Yöntem makalesi

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 Mart 2018

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hangi formu synapses doğrudan üzerine nöronlarda optik tectum göz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) oluşan Xenopus iribaş retinotectal devre nasıl sinir devreleri çalışma popüler modelidir kendini topla. Bütün taşıma yeteneği yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar ve RGC uyarılmış yanıt, ya da içinde vivo hücre veya tüm beyin hazırlık kullanarak büyük bir vücut, normal yatan mekanizmaları yüksek çözünürlüklü verilerin üretti ve anormal, devre oluşumu ve işlev. Burada nasıl vivo içinde hazırlık, özgün tüm beyin hazırlık gerçekleştirileceğini açıklar ve daha yakın zamanda yatay beyin dilim hazırlık tectal neurons tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek için geliştirilmiştir. Her hazırlık benzersiz deneysel avantajları vardır. Vivo hazırlık tectal nöronlar doğrudan yanıt göz yansıtılan görsel uyaranlara karşı kayıt sağlayan. Tüm beyin hazırlık için son derece kontrollü bir şekilde var olmak harekete geçirmek RGC akson, ve yatay beyin dilim hazırlık kaydından tectum tüm katmanları arasında sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinotectal devre amfibi görsel sisteminin önemli bileşenidir. Hangi onların aksonlar optik tectum nerede postsinaptik tectal nöronlar ile sinaptik bağlantıları oluşturmak için proje RGCs gözünde, oluşur. Xenopus iribaş retinotectal devre nöral devre oluşumu ve işlev eğitim için popüler bir gelişim modelidir. Bu kurbağa'nın retinotectal devrenin bir güçlü deneysel model1,2,3render birçok özniteliği vardır. Bir büyük öznitelik ve odağı bu makalenin tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar, içinde VIVO veya tüm beyin hazırlık kullanarak yürütmek için yeteneği var. Gerilim ve akım kayıt modları kelepçe destekler bir amplifikatör ile donatılmış bir Elektrofizyoloji sondaj platformu ile tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir nöron'ın Elektrofizyoloji yüksek çözünürlükte karakterize edilebilir izin verir. Sonuç olarak, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar retinotectal devre oluşumu temel aşamaları boyunca geliştirme detaylı ve kapsamlı bir anlayış ve plastisite içsel4,5 hazırladık , 6 , 7 ve sinaptik8,9,10,11 özellikleri. Tüm cep telefonu yama kelepçe tectal nöron kayıtları birleştirerek, genlerin veya morpholinos bu nöronların12ve kurulan görsel kaçınma testi13 ile görsel destekli davranışını değerlendirmek için bir yöntem ilgi ifade yeteneği teşvik molekülleri, devre fonksiyon ve davranışı arasındaki bağlantıları tanımlaması.

Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde veri çünkü genetik kalsiyum göstergesi GCaMP6, gibi daha yeni görüntüleme yaklaşımları kullanarak mümkün değildir yüksek çözümleme türü bulunmakla birlikte kalsiyum göstergeler kullanarak görüntüleme verir unutmamak gerekir Kalsiyum dynamics büyük popülasyonlarda nöronların arasında aynı anda, orada hayır doğrudan veya özel elektrik parametreleri somata delta Floresans ölçerek elde edilebilir ve gerilim bir yolu yoktur belirgin şekilde kelepçe ölçmek için nöron akım-gerilim ilişkileri. Açıkça bu ayrı iki yaklaşım, Elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme, üst üste güçlü sahip ve farklı veri oluşturmak. Bu nedenle, en iyi yaklaşım belirli deneysel soru ele alınmaktadır bağlıdır.

Burada, biz tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir vivo içinde hazırlık, tüm beyin hazırlık, kullanarak iribaş optik tectum nöronlar edinme için bizim yöntem tanımlamak ve daha yeni bir14 bizim laboratuarımızda geliştirildi tüm beyin hazırlık modifiye . Temsilcisi sonuçları bölümünde her hazırlık ve elde edilebilir veri farklı türde deneysel avantajları göstermektedir. Sınırları ve güçlü ipuçları sorun giderme, yanı sıra farklı ürünleri bir tartışma bölümünde dahil edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Wyoming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Elektrofizyolojik kayıtlar da dahil olmak üzere tüm yordamları oda sıcaklığında yaklaşık 23 ° c yapılmaktadır Tüm yöntem tanımlamak burada tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir.

1. Vivo içinde hazırlık

  1. İribaş anestezi.
    1. İribaş % 0,01 ile Steinberg'ın solüsyon içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin MS-222 yaklaşık 5 min için.
      Not: Ortak bir balık ve amfibi anestezik MS-222 aka "Tricaine" dır. Kurbağa yavrularını mM Steinberg'ın çözümde yetiştirilir: 0.067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES.
    2. Adım 2 için devam etmeden önce derin anaesthetized (non-yanıt veren ve artık yüzme) iribaş olduğundan emin olun.
  2. Anatomi/kayıt çanak yere batık silikon bloğu için imzalat iribaş güvenli.
    1. Harici kayıt solüsyon içeren bir diseksiyon/kayıt yemek anaesthetized kurbağa taşımak için tek kullanımlık transfer pipet kullanın (115 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl23 mM, 3 mM MgCl2, HEPES, glikoz; 1 mM 5 mM ayarlamak 7,25 kullanarak pH 10 N NaOH, Osmolarite 255 mOsm).
      1. Spontan kas en aza indirmek için twitches, asetilkolin reseptör engelleyici, tubocurarine (100 µM) harici çözüm için ekleyin. (Genellikle, bu bir 10 mM tubocurarine stokunun 100 µL harici çözüm 10 mL için eklemek için 200 µL pipet kullanarak yapılır).
    2. Böcek iğne kullanarak, kurbağa, dorsal tarafta, silikon elastomer batık bir blok için güvenli (Sylgard 184 gibi Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), hangi-var yapıştırılmış diseksiyon çanak yere.
      Not: Pimleri yerleşimini önemlidir: Proje göz beyin, afferent RGC akson impaling önlemek için yeterince Kaudal her iki tarafında yer onları ve optik tectum (şekil 1A) anterior beyin girin.
  3. Orta çizgi boyunca beyin fileto.
    1. Beyin net görebilmek için steril 25-G iğne kullanarak orta çizgi boyunca yüzeysel bir kesi yaparak beyni örten cilt kaldırın.
    2. İğne Nöral tüp içine yerleştirip hafifçe yukarı doğru (dorsally) öyle ki tüp dorsal kısmı temiz bir şekilde yere plaka sağlam (şekil 1B) bırakarak (parçalanmış) kesilir çekerek aynı orta çizgi ekseni boyunca beyin fileto.
      Not: Afferent duyusal girdiler tectum kat plaka girin çünkü Nöral tüp zemin plakası olduğu gibi bırakılması önemlidir.
  4. Tectal nöronlar kapakları şeffaf ventrikül membran kaldırın.
    1. Kayıt çanak Elektrofizyoloji teçhizat taşımak ve bir kırık cam pipet ucu tectal nöron hücre organları örten ventrikül membran kaldırmak için kullanın. Ucunu hafifçe narin görev silecek arasında sürükleyerek kır.
    2. Pipet pipet yuvasına vida ve optik tectum micromanipulator üzerinden aşağı indir.
    3. Tectum uzak ventrikül membran soyma için kırık pipet kullanın.
      Not: Membran tüm tectum kaldırmak için gerekli değildir. küçük bir pencere yeterli ve nöronlar bol erişim sağlar.
  5. Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek.
    Not: Bu aşamadan itibaren Segev, et al. açıklandığı gibi fare beyin dilimleri tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları taşımaya benzer bir yaklaşımdır 16 (Şekil 1C).
  6. Retina yansıtılan ışık tüm alanı parıltısı tectal nöron yanıtlarını kaydetmek.
    1. Tüm alan flaş ışık retina proje için bir optik fiber kurbağa'nın göz bitişik yerleştirin. Optik fiber diğer ucunda bir LED ışık parlaklığı denetlenmesini sağlar bir değişken direnç doğrultusunda olduğunu. Tetikleyici LED Dijital çıkış ile amplifikatör. Bu şekilde, tüm alanı değişen şiddetlerde ışık yanıp söner olabilir (şekil 4A) kaydedildi.

2. tüm beyin hazırlık

  1. 1.1-1,3 adımları gerçekleştirin.
    Not: Bu hazırlık için dış çözümde tubocurarine gereği yok.
  2. Beyin izole et.
    1. 25-G iğne (Şekil 2A) arka beyin sever için kullanın.
    2. İribaş bütün beyninden izole etmek için hafifçe beyinde tüm yanal ve ventral bag doku ve sinir lifleri koparmaya Kaudal-için-rostral bir yön altında iğne çalıştırın.
  3. Beyin silikon elastomer bloğu için güvenli.
    1. Tamamen serbest geldiğinde, silikon elastomer bloğu için beyin yanında duvar ilanı olfaktör ampuller biri aracılığıyla bir PIN ve arka beyin (Şekil 2B) aracılığıyla başka bir PIN güvenli. Bu kayıt tectal nöronlar için en uygun yapılandırmadır.
  4. Diseksiyon kapsamdan sabitlenmiş tüm beyin hazırlık Elektrofizyoloji teçhizat için içeren yemek taşımak. 1.4. adımda açıklandığı gibi bir kırık cam pipet kullanarak ventrikül membran kaldırın.
  5. İki kutuplu bir uyarıcı elektrot optik hemisferlerine (nerede her Eye'dan axon yolları orta çapraz) doğrudan RGC akson etkinleştirmek için yerleştirin.
    1. İki kutuplu uyarıcı elektrot rostral ve hemen hemen bitişiğinde, büyük orta ventrikül yerleştirin. Optik hemisferlerine hemen rostral büyük orta ventrikül (Şekil 2B) için yer alır.
      1. Böyle küçük bir göçük dokusunda oluşan yavaşça uyarıcı elektrot optik hemisferlerine indirin. İki kutuplu elektrot stimülasyon tam olarak kontrol edilebilir gücünü sağlayan bir darbe uyarıcı tarafından tahrik edilmektedir.
  6. Segev, et al. tarafından açıklandığı gibi bütün hücre yama kelepçe kayıt (Şekil 2C) gerçekleştirmek 16

3. yatay beyin dilim hazırlık

  1. 2.1-2,3 adımları gerçekleştirin.
  2. (Hangi vivo içinde karşılık gelen en dorsal dördüncü) en yanal dördüncü bir yüzünün bir optik tectum tüketim için jilet kullanın. # Bu parçayı şekil 3' teAgösterilen Kaudal rostral uçağa paralel yapılmıştır.
  3. Silikon elastomer ile dilimlenmiş tarafına beyin yeniden pin yukarı bakacak şekilde (somata ve neuropil doğrudan kayıt için erişilebilir böylece) ve silikon elastomer blok (şekil 3 uzak bakan beyin ventrikül yüzeyine yan B) böylece (İki kutuplu bir elektrot optik hemisferlerine üzerinde yerleştirilebilir).
  4. Segev, et al. açıklandığı gibi tüm cep telefonu yama kelepçe veya yerel dosyalanmış potansiyel kayıt (şekil 3C) yerine getirmek 16

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm alan flaş ışık ışık uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için elde edilen yanıt bireysel tectal neurons (şekil 4A) kaydedilir iken retina tahmin edilmektedir. Bu belirli iletişim kuralı her iki nöron (yanıt "On") açma ve 15 off dönüm ışığa tepki ölçmek için tasarlanmıştır daha sonra "Off yanıt." ölçmek için s Tectal nöronlar genellikle sağlam ve yanıt kapalı sergi (nöron gösterilen burada içinde kaydedilen gerilim kelepçe moduyla klempe 60mV...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada açıklanan tüm yöntemleri tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. Sahne 42 ile Kurbağa yavrularını yeterince büyük ve yeterince gelişmiş böylece böcek pimleri beyin vivo kayıtları için ve tüm beyin diseksiyon taşımak için her iki tarafında yerleştirilebilir. Daha önceki aşamalarında, Kurbağa yavrularını aslında iki boyutlu olduğunda (Yani, düz), burada açıklanan yak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SBC COBRE 1P20GM121310-01 NIH grant tarafından desteklenen.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Diseksiyon mikroskobu
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAmfibi genel anestezik
Sodyum Klorür (NaCl)Fisher ScientificS271-3Stienberg çözeltisini ve harici çözeltiyi hazırlamak için kullanılır
Potasyum Klorür (KCl)Fisher ScientificP217-500Stienberg çözeltisini ve harici çözeltiyi hazırlamak için kullanılır
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGStienberg'in çözeltisini ve harici çözeltisini hazırlamak için kullanılır
Kalsiyum nitrat tetrahidrat (Ca(NO3) ve boğa; 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GStienberg'in çözeltisini hazırlamak için kullanılır   
Magnezyum Sülfat (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Steinberg çözeltisini hazırlamak için kullanılır
Kalsiyum Klorür (CaCl2< / sub>)Sigma-AldrichC5080-500GHarici kayıt çözeltisi hazırlamak için kullanılır
Magnezyum Klorür (MgCl2< / sub>)JT Baker2444-01Harici kayıt çözümü hazırlamak için kullanılır
D-glikoz SusuzMallinckrodt Kimyasalları6066-04Harici kayıt çözeltisi hazırlamak için kullanılır
Tubokurarin hidroklorür pentahidratSigmaT2379Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti
Böcek PimleriGüzel Bilim Araçları26002-100.1mm çaplı paslanmaz çelik pimler
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning761028Önceden tartılmış monomer ve kürleme maddesi kiti
Steril Polistiren Petri Kabı - 60x15mmFisher ScientificAS4052Küçük petri kapları
PrecisionGlide İğne 25Gx5 / 8 (.0.5mm X 16mm)BD305122Şırınga iğneleri
1mL Kayma Ucu Tüberkülin Şırıngası BD309659Tek kullanımlık, steril şırıngalar
Borosilikat pipet camıSutter AletiBF150-86-10HPPipet çekme makinesi kullanılarak istenen özelliklere çekildi
Alevli/Kahverengi Mikropipet ÇektirmeSutter AletleriP-97Elektrofizyolojik kayıt için mikropipetler üretir
Kimwipes Kimtech mendilKimberly-Clark34120Hassas Görev Tüy bırakmayan silecekler
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMoleküler Cihazlar1-CV-7BAkım kelepçesi ve gerilim kelepçesi headstage
MP-285 Masaüstü Kontrolörlü Motorlu ManipülatörSutter AletiMP-285/TElektrofizyoloji teçhizatında headstage kontrolü
Fiber Bağlantılı LED (Yeşil)ThorlabsM530F2Yeşil LED ile eşleştirilmiş fiber optik kablo
Küme Bipolar Elektrot (25 & mikro; m çapı)FHC30207Bipolar uyarıcı elektrot
ISO-Flex StimülatörAMPI (İsrail)  Üreticiyle iletişime geçinEsnek uyaran izolatörü
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifikatörMoleküler Cihazlar2500-0157Voltaj ve akım kelepçesi kaydı için amplifikatör 
Digidata 1322A sayısallaştırıcıMoleküler Cihazlar2500-135Elektrofizyoloji kaydı için veri toplama sistemi
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Elektrofizyoloji için mikroskop
Micro-g Lab MasasıTMC63-533Elektrofizyoloji mikroskobu için hava masası
Inspiron 620 Windows 7 64-bit Dell D06D001 Bilgisayarlı Kişisel MasaüstüBilgisayar Elektrofizyoloji yazılımı
c2400 CCD kameraHamamatsu70826-5Elektrofizyolojik görüntüleme için şarj bağlantılı cihaz kamerası
Saat 7 O'Clock Süper Platin Paslanmaz Tıraş BıçağıGilletteCMM01049Platin kaplı paslanmaz tıraş bıçakları
Transfer PipetleriFisher Scientific13-711-7MTek Kullanımlık Polietilen transfer pipetleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Vivo Haz rlamaT m Beyin Haz rlYatay Beyin KesitiOptik Tektum Kay tlarRetinal Gangliyon H cresi AktivasyonuBipolar Stim lasyon ElektroduSilikon Elastomer BlokHarici Kay t Sol syonu

İlgili makaleler