Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış

6.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57472

⸱

16 Mayıs 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Bu makalede

Özet

Bazı hastalar için dondurma Yumurtalık dokusunun doğurganlık korunması için tek seçenektir. Ne yazık ki, gecikmiş revaskülarizasyon foliküler canlılığı zayıflatmaktadır. Burada, co için doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış kullanımı olarak birleştiren bir hücre tabanlı strateji perfüzyon biyoaktif moleküllerinin endotel hücreleri ile insan yumurtalık dokusu nakli için bir protokol mevcut.

Özet

İnfertilite, kemoterapi ve/veya radyoterapi ve bazı hastalar sık yan etkisi, yumurta veya embriyo dondurma bir seçenek değil. Alternatif olarak, bu hastalar giderek artan sayıda otogrefti için yumurtalık dokusu cryopreserve için tercih ediyor kurtarma ve remisyon aşağıdaki. Auto-nakli cryopreserved Yumurtalık dokusunun geçiren hastalar arasında istenmeyen sonuçlara gelişmelere rağmen büyük bir engel etkili revaskülarizasyon aşılı doku kalır. İskemi azaltmak ve böylece auto-nakli uygulanan hastalarda sonuçlar geliştirmek için perfüzyon Yumurtalık dokusunun hızlanan bir vasküler hücre tabanlı strateji geliştirdi. Eksojen endotel hücreleri (ExECs) Co nakli için bir yöntem bir fare xenograft model cryopreserved yumurtalık dokusu ile açıklamak. Biz Anti-Mullerian hormon (AMH), yapısal ifade etmek için tasarlanmış böylece sürekli parakrin yumurtalık Greftler için giriş sinyal etkinleştirme ExECs istihdam için bu yaklaşım uzatmak. Foliküler hacmi ve geliştirilmiş antral folikül gelişim ExECs ile ortak ekimi artmış ve saklama deneniyor ilkel köklerinin AMH ifade ExECs terfi. Bu kombine strateji bağlamında foliküler aktivasyonu doğurganlık koruma ve/veya infertilite büyük oransal ve iskemi Azaltıcı için yararlı bir araç olabilir.

Giriş

Kanser gelişmiş dünyada önde gelen ölüm nedenleri arasında kalır, henüz onlarca yıllık araştırma kanser ve bazı durumlarda neredeyse iki katına hayatta kalma oranları1, birçok türü için önemli bir ilerleme vermiştir. Ne yazık ki, kemoterapötik ajanlar gonadotoxic, yumurtalıklarda ilkel köklerinin rezerv tüketen ve doğurganlık2azaltılması çoğu kez. Bu büyüyen nüfusun doğurganlık koruma oosit ve/veya embriyo dondurma da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler yararlanabilir, ancak, kanser tedavisi ve önceden pubertal hastaların istem başlatma gerektiren hastalar için bu seçenekleri geçersiz. Alternatif olarak, bazı hastalarda yumurtalık dokusu onların tedavi rejimi girişmeden önce ve kurtarma ve remisyon, doğurganlık3geri yüklemek için otomatik dikim doku üzerine cryopreserve seçtiniz. Henüz, bugüne kadar greft hayatta kalma ve foliküler çıkış auto-nakli takip nispeten düşük4, ana toprak dolay iden doku iskemi ve hipoksi5,6,7kalır. Yumurtalık kortikal Greftler canlılık geliştirmek için çok sayıda çabalarına rağmen anti-oksidanlar8,9, pro-anjiogenik sitokinler10,11,12,1 kullanarak 5-7 gün pencere sonrası organ nakli 3veya mekanik işlemler14, greft iskemi canlılığı ve greft7yaşama zayıflatmaktadır. Bu sorunu çözmek için ev sahibi ve greft damarlarının anastomoz kolaylaştırmak ve böylece reperfüzyon Yumurtalık dokusunun hızlandırmak için bir hücre tabanlı strateji geliştirdi.

Sonrası organ nakli penceresinde aşılı yumurtalık dokusu için iskemik hakaret yanı sıra arası foliküler sinyal kesintileri havuzu15,16tükenmesi için katkıda bulunabilir. Eksojen endotel hücreleri (ExECs) istikrarlı ve düzgün damarları greft çevre için katkıda çünkü, onlar nakledilen doku tanımlanmış bir moleküler girişine iletmek için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. İlke kanıtı olarak Anti-Mullerian hormon (AMH), foliküler büyüme17kısıtlamak için gösterilen dönüştürme büyüme faktörü beta (TGFβ) üst aile üyesi hızlı süper fizyolojik düzeylere ExECs mühendislik. Karşılaştırma kontrol ve AMH ifade hücreleri ile birlikte nakledilen Greftler foliküler dağıtım biyolojik aktivite ve mühendislik exECs potens doğrular.

Özetle, greft canlılığı ve baskılayarak foliküler Havuzu, erken seferberlik geliştirerek bu yaklaşım doğurganlık koruma uygulanan hastalarda yumurtalık dokusu otomatik nakledilen verimliliğini artırabilirsiniz. Ayrıca, foliküler gelişim karıştığı moleküler düzenleyiciler, deneysel sorgulama ExEC tabanlı platformu sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yordamları hayvan konular içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Weill Cornell Medical College tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık dokusu kullanarak tüm xenotransplantation deneyleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde yapıldı. İnsan yumurtalık dokusu kemoterapi veya radyoterapi kanser tedavisi veya önceden kemik iliği nakli için planlanan hastaların toplanmıştır. Kurumsal inceleme Kurulu (IRB) Komitesi, Weill Cornell Tıp Koleji doku potansiyel Otolog kullanılmak ve hasta Onam yumurtalık doku araştırma kullanım için % 10'a bağış gerçekleştirildi üzerine topluluğu onayladı.

1. insan yumurtalık dokusu topluluğu

Not: bir yumurtalık dokusu bir uzak tesis üretim emrindeki taşınır zaman zaman 5 h18,19geçmemelidir.

  1. Yumurtalık dokusu toplamak ve steril serum fizyolojik Çözümle durulayın.
  2. Yumurtalık Steril bir kapsayıcısına getirin.
  3. Yumurtalık tamamen ortamda batırılır kadar iyi'nın L-15 Orta dökün.
  4. Kapatın ve konteyner mühür.
  5. Buz üzerinde Konteyner Taşıma.

2. Schmidt ve ark. adapte Procured yumurtalık dokusu, işleme 18

  1. Yumurtalık işleme ve dondurma için hazırlıklar
    1. 100 mL orta işleme için hazırlamak: iyi'nın L-15 Orta 99 mL + 1 mL antibiyotik antimycotic çözüm. Medya 0.2 µm filtre kullanarak filtre. Buzdolabında orta tutmak.
    2. 100 mL cryo-koruyucu DMSO kullanarak donma çözeltisi hazırlamak. 10.65 mL (1, 5 mol/L son bir konsantrasyon oluşturmak için) DMSO, 69.64 mL iyi'nın L-15 Orta, 17.66 mL fetal sığır serum (FBS), sukroz (0,1 mol/L son bir konsantrasyon oluşturmak için), 3,42 g ekleyin ve 1 mL antibiyotik antimycotic çözüm. 150 mL filtre ünitesi, 0.2 µm. Store 4 ° C'de orta kullanarak orta filtre
    3. Kaydırılan katı sterilizasyon döngüsü için programlanmış bir otoklav kullanarak cerrahi .aletleri sterilize.
  2. Doku varışta
    1. Steril cerrahi araçlar içinde Biyogüvenlik kabini ayarla: keskin ince kavisli neşter ile bıçak sayı 21, makas ve forseps, çeşitli boyutları: 2 orta boy (yaklaşık 110 mm Uzunluk) ve uzun (yaklaşık 150 mm Uzunluk).
    2. Steril eldiven, Biyogüvenlik kabini kapsayıcıda aç. Yumurtalık alın ve bir 150 mm Petri kabına yerleştirin ve soğuk orta adım 2.1.1 yumurtalık üstüne dehidratasyon Yumurtalık dokusunun önlemek için hazırlanan dökün.
    3. Kalan herhangi bir doku yumurtalıktan yalıtmak ve doku ve kan yoksun kadar soğuk orta ile durulayın.
    4. Yumurtalık bir temiz 150 mm Petri kabına yerleştirin, soğuk ekleyin orta, adım yumurtalık yarısı içinde batık olana 2.1.1 hazırlanmış.
  3. Diseksiyon Yumurtalık dokusunun
    1. Yumurtalık bisect ve medulla ilk eğri iyi makas kullanarak keskin diseksiyon tarafından kaldırın. O zaman medulla, steril neşter bir bıçak ile 21 kullandığı kazı. Kortikal doku 1-1,5 mm kalınlıkta olana koyun.
    2. 2-3 mm genişliğinde slivers içine kortikal doku kesmek, şerit uzunluğu işlendi yumurtalık parça tüm uzunluğu olacaktır.

3. yumurtalık dokusu yavaş dondurma, uyarlama dan Newton ve ark. ve Oktay vd. 6 , 20

  1. Dondurma için hazırlık
    1. Etiket cryovials (1,8 mL).
    2. Her şişe 2.1.2. adımda hazırlanan donma çözüm 1.5 mL ekleyin.
    3. Dondurucu solüsyon içeren kriyojenik şişe başına bir kortikal şerit aktarın.
    4. Dönen bir plaka üzerinde 20 dk için kortikal şerit equilibrate, nazik ajitasyon 4 ° C'de geçerlidir
  2. Yumurtalık dokusunun yavaş dondurma
    1. 0 ° C'de başlayan bir programlanabilir planer dondurucu cryovials yüklemek
    2. 2 ° C/dk-7 ° c serin
    3. Dokular bu sabit sıcaklık 10 dakika tutun.
    4. El ile buz kristal çekirdekleşme indüksiyon için sıvı azot (LN2) dalmış bir pamuk ipucu ile her cryovial dokunarak tohum gerçekleştirin.
    5. Numune sıcaklığı-40 ° c ulaşıncaya kadar 0.3 ° C/dak soğumaya devam
    6. 10 ° C/dk-140 ° C'ye daha hızlı bir oranda serin
    7. Cryovials dewar LN2 depolama için transfer (-196 ° C).

4. (Bilateral ooforektomi ve co nakli) ameliyatları hazırlıkları

  1. Tabak hazırlanması
    1. Yumurtalık dokusu nakli için çözdürme önce bir gün
      1. 50 mm Petri kabına altındaki plastik parafin film bir parça yer, % 70 ile sprey tamamen kaplı kadar etanol.
      2. Petri yemekler gece Biyogüvenlik kabini bırakın. Fare başına 2 Petri yemekler hazırlamak.
    2. Ameliyat gününde
      1. Etanol Biyogüvenlik kabini içinde plastik parafin film içeren Petri kabına dan Aspire edin.
      2. Etanol tamamen buharlaşır kadar Petri kabına kurşun yarı açık bırakın.
      3. Plastik parafin film tamamen kuru olduğunda Petri kabına kapağını kapatın. Biyogüvenlik içinde kabine tutun.
      4. Etiket wells bir 6 de buna göre plaka 0,1 mol/L Sükroz + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L Sükroz + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sukroz, temel çözdürme çözüm (BTS), orta.
  2. Çözümler hazırlanması
    1. BTS 100 mL hazırlamak: iyi'nın L-15 Orta 79 mL + FBS 20 mL + antibiyotik Antimycotic çözüm 1 mL. 0,22 µm filtre sistemi ile filtre.
    2. BTS 10 mL 0,1 mol/L Sükroz ile hazırlayın. 0.342 g Sükroz ölçekli ve 10 mL. adımda 4.2.1, yavaşça Sükroz tamamen eriyene kadar propaganda hazırlanan BTS ekleyin. Filtre kullanarak solüsyonu 0,22 µm.
    3. Tablo 1göre çözümler hazırlamak. Alüminyum folyo ile DMSO içeren tüpler kapsar. Kullanım kadar buzdolabında tutun.

5. yumurtalık dokusu hızlı çözdürme

  1. Take dışarı LN2 dondurulmuş yumurtalık dokusu içeren bir flakon dewar ve 30 oda sıcaklığında tutmak s.
  2. Şişeyi temiz kağıt mendil kullanarak silin.
  3. 1-2 dakika kadar 30 ° C su banyosunda şişe sokmak onun ' içerik çözdürülen.
  4. Şişe açın ve belgili tanımlık ilk eriyik (0,1 mol/L Sükroz + 1 mol/L DMSO, 4.2.3 adımda hazırlanan) 3 ml içeren ilk kuyunun kortikal şerit yerleştirin.
    Not: tüm adımları plaka kapağını açarak içeren laminar akış altında yapılacaktır.
  5. 6 iyi plaka 4 ° C'de 5 min. levha kaplı tutmak için bu adım için alüminyum folyo ile dönen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
  6. Kortikal şerit içine belgili tanımlık ikinci eriyik (0,1 mol/L Sükroz + 0,5 mol/L DMSO, 4.2.3 adımda hazırlanan) ikinci de içeren 3 mL transfer.
  7. Bu adım için alüminyum folyo ile 5 dk. levha kaplı tutmak için 4 ° C'de nazik ajitasyon için dönen bir tabakta 6 iyi plaka kuluçkaya.
  8. Kortikal Şerit 4 mL çözeltisi (0,1 mol/4.2.2 adımda hazırlanan M Sükroz, ile BTS) içeren üçüncü kuyunun içine aktarın.
  9. 5 min için 4 ° C'de nazik ajitasyon için dönen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
  10. Kortikal şerit de içeren 4 mL çözeltisi (BTS, 4.2.1 adımda hazırlanan) dördüncü içine aktarın.
  11. 5 min için 4 ° C'de nazik ajitasyon için dönen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
  12. Kortikal şerit son de içeren 4 mL soğuk orta (2.1.1. adımda hazırlanan) içine aktarın. Buzda çözülmüş yumurtalık dokusu nakli yapmak kadar tutun.

6. Yumurtalık dokusunun kapsülleme

  1. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak
    1. 25 mL % 0,9 serum 20 mmol/L HEPES tampon hazırlayın. Filtre ve mağaza 4 ° C'de
    2. 1 mL CaCl2 1 mol/l filtre konsantrasyonu, hazırlamak ve 4 ° C'de depolayın
  2. Fibrinojen 50 mg/mL stok solüsyon hazırlamak
    1. 37 ° C'de birkaç saat içinde serum fibrinojen 1 g 20 mL % 0,9 serum fibrinojen HEPES yavaş yavaş karıştırma tarafından 20 mmol/L HEPES tampon içine arabelleğe Ekle
    2. 1.7 mL mikro-santrifüj tüpleri etiketleyin.
    3. Çözüm 0,45 µm şırınga filtre ve daha sonra 0.2 µm şırınga filtre filtre.
    4. Aliquot 200 µL mikro-santrifüj tüpü ve mağaza-20 ° C'de çözümde
  3. Trombin 100 U/mL stok solüsyon hazırlamak
    Not: Trombin çözümleri için cam, aliquot plastik tüpler/şişeleri çözümde absorbe.
    1. 2,5 mL % 0,9 steril serum Trombin 250 U ekleyin.
    2. Tamamen erimesi için çözüm kadar nazik sallamak.
    3. 1.7 mL mikro-santrifüj tüpleri etiketleyin.
    4. 0.2 µm şırınga filtre, mikro-santrifüj tüpleri ve-80 ° C'de mağaza içine aliquot 50 µL aracılığıyla filtre
  4. 70 µL, 10 mg/mL fibrinojen ve 5 U/mL Trombin son bir konsantrasyon elde etme, Fibrin pıhtısı olun
    Not: hızlı, çözüm pıhtıları birkaç saniye içinde çalışmaya emin olun. Ayrıca, kabarcıklar karışıma ilavesi kaçının.
    1. Fibrinojen çözeltilerine 1.7 mL mikro-santrifüj tüpü hazırlayın.
      1. 360 eklemek µL 20 mmol/L, HEPES tampon bölünmemeli 200 µL fibrinojen stokunun % 0,9 serum fizyolojik çözüm içinde adım 6.2.4 hazır.
      2. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
      3. Buz üstünde tutun.
    2. Trombin çözeltilerine ikinci bir mikro-santrifüj tüpü hazırlayın.
      1. DMEM 148,7 µL Trombin hisse senedi, bölünmemeli 50 µL için eklemek 6.3.4 adımda hazırlanan.
      2. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
      3. 1 mol/L CaCl21.3 µL ekleyin.
      4. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
      5. Buz üstünde tutun.
    3. Bir tek hücre süspansiyon, üçüncü bir mikro-santrifüj tüpü hazırlayın.
      1. Bir enzim hücre dekolmanı orta kullanarak plaka mühendislik endotel hücrelerinden bağlantısını kesin.
      2. Spin aşağı ve bir hemasitometre bir cam ile kullanarak hücreleri saymak.
      3. Yumurtalık dokusunun her 1 mm2 başına 20.000 hücre kullanın. Mm2Yumurtalık dokusunun 20.000 x alanı hesaplayın.
      4. Mühendislik endotel hücreleri aşağı spin ve temel orta 16.8 µL toplam hacmi ulaşmak için (DMEM) yeniden askıya alma.
      5. Buz üstünde tutun.
    4. Bir kaç saniye için kuru bir steril gazlı bez sünger Yumurtalık dokusunun bir parça yerleştirin.
    5. Yumurtalık dokusu içinde 50 mm Petri kabına plastik parafin film üstünde parça yerleştirin.
    6. 6.4.1.2, adım adım 6.4.3.4, mix nazik pipetting tarafından hazırlanan hücre süspansiyon içine hazırlanan fibrinojen çözümün 39,2 µL ekleyin. Buz üstünde tutun.
    7. 14 µL 6.4.2.4 adımda hazırlanan Trombin çözüm ekleyin. Bir kez pipetting tarafından karışımı yavaşça. Hızlı çalış.
    8. Yumurtalık dokusu, üstüne karışımı yerleştirin damlalıklı bu uzun bir damlacık şeklinde.
    9. 37 ° C'de kuluçka pıhtı ile Petri kabına yerleştirin

7. iki taraflı ooforektomi ve NSG farelere mühendislik endotel hücreleri ile insan Yumurtalık dokusunun co nakli

Not: On 14-hafta-yaşlı kadın NSG fareler21 kullanılmıştır (Jackson Labs).

  1. 2.1.3. adımda özenli olarak tüm cerrahi araçları hazırlamak, tüm dikişler, yastıkları ve cerrahi kasetleri kullanışlı olduğundan emin olun.
  2. Fare ile Isoflurane bir anestezi sistemi kullanılarak anestezi.
    1. İndüksiyon odasında fareyi getirin, kapağını kapatın ve uygun stopcock açın.
    2. Açık akış ölçer 1000 mL/dak için Buharlaştırıcı üzerinde açın ve % 2-3,5 teslim etmek için ayarlayın.
    3. Anestezi etkileri gözlemlemek; bilinç, yavaş ve düzenli nefes kaybı.
    4. Anestezi korumak için burun konisi için transfer. Hayati belirtileri bağlı olarak 1-%3 sunmak için Buharlaştırıcı açın.
    5. Pedal veya kuyruk refleks yokluğu doğrulayın. Refleks varsa, yok olana isoflurane artırın.
  3. Bir elektrikli saç makası kullanarak kalçakemiği satır kadar kuyruk üzerinden fare arka saç kesme.
  4. Fare yüzükoyun cerrahi platformda yerleştirin.
  5. Cerrahi bir bant kullanarak cerrahi platformu için burun konisi düzeltmek.
  6. Fare bacaklarda yavaşça bir 1,25 cm çapındaki cerrahi kâğıt şerit kullanarak cerrahi platformu için teyp.
  7. Steril bir yağlayıcı jöle kullanmak ve bir 1,25 cm geniş delikli plastik cerrahi bant kullanarak cerrahi platforma taping tarafından bir termometre PR Düzeltme termometre yerleştirin.
  8. Cerrahi platformu kuyruğuna 2.5 cm geniş cerrahi kâğıt şerit kullanarak bant.
  9. Isı, kýzýlötesi veya pad, Isıtma sıcak su kullanarak ve fare vücut ısısı prosedürü boyunca izlemek. Vücut sıcaklığı 35-37 ° c aralığında tutmak
  10. Steril Povidone-iyot çözüm çubukla sopayla bölünen alanı temiz ve steril alkol hazırlık kullanarak silin.
  11. 6,9 iki kez daha tekrarlayın.
  12. Steril oküler yağlayıcı veteriner merhem bir damla her fare gözlerini dehidratasyon korumak ve kornea için zarar için üzerine getirin.
  13. Steril cerrahi örtüsü kullanarak fare kapsar.
  14. Buprenorfin (1 mg/Kg) alt Kutanöz (S/C) enjekte.
  15. Boyuna bir medial dorsal kesi neşter (bıçak #21) kullanarak gerçekleştirin.
  16. İki taraflı ooforektomi gerçekleştirmek, dorsal bir yaklaşım kullanın.
    1. Deri altı bağ dokusu tarafından künt diseksiyon makası kullanarak ücretsiz.
    2. Yanal orta hat yapmak bir kesi fasya çimdik ve keskin makas kullanarak Periton boşluğuna ulaşır.
    3. Yumurtalık yağ yastığı ve yumurtalık yavaşça cımbızla al ve karın boşluğu dışarı çekin.
    4. Yumurtalık ve yağ yastığı bir damar kıskacı ile kavramak.
    5. Yumurtalık ve yumurtalık, fallopian tüp distal temelini 4/0 monofilament absorbe dikiş kullanarak yağ yastığı ligate.
    6. Yumurtalık için kravat distal küçük. Güdük tabanından kanama yok emin olun.
    7. Doku karın boşluğuna yerleştirin ve 6/0 örgülü absorbe dikiş kullanarak fasya dikiş.
    8. Aşamaları 7.15.1-7.15.7 kontralateral tarafında yineleyin.
  17. Yumurtalık dokusu co nakli.
    1. Yatay bir kesi fasya Gluteus maksimus pıhtıları Boyutlar uzunluk itibariyle yukarıda gerçekleştirmek. Bu sanal adres alanı içinde bir cep fasya altında makas açarak oluşturun.
    2. Adım 6.4.8 hazırlanırken kapsüllenmiş kortikal doku, bir parçasına almak ve cebinde yerleştirin.
    3. Dikiş 6/0 kullanarak fasya absorbe dikiş örgülü.
  18. Aşamaları 7.16.1-7.16.3 de kontralateral tarafında yineleyin.
  19. 4/0 monofilament absorbe dikiş ile basit kesintiye uğramış dikiş kullanarak dorsal duvar kapatın.
  20. Lidokain enjekte % 0,5 (1.2 mL/Kg) S/C kesi yerinde.
  21. Steril alkol hazırlık cilt temizlemek için kullanın.
  22. İsoflurane süre fare sıcaklık izleme açın.
  23. 1-2 dk O2, Isoflurane olmadan sağlar. Hareket ve bilinç dönmek başlayana kadar üzerinde fareyi ısınma tutmak.
  24. Temiz kurtarma kafese fareyi getirin ve daha sonra tam cerrahi yara iyileşmesi kadar fareyi ayrı bir kafes içinde ev.
  25. Her 8-12 h 24 h için postoperatively gerektiği gibi buprenorfin (1 mg/Kg) S/C enjekte et.
  26. Deney sonunda noktaya kadar tüm gıda, su, yatak ve kafesleri autoclaved, zaman fareler ayrı kafeslerde tutmak. Kafesleri basınçlı havalandırılmış odada tut. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı ne zaman fare işleme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ExECs co nakli hastaların doku bir yarar sağlayıp sağlamadığını belirlemek için çözülmüş yumurtalık kortikal şeritler eşit büyüklükte parçalara bölünmüş ve bilateral IMMUNO şaibeli, NOD scid gama (NSG), fare engrafted. Fibrin pıhtısı yalnız (ECs) ve diğer içeren ExECs (Şekil 1a) gömülü bir tarafı ile her fare kendi kontrolü görev yaptı. ExECs insan göbek bağları ve Adenoviral gen parça E4-ORF1, sonraki tedaviyle yukarıda açıklanan22

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada biz exECs Co o nakli göstermek yumurtalık dokusu canlılık ve xenograft farelerde aşağıdaki işlevi önemli bir yarar sağlar. Yumurtalık dokusu auto-nakli doğurganlık korunmasına ilişkin klinik uygulama için standartlar kümesi ve optimum parametreleri (boyut, nakli sitesi, süresi greft, vb) olmamıştır 32 , 33 , 34 foliküler havuzun gelişmiş kurtarma için tanımsız kalır. Auto-ekimi yapılırken, avasküler çözdürülen ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Michael Ginsberg Angiocrine Biosciences, Inc, San Diego, CA, 92130, izole, E4-ORF-1 ile transfected ve biz kullanılan endotel hücre etiketli ABD, bir çalışandır.

Teşekkürler

Omar Alexander adam resimler için.
Translational bilim merkezi ve bir ASRM grant araştırma ve L.M. Cornell klinik bir Pilot Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Yazar James laboratuvar üyeleri şekilde alt alta yazılmalıdır eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Leibovitz' s L-15 ortaGibco11415064
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240062Anti-Anti X100
SükrozSigmaS 1888
FibrinojenSigmaF 8630sığır plazmasından
TrombinSigmaT 1063insan plazmasından
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzim Hücre Dekolmanı OrtamıInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastik parafin filmiBemis NAParafilm M
Cerrahi kağıt bant 2,5 cm3M1530-1Mikro Gözenekli
Cerrahi Kağıt bant 1,25 cm3M1530-0Mikro Gözenekli
Delikli plastik Cerrahi bant 1,25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Emilebilir SütürCovidienUM-203Biosyn
Örgülü Emilebilir SütürCovidienGL-889Polisorb
Povidon-iyot Çözeltisi USP %10Purdue Ürünleri67618-153-01Betadine Solüsyonu Swab Stick
CryovialesNunc377267CryoTube
steril oküler yağlayıcıDechra17033-211-38Puralube
1.7 ml mikro santrifüj tüpüDenvilleC-2172Eppendorf
Anastezi sistemiVetEquipV-1 süpürücü süpürücü
Endotel hücreleriAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, ABDİzole edilmiş, E4-ORF-1 ile transfekte edilmiş ve etiketli endotel hücreleri
Trikrom boyamaSigmaHT15-1ktTrikrom Leke (Masson)
Kiti İzolektinInvitrogenI32450izolektin GS-IB4 Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor &trade'den; 647 Eşlenik
ile masa üstü sistem

Kaynaklar

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475(2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003(2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162(2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Over Yumurtal k Dokusu E transplantasyonuEndotel H cre M hendisli iFibrin P ht s Olu umuFare Ksenogreft ModeliFolik l Geli im AnaliziParakrin Sinyal letimiskemi Azaltma StratejisiFolik ler Aktivasyon Mod lasyonuKriyoprezerve Doku Canl lAnti M llerian Hormon Ekspresyonu
İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.