Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57482

⸱

5 Mayıs 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

Bu makalede

Özet

Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

Özet

Bu iletişim kuralı geçerli-kelepçe ve gerilim-kelepçe koşullar altında nöromüsküler kavşak üzerinden kayıt sinaptik iletimi için bir teknik anlatılmaktadır. Çünkü bu motor endplate, elektrot kazığa oturtma için nöromüsküler kavşak kolay görselleştirme sağlar bir ince kas levator auris longus (LAL) ex vivo hazırlanması kullanılır. Bu yöntem için kayıt spontan minyatür endplate potansiyelleri ve akımlar (mEPPs ve mEPCs), endplate sinir uyarılmış potansiyeller ve akımlar (EPPs ve EPCs), aynı zamanda motor endplate membran özelliklerini tanır. Bu yöntem elde edilen sonuçları quantal (QC), vezikül yayın siteleri (n) sayısı, vezikül yayın (prel), sinaptik kolaylaştırma ve depresyon yanı sıra kas zarı zaman sabiti (τ olasılığı içerik m) ve giriş direnci. Bu tekniğin uygulamaya fare modelleri insan hastalık hastalığı Birleşik Devletleri anahtar patolojiler vurgulayın ve roman tedavi stratejileri belirlemek. Tam voltaj-tek bir synapse sıkma tarafından bu yöntem bir sinaptik iletimi şu anda mevcut en ayrıntılı analizlerini sağlar.

Giriş

Nöromusküler kavşakta sinaptik iletimi okuyan gergin ve iskelet kas sistemleri arasındaki dinamik ilişki içine anlayışlar sağlar ve sinaptik Fizyoloji incelenmesi için mükemmel bir model. Levator auris longus (LAL) kolayca görüntülenmeyecektir nöromüsküler kavşak için izin veren bir ince kas var. Önceki raporlar sinaptik uyuşturucu ve toksinler incelemek ve iskelet kas fiber türü özellikleri LAL1,2nitelendirmiştir LAL kullanma kolaylığı anlatmıştık. Çok sayıda çalışma LAL nöromüsküler fizyolojisi3,4,5,6,7,8incelemek için kullandık. Elektrofizyoloji için yetenek kolayca LAL nöromüsküler kavşak gözlemlemek için microelectrodes motor endplate, doğru yerleşimini sağlar ve sinaptik iletimi kayıt alanı kelepçe sorunları büyük ölçüde azaltır. Membran zaman sabiti (τm) ve (Riçinde) giriş direnci gibi kas membran özelliklerini geçerli-kelepçe kayıtları kolayca elde edilir. Ayrıca, bu özellikleri kas zarı özellikleri sinaptik işleve doğrudan karşılaştırması için izin nöromuskuler iletim kaydetmek için kullanılan aynı kas liflerinden ölçülebilir. Bu veri analizi birçok nöromüsküler hastalıklar ve Birleşik değişmiş faaliyet fiziksel mekanizmalarının içine anahtar anlayışlar verebilir.

Burada açıklanan tekniği önemli bir yönü olmayan linearities akım-kelepçe içinde karşılaşılan tabi değildir ve kas membran özelliklerini bağımsız sinaptik kayıtları için gerilim tipi kelepçe kullanımıdır. Nöromuskuler iletim incelemek için gerilim-kelepçe akım tipi kelepçe karşı kullanmanın yararları 1950'lerde9çabalarında öncü tarafından kuruldu. Geçerli-kelepçe altında 10-15 mV genlik içinde aşan EPPs mEPP genlik9doğrusal bir ürün değildir. Örneğin, ortalama mEPP 1 mV, bir EPP 5 mV 5 mEPPs 5 (QC); ürün olarak kabul Oysa, bir EPP 40 mV 40'tan fazla mEPPs ürün olacak. Membran potansiyeli ve asetilkolin reseptörü denge potansiyeli arasındaki farktır EPP için sürüş zorlamak için daha büyük EPPs, bu non-lineer oluşur (~ -10 mV), büyük EPPs sırasında önemli ölçüde azaltır. Çünkü kas membran potansiyeli gerilim tipi kelepçe deneyler sırasında değişmiyor bu sorun gerilim tipi kelepçe deneylerde önlenmiş olur. Bir dezavantajı gerilim tipi kelepçe deneyler daha geçerli-kelepçe kayıt tamamlamak teknik olarak daha zor olmasıdır. Bunu aklýnýzda tutarak, Sigara linearities akım tipi kelepçe kayıtları EPPs10hesapları basit bir matematiksel düzeltme McLachlan ve Martin geliştirdi. Düzeltmeleri de11,12,13iş ama önemlisi, kas zarı özellikleri değil kesintiye varsayıyorum.

Kas zarı özellikleri koşulları ya da kas bozabilir hastalık durumlarında eğitim düşünün özellikle önemlidir. Örneğin, Huntington hastalığı R6/2 transgenik modelinden kas iskelet dinlenme klorür ve potasyum akımları14,15hyperexcitable bir progresif azalma nedeniyle olur. Sonuç olarak mEPPs ve EPPs R6/2 iskelet kas güçlendirilmiş. Kesinlikle, Ek etkenler mEPPs ve EPPs değiştirebilir. SNARE-proteinler8' e ilgili gibi görünüyordu EPPs değişiklikleri bulunan farklı bir model Huntington hastalığı fare (R6/1) ile çalışma. Neden değiştirilmiş nöromuskuler iletim mekanizmaları değerlendirmek için gerilim tipi kelepçe kullanarak değiştirilmiş kas zarı özellikleri etkilerini ortadan kaldırmak faydalı olacaktır. Bir son çalışmada, R6/2 nöromuskuler iletim burada açıklanan tekniği kullanarak her iki akım ve gerilim kelepçe koşullar altında incelenmiştir. Motor endplates tamamını gerilim-% 1 hata klempe ile daha az iki microelectrodes endplate16uzunluğu sabit içinde yerleştirerek. Bu gerilim tipi kelepçe gösterildi ve R6/2 kas nöromuskuler iletim zıt ölçümleri vermiştir akım tipi kelepçe kayıtları düzeltti. Bu kas zarı özellikleri üzerinde değişiklik yapılmış Eğer EPPs sigara linearities düzeltmek zor olabileceğini vurgular ve kas membran özelliklerini bağımsız voltaj-kelepçe kayıtlarını edinme yararları göstermektedir. Burada sunulan Protokolü koşulları veya sinaptik iletimi ve postsinaptik membran özelliklerini etkileyen hastalık durumlarında incelenmesi için idealdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Wright Devlet Üniversitesi uygun olarak yapıldı.

1. fare ötenazi

  1. Bir duman başlık, hava geçirmez bir cam odası anesthetizing fareyi getirin.
  2. Fareyi isoflurane (doyurarak veya ~ % 25) ölümcül bir doz için inhalasyon yoluyla ortaya çıkarmak. Nefes gözlenen kadar odasında fareyi bırakın.
  3. Fare odasından kaldırın ve ötenazi, ikincil yöntem olarak yerindençıkmasına servikal gerçekleştirmek.

2. kaldırma saç baş, boyun ve sırt Dorsal yüzeyinden

  1. Bir Elektrikli tıraş makinesi saç baş, boyun ve fare arkasında dorsal yüzeyi çoğunluğu kaldırmak için kullanın. Ayrıca, çevresinde ve sol kulak saç kaldırmak.
    Not: dikkat çekmek ne zaman tıraş kulak çevresindeki deri, deri tıraş bıçakları yakayı ele ve temel kas dokusuna zarar verebilir.
  2. Saç dökücü krem bir pamuk bez ile kalan saç kaldırmak için traş bölgeye uygulanır. Yaklaşık 1 dakika bekleyin ve krem saç kaldırma sıkmak yıkama şişe kullanarak su ile durulayın sonra uzak kalan herhangi bir krem veya pamuklu çubukla kullanarak saç fırça ve cilt kuru pat.

3. deri Levator Auris Longus kas ortaya çıkarmak için kaldırmak

  1. Stereo diseksiyon mikroskop altında fare scapulae düzeyde arkasında küçük bir insizyon attım (Cilt için sadece derin yeterli) olun. Şekil 1A-Bgösterilen yolunu izleyerek mikro diseksiyon makası kullanarak deriyi kesme.
  2. (No 5 gibi) iyi forseps kullanarak, scapulae yakın kesme boyunca cilt kaldırın. Bahar makas kullanılarak, bağ dokusu deri kulak yaklaşırken temel kas dokusundan ayırmak için kesme. Önemlisi, bağ dokusu maruz kalan kas dokusunun yanlışlıkla kesme önlemek için deri içine sivri Bıçaklar ile kesti.
  3. Düzenli olarak maruz kalan kas (mM) oluşur aşağıdaki Na+ dış arabellek gibi bir fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile sıvı: 144 NaCl, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 glikoz, 1 NaH2PO4, pH 7.4 NaOH ile ve bir osmolalite 300 ± 5 mmol/kg vardır. Bir kez cilt tamamen fare kaldırmak ve onu atmak için kulak çevresindeki deri kesilmiş sol kulak için bağ dokusu kesilmiş oldu.
    Not: LAL kulak tabanına verdiği ve cilt kaldırılırken kolayca zarar görebilir. Yaklaşık 1 mm LAL kesme önlemek için kulak tabanı etrafında deri bırakmak iyidir.

4. kaldırma Levator Auris Longus kas ve çevresindeki doku

  1. Hangi omurga arasında scapulae bağlanmak için LAL, aşağı kesim kasları tarafından bahar makas kullanarak başlatın. Sadece orta hat, sağına doğru kürek başlangıç ve orta hat sağ tarafında kalan süre rostral fareyi, sonuna doğru kesti. Devam sonuna kadar kas dokusu sonuna kadar kafatası üzerinde kesme.
    Not: LAL kulak ve orta hat, medial tarafına bağlı en yüzeysel kas Şekil 2' de gösterildiği gibidir. Diğer resimleri, AK Greene17 tarafından bir kitap LAL mükemmel, çizilmiş görüntüleri gösterir.
  2. Forseps orta hat, hemen sağındaki kesme doku kapmak sonra yavaşça kaldırın ve doku sol kulak doğru sol LAL aşağı olan birkaç kat kas kaldırmak için kafatası karşı baskı makas bıçaklı kesme başlamak için kullanın. Tüm geçici olarak yanlışlıkla LAL kaldırma sırasında kesme önlemek için bağlı katmanların bırakın.
  3. Bıçaklar ile paralel olarak kesmek ve belgili tanımlık kulak kanal kaydırılır ve kas kulak medial tarafında girer LAL innervates sinir kesme önlemek için kafatası karşı baskı. Kadar mümkün olduğunca bağlı sinir tutmak belgili tanımlık kulak kanal içinden devam.
    Not: LAL sağlayan sinir uzakta-in yüz sinir dalları ve daha sonra yordamda kullanılacaktır olarak muhafaza edilmelidir.
  4. Şekil 1B adımında kulak ventrolateral kısmı üzerinde gösterilen aynı yol boyunca kulak kanalına geçince mi yağlı doku kes. Ayrıca, sol kürek kemiği kas tamamen fare kaldırmak için sağ tarafta olduğu gibi kesti.

5. Levator Auris Longus kas yalıtım

  1. LAL ve çevresindeki doku, bir konteyner içine yerleştirin. Bir konteyner içinde disseke doku gibi bir petri silikon elastomer alt ile altına tutturulmuş kullanın. Banyo ve doku bir fizyolojik serum çözümde sık sık yıkayın.
  2. Boyunca Bankası için LAL bağlı kulak kıkırdak parçası bırakarak kulak, kulak pinna kesti. Böylece aşağı yüzün (LAL çanak alt) yukarı dönük kas çevir.
  3. Hazırlık tutmak için belgili tanımlık kulak kanal aracılığıyla bir böcek pin gibi bir iğne yerleştirin. O zaman daha küçük iğne, PIN LAL midline karşı tarafta kalan doku kullanarak. Forseps kullanarak, yavaşça deri yan kısmındaki kas germek dışarı ve bir iğne deri yoluyla yerleştirmek için kulak çekin. Şekil 3' te gösterildiği gibi iyi yemek için güvenli dokudur kadar bu adımı yineleyin.
    Not: Küçük diseksiyon pimleri akupunktur iğneleri ipuçları için istenilen uzunluğa kesim tarafından yapılabilir. Bu küçük pin doku hasarı en aza indirmek ve su-daldırma mikroskop objektif uzun çalışma uzaklıkları ile birlikte kullanılabilir.
  4. Begin, kasları (gösterildiği şekil 4) kaldırma bu LAL (auricularis üstün, kaçıran auris longus ve interscutularis) kapsayan ve bu LAL için bağ dokusu ile bağlı ve özellikle dar yakınındaki orta çizgi, No 5 forseps ve bahar makas kullanarak.
  5. Yukarı çekmeye forseps kullanarak örten kas katmandaki bağ dokusu ile varlık makara kas katmanı doğru odaklı bıçaklar ve kesme veya LAL nicking önlemek için dikkat ediniz. Orta çizgi doğru kesme ve orta hat giderken yaklaşık dörtte üçü kesmeyi bırak. Sonra her kas katmanı kaldırmak için orta hat için paralel kesti. Kadar sadece LAL kalır kas tabakaları kaldırma devam et.
  6. Elektrotlar kazığa oturtma içinde AIDS LAL kapsayan kalan bağ dokusu bazılarını kaldırın. Yavaşça No 5 forseps bağ dokusu LAL uzak çekmek ve uzak bahar makas kullanarak kesmek için kullanın. Sadece o kadar kolay sürecinde LAL zarar riski olmadan yapılabilir doku kaldırın. Nöromüsküler kavşak görselleştirme engel LAL alt yüzeyinde kalan aşağı kas tabakaları innervate herhangi bir büyük sinirler kaldırın.

6. sinir yalıtım

  1. Sinir Stimülatörü kullanarak LAL innervates sinir belirle (örneğin, iki Platin teller bağlı bir darbe üreteci); kulak kanalına kaslar için çalışan birkaç sinirler bulunur. Sinirleri bazı akım sağlayan sinir Stimülatörü ile touch (geçerli V 5 civarında değişir). Ne zaman kas sözleşmeleri, doğru sinir olduğu belirlendi.
  2. Dikkatle doku sinir yakınındaki kapmak ve bahar makas sinir kulak çevreleyen dokusundan ayırmak için kullanın. Hasarı en aza indirmek için daha sonra kayıt çanak sinir güvenliğini sağlamak için kullanılan bazı çevreleyen doku gömülü sinir çoğunu tutun.
    Not: LAL innervates motor sinir medial ve açılış belgili tanımlık kulak kanal tarafında bulunur.
  3. İki kutuplu bir uyarıcı elektrot kullanarak, sinir, kas distal bölgenin etrafında sadece çevreleyen doku kaldırın. Emme bir elektrot kullanarak, sinir kesme sonundaki çevreleyen doku kaldırın.
    Not: Bu iyi durdurma noktadır. Bu bir iyi durdurma noktadır. Eğer bir ara disseke LAL hazırlık bir fizyolojik çözüm ya da bir kaç saat zararlı metabolitleri değil birikir sağlamak için sürekli perfüzyon sürdürülebilir. Çözüm ya da sabit perfüzyon büyük miktarda zararlı metabolitleri değil birikir emin olmak için kullanın.
  4. Ardından, çözme ve perfüzyon odasına dik bir bileşik mikroskop altında Elektrofizyoloji deneyler için kas transferi.
    Not: Kullanım ile yumuşak bir alt doku güvenli bir şekilde olabilen bir perfüzyon Odası (şekil 5A) tutturulmuş.
  5. İğne ucunda (kulak ve orta hat) ve kas kenarı boyunca kas. Sinir kas lifleri dikey konumlandırma ve sinir sonunda sağlam kaldı bazı aşırı doku ile çanak dibine pin. Her zaman bir fizyolojik serum çözümde banyo doku tutun.
    Not: Yükseltilmiş malzeme doğrudan altında LAL kas lifleri yuvarlak yararlıdır. Bu ekstra destek elektrot kazığa oturtma AIDS ve yan tarafında yalan bir 50 mL konik tüp döküm silikon elastomer küçük bir bölümünden yapılabilir. Elastomer yuvarlak bölümünü taze silikon az miktarda kullanarak perfüzyon odası altına güvenli. Perfüzyon odası bir diyagram şekil 5B-Cile gösterilir. Kas lifleri (ki çok hidrofobik) yeni oyuncular silikon elastomer için çok sıkı uygun ve daha da zarar görebilir. Ceket için yararlıdır veya blok yeni protein, bir immunoblot engelleme adımına benzer silikon döküm. Bunu engellemek için biz yeni oyuncular silikon sığır serum albümin konsantre bir çözümde gecede inkübe.

7. Elektrofizyoloji ekipman kurulumu

  1. Hazırlamak veya aliquots gibi ışığa duyarlı ve ışıktan uzak muhafaza edilmelidir mitokondrial boya 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, nöromüsküler kavşak görselleştirme yardım etmek için bir boya, buzlarını. Ayrıca, elektrot çözümleri çözme. Girdap tüm solutes çözüm olduğundan emin olmak için tüm aliquots. 1 µM içeren bir fizyolojik serum çözüm hazırlamak µ-Conotoxin GIIIB (μ-CTX) ve 80 µM BTS (isteğe bağlı).
  2. Perfüzyon odası mikroskop sahneye LAL ile güvenli. 3 M agar Köprüsü üzerinden kayıt odası'na bağlı KCl Place referans elektrot bir bardağa dolu. Referans elektrot amfi üreticinin yönergelerini başına bağlayın.
  3. Bu noktada, sinir uyarıcı elektrot sinir üzerinde konumlandırın. De sinir stimülasyonu için çalışırken bir emme elektrot veya küçük bir iki kutuplu elektrot kullanın.
    1. Uyarıcı elektrot gibi kas uyarımı yapı kayıtları sayısını en aza indirmek için mümkün olduğunca uzak getirin.
      Not: Uyarıcı elektrot gerilimi genlik gerektiği gibi kontrol edebilirsiniz bir uyarıcı yalıtım birimi ile kontrol edilmelidir.
  4. Yavaş yavaş kasılmalar gözlenen kadar uyarıcı yalıtım birimi üzerinde gerilim düğmeyi çevirerek gerilim yükseltmek. Hangi ilk daralma gözlenmiştir eşik noktasıdır. Bir kez tanımlanan eşik, gerilim uyarıcı yalıtım birimi üzerinde 1,5 ayarla * eşik (veya deneme tarafından tanımlandığı gibi).
    Not: Şekil 6 dik bir mikroskop ve Bugi manipülatör kullanarak sinir yerleştirilmiş küçük iki kutuplu elektrot altında kurmak kas hazırlık göstermektedir. Hala yeterince eşiğin olurken mümkün uyarılması için en düşük fiyat voltajı için olumlu. Daha düşük bir uyarıcı gerilim kayıtları sırasında stimülasyon yapı sayısını azaltır. Ayrıca, uzak Kas uyarıcı elektrot yerleştirme stimülasyon obje boyutunu azaltır. Bazen sinir Stimülatörü nereye yerleştirileceğini ile deneme gerekli olabilir bu yüzden sinir sonu diseksiyon zarar görür.
  5. Banyo tuzlu çözüm kaldırın ve 5 µM 4-Di-2-Asp ile değiştirin. LAL Hazırlık'a 4-Di-2-Asp nöromüsküler kavşak görüntüleme (Şekil 7) için yeterli Floresans elde etmek 10 min için maruz.
  6. İki elektrot çözümleri, 3 M KCl ve K+ iç çözüm (mM) oluşan 75 aspartat, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodyum, 5 phosphocreatine disodyum, 5 glutatyon, 20 BEZLERİ, 30 EGTA, pH 7.2 KOH ile hazır olun.
    Not: Çözümleri önceden hazırlanmalı; K+ iç çözüm aliquots-20 ° C'de depolanan
  7. Dolgu çekti cam ile 3 M KCl. gerilim algılamalı elektrot için kılcal K+ iç çözüm (hazırlanan adım 7,6) akım geçen elektrot için kullanın; 1 mL şırınga bağlı bir Ametal dar iğne (~ 34 ölçer) kolayca cam kılcal doldurmak için kullanın. Yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için kılcal dokunun; Dolgulu elektroda direnci 10-15 MΩ olduğundan emin olun.
    Not: Kontrol ve veri toplama yazılımı kullanarak her iki elektrot direnç not edin.
  8. 10 dakika sonra normal Ca2 + çözüm 4-Di-Asp Çözümle değişimi.

8. nöromüsküler kavşak Floresans kullanarak tanımlaması

  1. Standart parlak alan ve floresan aydınlatma ile dik bir mikroskop kullanarak, floresan yeşil nöromüsküler kavşak dikey şekil 7Aiçinde gösterildiği gibi hazırlık boyunca kas lifleri için çalışan bir parlak bant arayın. Nöromüsküler kavşak tanımlamak için bir düşük büyütme su-daldırma hedefi (~ 10 X) kullanın
    Not: Mikroskop FITC küp ile donatılmış olmalıdır (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) ve bir LED, lazer, halojen lamba veya civa lamba floresan için. Fotoğrafı beyazlatma, alan parlak ve floresan aydınlatma arasında geçiş yapar en aza indirmek için.
    Not: Bu genellikle daha proksimal orta hat kulağa tabanına grubudur. Grup nöromüsküler kavşak en yoğun olduğu bölgedir.
  2. Daha yüksek bir büyütme su-daldırma amaç (~ 40 X) geçin ve Elektrofizyoloji (şekil 7B) ile incelemek için bir nöromüsküler kavşak kas üst tabakası üzerinde tanımlamak.
  3. Başına üretici yönergelerine uygun headstages pipet tutucular içine doldurulmuş Pipetler güvenli. Yukarıda tanımlanan nöromüsküler kavşak (şekil 7C) 100 µm içinde kas membran elektrotlar yerleştirmek için micromanipulators kullanın. Öncelikle alan parlak mikroskobu kullanılarak elektrotlar yerleştirmek; Floresans elektrotlar nöromüsküler kavşak göreli konumunu doğrulamak için kullanın.
  4. Öncelikle, bir düşük büyütme (~ 10 X) hedefi elektrotlar bulun ve sonra son elektrotlar konumlandırma için daha yüksek bir büyütme (~ 40 X) amaç için geçiş yapmak için kullanın. Elektrotlar kasına bu noktada kazığa oturtmak değil, ilk elektrotlar radyo istasyonu ayarlayın.

9. Aksesuar ve elektrotlar Impaling

  1. Elektrotlar istenen fiber konumlandırılmış bir kez sıfır ve köprü Dengeleme (ya da benzer bir yaklaşım) gerilim algılamalı elektrot ayarlamak ve üretici yönergelerine başına elektrot kapasitans nötralize. Ayrıca, akım geçen elektrot sıfır.
  2. Her iki elektrot lif yüzeyinin aşağı getir. Yavaş yavaş böylece elektrotlar nöromüsküler kavşak ile ilgili olarak odaklı kalır lif aşağı yolda elektrotlar konumunu 8.3 ve 8,4 adımlarda açıklandığı gibi ayarlayın.
  3. Sonra her iki elektrot kas lif yüzeyine temas etmiş, künt akım geçen elektrot ilk kazığa oturtmak. Elektrot kazığa oturtma kolaylaştırmak için buzz (aşırı kapasite tazminat kısa bakliyat), kısa geçerli bakliyat veya hafifçe dokunarak tablo gibi teknikleri kullanın.
    1. Elektrot Impaled gösterir negatif membran potansiyeli tespit kadar bir osiloskop veya osiloskop protokolü veri toplama yazılımı kullanarak olan sinyali, izlemek.
  4. Daha net voltaj algılamalı elektrot Impaled akım geçen elektrot seviyesine kas üzerine bunalıma girmek. Her iki elektrot doğrultusunda bir başka bir kez, akım geçen elektrot ile uygulanan aynı teknikleri kullanarak gerilim algılamalı elektrot kazığa oturtmak.
  5. Başarılı kazığa oturtma, denetleyicinin amplifikatör için kullanarak üzerine sürekli negatif elektrot kazığa oturtma nedeniyle Membran zarar telafi etmek için geçerli geçen elektrot ile güncel tutan bir uygulanır. Hücre-80 doğru yavaş yavaş şarj etmek Başlarken mV, holding olarak geçerli gerekli istenen istirahat için potansiyel cep getirmek için artış (Yani,-80 -85 için mV).
    Not: kayıt gerektiren bir holding liflerinden önlemek geçerli mutlak değerde sağlıksız liflerinden kayıt olasılığını en aza indirmek için-25 nA vahşi tipi kas daha büyük.
  6. Fiber için birkaç dakika istenen dinlenme potansiyel, stabil sonra kas zarı özellikleri veya nöromuskuler iletim kayıt için devam etmek.

10. kayıt postsinaptik membran özellikleri ve sinaptik iletimi

  1. Geçerli-kelepçe kayıtları ile eşit sayıda motor endplate Riçinde ve τmbelirlemek için kullanılan karşılık gelen membran gerilim yanıtları ölçmek için pozitif ve negatif geçerli adımları uygulayarak başlar. Pasif özellikleri sağlamak için kararlı bir duruma ulaşmak ve bir doğrusal gerilim-akım ilişki16,19,20küçük gerilim yanıt kullanın. Kayıt ile bozuk veya sağlıksız Sinir liflerinden önlemek, mEPP frekans böyle lifleri var > 3 Hz.
  2. Sonra iki elektrot gerilimi-kelepçe üretici yönergelerine başına girin. Gerilim Tipi Kelepçe lifler -85 membran potansiyelini, mV. Gerilim Tipi Kelepçe ayarlar mEPCs olarak algılanmasını sağlayan sinyal noise oranları elde etmek.
    Not: Bakımı yeterli gerilim kontrolü bir sorun olabilir. Bu sorunları en aza indirmek için iki yöntem kullanabilirsiniz. İlk olarak, lifler motor endplate 100 µm içinde daha önce açıklandığı gibi bu lifler21uzunluğu sabit içinde olduğu Impaled. İkinci olarak, biz amplifikatör DC geri yükleme özelliğini kullanın. Bu özelliği bir çok yüksek voltaj-kelepçe kazanç ayarlar. Önceki çalışmalarımız bu yöntem ayrıntılı olarak açıklanan ve gerilim klempe endplate16değerlendirmek için bir yöntem sıraladı.
  3. Bir kez kayıt gerilim-kelepçe, sinaptik akımları (mEPCs ve eEPCs) çeşitli sinir stimülasyonu protokolleri kullanarak deneme gereksinimlerini temel alarak.
    1. Kayıt kendiliğinden mEPCs ve bir kayda EPCs sinaptik Modülasyon (kolaylaştırma veya modülasyon) quantal içerik değerlendirmek için olmadan sağlayan bir düşük frekanslı sinir stimülasyonu Protokolü (≤0.5 Hz) kullanarak EPCs. Sinaptik kolaylaştırma veya depresyon değerlendirmek için bir yüksek frekans sinir stimülasyonu Protokolü (50 Hz değerinde 10 bakliyat) kullanın.
    2. Veri toplama yazılımı ile kontrol edilir bir darbe Oluşturucu'yu kullanmamanızı tetiklenebilir bir uyarıcı yalıtım birimi üzerinden istenilen frekansta sinir uyarmak.
  4. Bir kez gerilim tipi kelepçe kayıtları yapılır, amplifikatör bir akım tipi kelepçe ayara dönmek, Bütün akımlar off ve elektrotlar elyaf çıkarın. Elektrotlar değil tıkalı haline onay veya kayıt sırasında temel gerilim içinde drift.
    Not: lif kazığa oturtma önce ayarlanmış olarak drift ile ilgili elektrot gerilimi ekstraselüler çözümünde, 0 volt olmalıdır. Örneğin, kaydedilmiş Gerilim Gerilim deneme sırasında sürüklendi Eğer belirsiz olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 8 geçerli bakliyat (şekil 8A) ve bir LAL fiber akım tipi kelepçe altında gerilim yanıtlarının (şekil 8B) bir 12-hafta-yaşlı vahşi türden R6/2 fare gösterilmektedir. Bu kayıtlar motor endplate alınmıştır mEPPs varlığını gösterir. Kayıtları normal fizyolojik serum çözümde elde edilmiştir. Bu akım tipi kelepçe kayıtları Riçinde ve τm bu lif16,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan hazırlık ve akım veya gerilim kelepçe koşullar altında nöromuskuler iletim ölçümü için fareyi LAL kas kullanımı olduğunu. LAL dissekan için göz önünde bulundurulacak birkaç önemli nokta vardır. Aşırı bağ dokusu kas AIDS olarak elektrot elektrot kazığa oturtma'dan temizlik bağ dokusu onları kazığa oturtma için yerleştirirken pürüzle. Ancak, sadece elinden alınan bağ dokusu kaldırmak kolayca kas zarar verme olasılığını sınırlandırmak için. Çünkü çok hassas sinir yalıtım özenle yapılmalıdır. Sinir hasarı ön...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Dr Mark M. zengin ve Daniel Miranda Editöryel Yorum için Ahmad Khedraki mali destek (A.A.V. için başlangıç Fonu) için bu tekniği ve Wright Devlet Üniversitesi kurmak yardım ettiğin için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Olympus Bileşik MikroskopOlympusBX51WI
10x ObjektifOlympusUMPLFLN10XW
40x ObjektifOlympusLUMPLFLN40XW
Borosilikat CamSutter AletleriBF150-86-7.5
CCD KameraSanta Barbara Enstrümanlar GrubuST-7XMEI
Mater-9 Darbe JeneratörAMPI
Iso-flex Uyaran İzolatörüAMPI
pCLAMP 10 Veri Toplama ve Analiz YazılımıMoleküler Cihazlar1-2500-0180
Konsantrik Bipolar ElektrotFHCCBDSH75
Bilyalı mafsal ManipülatörüNarishige 
Metalik Olmayan Şırıngalar 34 Ayar DünyaHassas AletlerMF34G-5
Nikon StereomikroskopNikonSMZ800N
No. 5 ForsepsGüzel Bilim Araçları
BaharMakası Güzel Bilim Araçları15006-09
No. 2 ForsepsRobozRS-5Q41
Mikrodiseksiyon MakasRobozRS-5912SC
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning2404019862
Epilasyon KremiNair
Grass SD9 StimülatörÇim Tıbbi
Model P-1000 Mikropipet ÇektirmeSutter AletleriP-1000
Axon Digidata 1550 Düşük Gürültülü Veri Şifreleme SistemiMoleküler Cihazlar
Düşük Geçişli Bessell FiltreWarner Instrument Corp.LPF-8
Solak MikromanipülatörSiskiyou Corp.MX1641/45DL
Sağ El MikromanipülatörSiskiyou Corp.MX1641/45DR
Tek Hareket Kontrol CihazıSiskiyou Corp.MC100e
Çapraz Silindirli MikromanipülatörSiskiyou Corp.MX1641RBu, z ekseninin motorize edilmesine izin vermek için Sol ve Sağ elini kullanan mikro manipülatörlerin Z eksenine eklendi. Bu özel kurulum, 4 eksenli motorlu bir mikro manipülatör satın almaktan daha ucuz ve daha az hacimlidir. Ayrıca her iki mikromanipülatörü de tek bir kontrolörle kontrol etmemizi sağlar
BTSToronto Araştırma KimyasallarıB315190
CTXAlomone LabsC-270
dışında tüm kimyasallar Fisher'dan
Şimdi Fisher aracılığıyla sipariş edildi
4-Di-2-Asp Moleküler Problar Moleküler problar alınmıştır.

Kaynaklar

  1. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  2. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  3. Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
  4. Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
  5. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  6. Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67(2016).
  7. Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
  8. Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
  9. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
  10. McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
  11. Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80(2015).
  12. Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
  13. Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
  14. Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
  15. Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
  16. Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
  17. Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
  18. Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
  19. Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
  20. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
  21. Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
  22. Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
  23. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
  24. Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N rom sk ler Kav akElektrofizyolojik Kay tMikroelektrot Bat rmaMinyat r U Plak PotansiyelleriSinir Stim lasyonuSinaptik letimKas EksitabilitesiFizyolojik Tuz zeltisi
Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.