiği gibi P. aeruginosa gerilme PA103 ile enfekte olmuş PMVECs üzerinden toplanan süpernatant kültürlü hücre ölüm indüklenen tarafından 21 h süpernatant eklenmesi sonra Sitotoksin içeriyordu. Buna ek olarak, hücre ölüm yok ya HBSS orta veya Pseudomonas ΔPcrV zorlanma toplanan süpernatant ile tedavi kontrol hücreleri gözlendi. Immunoblot analiz hiçbir amyloids PMVECs (Şekil 2) aşı takip ΔPcrV zorlanma tarafından oluşturulan iken amiloid molekülleri oligomeric tau ve Aβ, dahil olmak üzere, PA103 gerginliği, mantar enfeksiyonu sırasında oluşturulan olduğunu gösterdi. Amyloids rolüyle bu tahlil Sitotoksin kültürlü hücreler12süpernatant ek önce gelen amyloids immunodepletion tarafından doğrulanmıştır. Her ne kadar burada gösterilmeyen, sitotoksik süpernatant A11 Anti-amiloid antikor ve T22 Anti-tau oligomer antikor tamamen kullanarak, immunodepletion supernatants PA103 enfeksiyonu (Balczon ve ark. 2017 üretilen sitotoksik aktivitesinden depletes 12 ve Balczon vd., hazırlık).

Miktar hücre öldürme, roman, ucuz ve basit bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil için ImageJ yazılım mikroskobik bir alandaki hücreler (hücre öldürülmesi gösterge) eksikliği alanların doğrudan ölçüm izin vermek için adapte edilmiştir. Bu yöntem güvenilirliğini karaciğer hücreleri sürümüdür öldürme, hücre ölçme köklü yöntemi için doğrudan karşılaştırma tarafından doğrulandı. Şekil 3' te gösterildiği gibi ImageJ yazılım, beyaz hücreleri içeren bölgeleri mikroskobik alanın ve siyah hücrelere eksikliği bölgeler dönüştürmek için kullanılabilir. Daha sonra siyah beyaz alanlar basit oranında hücre ölüm ölçmek için kullanılabilir. Hücreleri bir konfluent monolayer ile başlatırken, mikroskobik alanın tüm bölgeler beyaz. Ancak, sonra supernatants Sitotoksin içeren ek 18 h tarafından monolayer boşluklar tespit edilemedi. Alan 36 h sonrası ilavesi sitotoksik süpernatant kadar doğrusal bir şekilde artmış hücre yoksun kültür yemeğin miktarı. Karaciğer yayın ölçerken aynı sonuçlar, ilk 18 h, sitotoksik süpernatant eklenmesinden sonra tespit edilmeden karaciğer sürümü ile elde edilmiştir. Maksimal hücre öldürme 36 h süpernatant eklenmesi sonra ölçüldü kadar karaciğer yayın daha sonra doğrusal bir şekilde arttı. Küçük hücre ölümü aşısını ΔPcrV hücrelerden (Şekil 3) toplanan süpernatant ile tedavi hücreleri veya kültürler için 36 h HBSS ile tedavi ölçüldü.

Tedavi ile bakteri hücreleri serbest amiloid miktarı ThT floresans ölçerek sayılabilir. Amyloids ThT için bağlama floresan yoğunluğu molekül ve an artmak içinde bir konformasyonal değişim neden olur. Bu tahlil için thioflavin T bir küvet için eklenir ve temel floresans ölçülür. Örnek küçük bir aliquot eklenirken floresans kayıt sonra durdu. Küvet sonra fluorimeter için döndürülür ve floresan emisyon kaydedilir değişimdir. Şekil 4' te gösterildiği gibi floresans emisyon artış gösterildiği gibi bulunan P. aeruginosa amiloid PA103 suşu ile inkübe hücrelerden süpernatant toplanan. Buna ek olarak, süpernatant ΔPcrV gerilme ile aşılanmış PMVECs üzerinden amyloids, artan floresan bir yokluğu tarafından belirtildiği şekilde yoksun.

Şekil 1. P. aeruginosa inolculation etkileri PMVEC morfoloji. PMVECs (A) ve PA103 P. aeruginosasuşu eklenmesi (B) sonra dört saat önce in konfluent monolayer. Boşluklar enfekte hücrelerde hücre monolayer açıkça görülebilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Sitotoksik supernatants analizlerini. [I] bölümü. Kontrol ve tedavi hücreleri temsilcisi görüntüleri. PMVECs 21 h için her iki PA103 bakteri (B) ya da zorlanma ΔPcrV ile (C)aşılamaya hücrelerden elde edilen süpernatant ile tedavi edildi. Kontrol hücreleri de HBSS arabellek (A)21 h için inkübe. Ölçek çubuğu 100 µm. Bölüm [II] =. Temsilcisi immunoblots supernatants, toplanan ΔPcrV (A) veya PA103 (B) enfekte PMVECs. Lekesi amiloid (A11) veya oligomeric tau (T22) karşı antikorlar ile probed. Mr kDa de. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Hücre öldürme Nefelometri. (A) temsilcisi mikroskop alanlardan alan hangi bölgelerde içeren ve hücreleri eksik ya beyaz ya da siyah, sırasıyla, ImageJ yazılımı kullanılarak çevrildi farklı zaman puan (h süpernatant toplama sonra). Dönüşüm aynı zamanda gösterilmeden önce aynı faz kontrast görüntü. Çubuk 100 µm. (B) = Nefelometri standart karaciğer yayın tahlil ve ImageJ tahlil kullanarak öldürme hücresinin karşılaştırılması. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Temsilcisi ThT floresans tahlil veri. Boş cuvettes ThT içeren heyecanlı 425 nm ve emisyon sonra floresan 482 ölçüldü nm. Arka plan floresans 20 s ve Süpernatant sonra gelen her iki PA103 - veya ΔPcrV-PMVECs için cuvettes eklendi aşısını toplanmıştır. Floresans emisyon sonra 40 saniye kaydedildi.

Rapor için hiçbiri.