Yöntem makalesi

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/57470

⸱

23 Haziran 2018

 ,  , 
1Institut de Biotecnologia i Biomedicina and Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein toplama hücresel oksidatif stres ortaya çıkarır. Bu iletişim kuralı amyloidogenic proteinlerin hücre içi Birleşik ve onlarla akış sitometresi kullanarak ilişkili oksidatif stres izlemek için bir yöntem açıklanır. Yaklaşım β-amiloid peptid çözünür ve toplama eğilimli türevleri davranışını incelemek için kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein misfolding ve toplama amiloid biçimler içine başlangıçlı ve ilerleme çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili olduğu. Ancak, hala çok az bilgi var hakkında nasıl çözünmez protein toplamları onların toksik etkileri içinde vivouygulamayın. Basit prokaryotik ve ökaryotik canlılar, bakteri ve Maya, gibi önemli ölçüde mevcut anlayışımız mekanizmaları hücre içi amiloid dil oluşumu, toplamları yayma ve toksisite arkasında katkıda bulunmuştur. Bu protokol için maya kullanımı protein toplamları oluşumu ve hücresel oksidatif stres üzerindeki etkileri arasındaki ilişkiyi incelemek için bir model olarak tanımlanıyor. Yöntem bir amyloidogenic protein çözünür/toplanan hücre içi durumunu algılama akış sitometresi (FC) kullanarak kendi ifadeden kaynaklanan hücresel oksidatif hasar miktar ile birleştirir. Bu basit, hızlı ve nicel yaklaşımdır. Çalışma tekniği β-amiloid peptid türevleri ile onların anılan sıraya göre iç Toplama eğilimlerini büyük bir set neden hücresel oksidatif stres birleştiriliyor tarafından gösterilmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteostasis hücre fitness ve yaşlanma süreçlerinin temel bir belirleyici olduğunu. Hücrelerde, protein homeostazı sofistike protein kalite kontrol doğru misfolded protein conformers chaperones ve/veya onların hedeflenen proteolizis tarafından birkaç iyi korunmuş mekanizmalarıyla1 refolding emin olmak için ağlar amaçlayan tarafından yapılmaktadır ,2,3,4,5. Çok sayıda çalışmalar başlangıçlı ve geniş bir insan hastalıkları ve proteostasis, protein misfolding ve toplama için önde gelen başarısızlık arasındaki bağlantı için destek sağlar. Örneğin, protein mevduat varlığı çok nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer, Parkinson, gibi ve Huntington hastalıkları6,7,8patolojik damgasını olarak kabul edilir, prionogenic hastalıklar ve sigara dejeneratif amyloidoses9. Toplama tepki erken oligomeric ve protofibrillar derlemelerde diğer proteinler ile anormal etkileşim içinde kalabalık hücresel ortamı10kurulması ana elicitors, sitotoksisite, çoğu sürülmüştür. Buna ek olarak, protein kapanımlar (PI) onların toksik etkisi11,12yayılıyor hücreler arasında aktarılabilir. Bu nedenle, PI oluşumu gerçekten tehlikeli toplanan türlerin varlığı belirli konumlara hücresinde, nerede onlar olabilir işlenen veya önemli yan etkileri olmadan birikmiş kısıtlar detoxifying bir mekanizma teşkil olabilir 13 , 14.

Standart vitro biyokimyasal yaklaşımlar toplama reaksiyonlar ve onların özellikleri15,16doldurmak farklı türlerin önemli anlayışlar hazırladık. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan koşulları açıkça farklı hücre içinde meydana gelen ve bu nedenle, kendi fizyolojik alaka soru. Protein kalite kontrol, autophagy veya Düzenleme Ökaryotlar19,20,21 arasında hücresel redoks devlet17,18 , gibi hücresel yolları önemli korunması nedeniyle ,22,23, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) protein toplama moleküler belirleyicileri çalışmaya ayrıcalıklı basit bir hücresel model çıkmıştır ve ilişkili sitotoksik etkisini de biyolojik olarak uygun ortamlar24,25,26.

Protein toplama eğilimi doğal olarak birincil sırada kodlanmış bir özelliktir. Böylece, amiloid benzeri yapıların oluşumu kimlik ve toplama teşvik potens değerlendirilmesi dayalı tahmin edilebilir polipeptitler27bölgelerde. Ancak, protein sequences vitro toplama özelliklerini tahmin etmek için bioinformatic algoritmaları başarı rağmen bunlar hala bu eğilimlerini vivo içinde sitotoksik etki nasıl tercüme tahmini çok uzak. Belirli bir protein toplanan durumunu ve onun ilişkili hücresel hasarı arasındaki bağlantıyı sistematik bir şekilde ele alan çalışmalar Hesaplamalı bu sınırlamayı aşmak için yardımcı olabilir. Bu bağlantı yalnızca tek bir kalıntı farklı ama toplama eğilimlerini vivo içinde28sürekli bir dizi görüntüleme β-amiloid peptid Aβ42 türevleri büyük bir set yararlanarak bu da çalışmanın, yöneliktir. Maya hücreleri toplama eğilimli proteinler tarafından elde edildi oksidatif hasar için muhasebe konformasyon türler tanımlamak için FC dayalı bir yaklaşım özellikle de açıklanmıştır. Metodoloji basitlik, yüksek üretilen iş yetenekleri ve doğru nicel ölçüm gibi birçok avantaj sağlar. Bu yaklaşım o PI oksidatif strese karşı koruyucu bir rol oynar teyit mümkün kıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. S. cerevisiae kültür ve Protein ifade

Not: Aβ türevleri farklı göreli toplama eğilimlerini de Aβ42 peptid (Şekil 1A) 19 (Phe19) konumunu tek bir kalıntı bir mutasyon nedeniyle sergi. Bu peptid çeşitleri bir toplama muhabir (Şekil 1)29davranan floresan yeşil protein (GFP), ile etiketlenir.

  1. Maya hücreleri BY4741 ebeveyn arka plan (MATa onun3Δ1 leu2Δ0 bir araya geldi15Δ0 ura3Δ0)30ile 20 Aβ42-GFP türevleri için kodlama plazmid dönüşümü. Her plazmid GFP için GSSGSSG bağlayıcı tarafından erimiş bir Aβ42 mutant için kodlar. Plazmid pESC(-URA) ve seçilebilir işaret URA329içerir.
    1. Sentetik tam orta urasil (SC-URA) aşağıdaki bileşenleri içeren olmadan hazırlamak: 1.9 g/L Maya azot urasil, 5 g/L amonyum sülfat ve 900 mL GKD2O temel kombine ile 100 mL % 20 (w/v) glikoz.
    2. Dönüştürülmüş Maya hücreleri bir koloni % 2 glikoz içeren SC-URA orta 20 mL koymak ve kültürler gecede 30 ° C'de ajitasyon 210 devirde altında büyür.
  2. Ertesi gün, yeni Maya hücreleri kültürleri 5 mL taze SC-URA orta de aşı 100 µL gecede kültür tarafından büyümek.
  3. Bir OD590 0,5, 3000 x g 4 dk için de kültürler santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve aynı birimin taze SC-URA Orta % 2 raffinose içeren hücrelerde resuspend.
  4. 30 dk için 210 devirde ajitasyon altında 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra 4 dk 3000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Taze SC-URA orta Rekombinant protein ifade ikna etmek için % 2 galaktoz içeren hücrelerde resuspend.
  5. 16 h SC-URA Orta % 2 galaktoz içeren protein ifadede inducing sonra Santrifüjü 3000 x g 4 dk için de tarafından 1 mL steril microcentrifuge tüpler indüklenen hücre hasat.
    Not: 16 h. Induced Maya hücreleri Aβ42-GFP türevleri ifade bir indüksiyon döneminde Rekombinant protein dağıtım hücrelere (Şekil 2B) belirlemek için floresans mikroskobu tarafından görüntülenmiştir sonra en alakalı farklılıklar ortaya.

2. hücre boyama

Not: Taze sigara kaynaklı hücreler bir FC çözümleme sırasında bir floresan eşiği belirlemek için bir negatif kontrol olarak gereklidir.

  1. 16 h kaynaklı Maya hücreleri almak ve 590 optik onların yoğunluğuna belirlemek nm (OD590). Onları steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 0.1 OD590 için sulandırmak.
    1. 1 fosfat tamponlu tuz x aşağıdaki gibi hazırlamak: NaCl, KCl, Na2HPO4, 1.44 g 0.2 g 8 g ekleyin ve KH2PO4 GKD2O. 800 ml 0,24 g doldurun 1 L-GKD2O kadar çözüm pH 7.4 için ayarladıktan sonra HCl. ile arabellek 0.2 µm filtreden filtre.
  2. Uygun şekilde etiketlenmiş tüpler (12 × 75 mm yuvarlak alt Polistiren) ifade hücre süspansiyonlar aktarmak ve onları ışıktan korumak. Akış Sitometresi Analizi, Sigara kaynaklı ve lekeli olmayan hücreleri ile birlikte için üzerinde yüklü olması için hazır olduklarından emin olun.
  3. Her örnek 5 mikron son bir konsantrasyon, oksidatif stres sonda (Örneğin, CellROX derin kırmızı) ekleyin ve karanlıkta 30 dk 30 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  4. Kuluçka sonra 3 kez 1 x PBS içeren hücreleri yıkama ve onları arabellek onların analiz FC tarafından daha önce aynı hacmine resuspend.

3. Akış Sitometresi Analizi

Not: bir FC Kur uygun lazerler ve filtreler ile GFP ve oksidatif stres sonda floresans sinyal algılamak için kullanır. GFP tespiti için 488 nm mavi lazer ve oksidatif stres sonda floresans tespiti için 635 nm kırmızı lazer ile donatılmış bir akış sitometresi kullanılabilir. Emisyon floresans GFP ve oksidatif stres sonda edinimi yapılır 530/30 nm BP filtre ve 660/20 BP filtrenin sırasıyla (Tablo 1).

  1. Yeni çalışma sayfası panelini açma tıklayın ve aşağıdaki edinme nokta araziler oluşturun.
    1. Araç çubuğundan Dağılım çizim aracı seçin ve bir komplo ile yan dağılım-alan (SSC-A) y ekseni vs üzerinde ileri dağılım alanı (FSC-A) x ekseni üzerinde doğrusal bir ölçek değişkenlerinin.
    2. Araç çubuğundan Dağılım çizim aracını tıklatın ve x ekseni vsFL1-alan (FITC) değişkenleri ile bir çizim oluşturma. Fl3-alan (APC) y ekseni Logaritmik bir ölçekte.
  2. Aletleri ayarları simgesini tıklatın. Tazminat sekmesini tıklatın ve tüm tazminat düzeyleri ayarlayın. Satın alma sekmesinde tıklatın ve kaydedilecek 20.000 olayların toplam sayısı seçin.
  3. Akış hızı düşükolarak geçmek için Akış hızı simgesini tıklatın.
  4. Sigara kaynaklı, günahı hücreleri yayınlanmaya başlaması için Al sekmesini tıklatın ve nüfus orta-sol çeyreğinde dağıtılır kadar ileri Araç ayarları ve yan dağılım gerilim ayarlayın.
    1. Hücre popülasyonu hücre artıkları dışında bir bölgesini R1 ayarlamak için Çokgen ikonuna tıklayın ve bu geçişli nüfus P1 kullanın R1 = tüm floresan nokta araziler ve çubuk grafik gösterimleri (Şekil 3).
  5. Floresans sinyalinin Devresel_ödeme gerilimi ayarlamak için hücreleri içinde sol alt çeyrekte dağıtılır kadar kazanç Araç ayarı sekmesinde ayarlama FL1-FL3 nokta Arsa günahı hücreleri çalıştırın.
  6. Örnek GFP floresans ölçmek için indüklenen hücrelere değiştirin. Nüfus sağ alt çeyreğinde dağıtıldığında Araç ayarı sekmesinde kazanç FSC-A vs FL1 (FITC) olarak ayarlayın. Bir kapı (Gate P2) ile pozitif hücre nüfus tanımlayın.
  7. Değişiklik olmayan indüklenen için örnek bir FSC-A vs FL3 (APC) nokta arsa üzerinde floresans tarafından oksidatif stres görüntülemek için hücreleri lekeli. Hücre popülasyon sol üst çeyreğinde dağıtılır kadar kazanç ayarlayın. P3 pozitif hücre kalabalıkta bir kapı.
  8. Hücre floresans temsil etmek için iki çubuk grafik bir cenaze dört nikah çubuk grafik simge olun. Floresan yoğunluğu temsil etmek için FL1 (FITC GFP floresans temsil eden) x ekseni ise FL3 (APC) Floresan temsil eden y ekseni, P2 ve P3 nüfusu sırasıyla logaritmik bir ölçekte uygulama emin olun.
    Not: Histogram bindirmeleri floresans profilleri farklı Aβ türevleri ifade hücre arasındaki farkları göstermek için iyi bir yoldur.

4. rekombinant Protein Immunodetection

  1. Protein ifade düzeylerini belirlemek için Santrifüjü 4.000 x g 6 min için de 16 h için indüklenen maya kültürleri hasat ve hücre granül-80 ° C'de depolayın
    1. 16 h PBS için Rekombinant protein ifade kendine hakim hücre resuspend. 200 µL hücre süspansiyonlar, her Aβ42-GFP mutant bir OD590 20 için hazırlayın.
  2. Toplam protein fraksiyonu analiz, her mutant 100 µL Santrifüjü 14.000 x g 20 dk için de tarafından hasat ve Maya lizis arabellek Y aynı birim hücre granül resuspend-(50 mM Tris-HCl pH 8.0, % 1 DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA içeren 10 mg/mL SB3-14 (en düşük ücret istyl sulfobetaine) takıma 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF)).
    1. Örnekleri hafif ajitasyon altında oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
  3. Protein özü konsantrasyon Bradford tahlil kullanarak belirleyin. % 15 akrilamid SDS-sayfa Elektroforez jel ve leke üzerine polivinilidin difluoride (PVDF) membran 100 V 60 dk için her örneğinin protein ekstresinin 5 µg yükleyin.
    1. Bir Bradford reaktifi ile Coomassie parlak mavi G-250 100 mg 50 mL % 95 etanol çözünmüş ve 100 mL % 85 (w/v) fosforik asit ekleyin hazırlayın. O zaman, boya tamamen çözüldüğünde, GKD2O 1 m'ye karışımla sulandırmak ve selüloz filtre kağıdı kullanmadan önce aracılığıyla filtre.
      Not: Bradford reaktifi olmak hafif kahverengi.
    2. Sığır serum albumin (BSA) 1.000 µL Bradford reaktif proteinin 5-100 µg arasında değişen bir standartta hazırlayın.
    3. 1-10 µL protein Bradford reaktifi 1 mL için ayıklamak ve 5 min için oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya ekleyin.
    4. Standartları ve protein özü örnekler, OD595absorbans ölçmek.
    5. Analiz için bir arsa için standartlar vselde absorbans değerleriyle olun. µg protein. Standart eğri dayalı, protein, miktarı üzerinden orijinal örnekleri konsantrasyonları hacmi ve seyreltme, varsa göz önünde bulundurarak belirleyin.
  4. Membran ile 1 x Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS), % 0,1 durulama ara 20 (TTBS) ve %5 (w/v) yağsız Kuru süt 1 x TTBS kullanarak engelleyiniz.
    1. 10 x TBS 1 litre hazırlamak için 24 g Tris temel ve NaCl 88 g H2Odd 900 ml dağıtılması ve pH 7,6 için ayarlayın. GKD2O 1 L. son bir birime ekleme 1 x çözüm için 10 x hisse senedi, 1 kısım GKD2O. 9 parçaları ile karıştırın.
  5. Membran bir birincil β-amiloid antikor seyreltilmiş 6E10 1:1,000 ile 1 h için kuluçkaya ve ikincil antikor keçi ile Oda sıcaklığında 1 h için 1:10, 000 Anti-fare IgG-HRP eşlenik seyreltilmiş.
  6. 1 mL Luminata floresan reaktif kullanarak membranlar geliştirmek ve grup tarafından densitometric analiz 5.2 adımda anlatıldığı gibi ölçmek.

5. veri analizi

  1. FC tarafından elde edilen verileri analiz etmek için Ortalama floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir tablo oluşturmak ve onun karşılık gelen standart hata ve/veya GFP floresans ve oksidatif stres düzeyleri farkı (MF) katsayısı ile ortalama Floresans.
    1. Müfettiş sekmesini ve her kanal için gerekli olan istatistiksel verileri özelleştirmek için İstatistikleri simgesini tıklatın.
      Not: protein türevleri karşılaştırılırken, katlanır arka plan veya çözünürlük metrik (RD) Floresan veri değerleri dönüştürür:
      figure-protocol-1
      Bu ölçüm, sorun örneklerinin ortalama floresans kötü örnek olduğunu, bir denetim olarak kullanılan hücre ortalama floresans ortalama denetimidir ve SD ortalama floresans standart sapmasıdır. Sadece örnekleri aynı zamanda veri yaymak için hesapları arasındaki farkı hesaplar gibi RD faktör MFI değerden daha doğru bir dizindir. Zaman içinde farklı deneyler gelen verilere karşılaştırma yürütülen bu hesaplama özellikle uygundur. RDs hesaplanan bir kez bir istatistiksel test kullanımı protein çeşitleri arasında gözlenen farklılıklar önemini onaylamak için tavsiye edilir.
  2. Protein immunodetection için ImageJ yazılım kullanarak Western blot tarafından Rekombinant protein düzeyleri ölçmek.
    1. Dansitometresi analiz daha önce geliştirilen membran orijinal raw görüntüleri JPEG dosya biçimi ve gri tonlama moduna dönüştürün.
    2. Çözümle menüsünde demek grideğerine Ayarla ölçümler kısmında ayarlayın.
    3. ImageJ dikdörtgen aracını tıklatın ve grup Dansitometresi analiz için tutarlı boyutu ile bir bölgesi (ROI) ilgi tanımlamak. Membran görüntü oluşturulan dikdörtgen çerçeve içindeki her band merkezi ve ölçüm Ctrl + M (ölçü komutu) kullanarak tek tek kaydedin.
    4. Aynı YG alan uygulama her grup için bitişik yerel arka plan ölçmek. Ölçüm sonra tek tek her gruptan karşılık gelen yerel arka plan çıkarma.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı 20 değişik-in nereye Phe19 için tüm doğal proteinogenic amino asitler28mutasyona uğrattı Aβ42 peptid topluluğu istihdam edileceğini açıklar. Bu proteinlerin teorik toplama eğilimlerini iki farklı bioinformatic algoritmaları (AGGRESCAN ve TANGO31,32) kullanılarak analiz edilebilir. Her iki durumda da, bu analiz ascribing, genel bir kural olarak, en yüksek değerleri hidrofobik kalıntıları v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok çeşitli hastalıklar misfolded proteinleri birikimi hücresel mevduat6,7,8,33içine bağlıdır. Birçok çabaları rapor protein konsantrasyonları almayın, Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak bu hastalıkların başlangıcı tetiklemek moleküler mekanizmaları çözmeye gelmiş yapılmış veya vitro yaklaşımları, içinde protein konsantrasyonu reaksiyon sırasında sabit kalır. Ancak, hücre içinde prote...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Maya hücreleri BY4741 ATCC201388Genotip: MATa his3 & Delta; 1 leu2 ve Delta; 0 met15 ve Delta; 0 ura3 ve Delta; 0
pESC(-Ura) plazmid Agilent Genomics217454 Gal promotorlu maya ekspresyon plazmiti. Seçilebilir işaretleyici URA3
Maya Sentetik Bırakma Ortamı TakviyeleriSigmaY1501
Amino Asitsiz Toz Maya Azot BazSigmaY0626Toz
RafinozSigmaR7630Toz
GlikozSigmaG7021Toz
GalaktozSigmaG0750Toz
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Fisher ScientificBP3991 Çözüm 10X
CellROX Koyu Kırmızı Reaktif Yaşam TeknolojileriC10422Serbest radikal hücre kaynaklı floresan sensör, indirgenmiş durumdayken floresan değildir ve reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oksidasyon üzerine parlak floresan sergiler, 644/665 nm'de absorpsiyon/emisyon maksimumu ile.
Y-PER protein ekstraksiyon reaktifi Thermo Scientific78990Sıvı hücre lizis tamponu
Akrilamid/Bis-akrilamidSigmaA6050Çözeltisi
Bradford boya reaktifiBio-Rad 5000205Protein konsantrasyonunun tek aşamalı tayini için boya reaktifi
beta; - amiloid antikoru 6E10 &BioLegend803001Fare IgG1. Epitop, beta amiloidin (EFRHDS) 3-8 amino asitleri içinde yer alır.
Keçi anti-fare IgG-HRP konjugat Bio-Rad1721011
Membran İmmobilon-P, PVDFMilliporeIPVH00010
Luminata forteMerkWBLUF0100Önceden karıştırılmış, kullanıma hazır kemilüminesan HRP tespit reaktifi
Fenilmetansülfonil florür çözeltisi (PMSF)Sigma93482Proteaz inhibitörü. Etanol FACS'ta 0.1 M'de çözülürKanto
akış sitometresi BD Biosciences657338488  GFP'nin tespiti için nm mavi lazer ve 635  nm kırmızı lazer / 530/30 nm BP filtre ve 660/20 BP filtre
Mini Trans-Blot Elektroforez Transfer hücresiBio-Rad1703930Protein transfer sistemi
Mini-PROTEAN Tetra El Döküm SistemleriBio-Rad1658000FCElektroforez sistemi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  3. Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
  4. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
  5. Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
  6. Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
  7. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  8. Aguzzi, A., O'Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
  9. Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
  10. Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
  11. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
  12. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
  13. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
  14. Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
  15. Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
  16. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
  17. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast? Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
  18. Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
  19. Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).
  20. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
  21. Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
  22. Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
  23. Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420(2013).
  24. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  25. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
  26. Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
  27. Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. , (2017).
  28. Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
  29. Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
  30. Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
  31. Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65(2007).
  32. Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
  33. Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
  34. Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maya ModeliAk SitometrisiGFP F zyonuA beta 42 PeptidiH cresel Oksidatif HasarProtein nkl zyon Olu umuFloresan MikroskobuKompanzasyon Analizi

İlgili makaleler