Yöntem makalesi

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

DOI:

10.3791/57486

⸱

16 Mart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LEISHMANIA, hastalığının leishmaniasis, yaşam döngüsü içinde böcek promastigote ve amastigote aşamaları ile omurgalı ana bilgisayarları arasında sırasıyla geçiş yapar. Patojenik leishmaniasis belirtileri çok, son derece ölümcül visseral hastalık formlara infektif tür bağlı olarak benign Kutanöz lezyonlarin üzerinden değişebilir iken tüm LEISHMANIA tür omurgalı aşaması sırasında ana bilgisayar makrofajlar içinde bulunan onların yaşam döngüsü. LEISHMANIA infektivite bu nedenle işgal, hayatta kalmak ve makrofajlar içinde parasitophorous boşluklar (PVs) içinde çoğaltmak için onun yetenek için doğrudan ilgilidir. Böylece, asıl olayın asalağın intracellularly çoğaltmak yeteneği değerlendirmek virülans belirlemek için güvenilir bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Hayvan modelleri kullanarak leishmaniasis geliştirme eğitim zaman alıcı, sıkıcı ve çoğu zaman zor, özellikle pathogenically önemli visseral formlarla. Biz burada makrofajlar (BMMs) kemik iliği elde edilen hücre içi LEISHMANIA gelişiminde izlemek için bir metodoloji açıklayın. İntrasellüler parazit numaraları, 72-96 h enfeksiyonu takip için 24 saat aralıklarla belirlenir. Bu yöntem güvenilir bir tayin edilmesi LEISHMANIA virülans çeşitli genetik faktörlerin etkilerini tanır. Örnek olarak, biz nasıl bozar tek gen silme LEISHMANIA mitokondrial demir taşıyıcı gen (LMIT1) LEISHMANIA amazonensis mutant suşu LMIT1/ΔLmit1 yetenek BMMs içinde büyümeye göstermek, sert bir düşüş vahşi-türüne göre virülans yansıtan. Bu tahlil de ayrı ayrı ana bilgisayar-patojen etkileşim çeşitli faktörler (besin, Reaktif oksijen türleri, vb) etkisi analiz etmek için manipüle edilebilir deneysel koşullar hassas kontrol sağlar. Bu nedenle, uygun yürütme ve miktar BMM enfeksiyon çalışmaların geleneksel hayvan modeli çalışmaları için non-invaziv, hızlı, ekonomik, güvenli ve güvenilir bir alternatif sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis insan hastalıkları protozoon parazit türü LEISHMANIAtarafından neden olduğu geniş bir yelpazede anlamına gelir. Yaklaşık 12 milyon kişi şu anda LEISHMANIA ile dünya çapında bulaşmış ve 350 milyondan fazla risk altındadır. Hastalık patoloji LEISHMANIA türler ve ana faktöre bağlıdır ve belirtiler zararsız kendi kendini iyileştirme deri lezyonları ölümcül visceralizing formları için değişir. Tedavi edilmezse, viseral leishmaniasis ölümcül ise, en ölümcül insan hastalık olarak sıtma sonra sıralama neden olduğu enfeksiyon protozoon parazit1. Hastalık patoloji ve belirtiler geniş kapsamlı görüş farklılıklarına rağmen tüm LEISHMANIA tür bir digenic sırasıyla promastigote ve amastigote aşamaları içinde böcek ve omurgalı ana bilgisayarlar arasında değişen ömrü var. İç omurgalılar, LEISHMANIA ana bilgisayar makrofajlar işgali için hedef ve parasitophorous boşluklar (PVs), nerede son derece öldürücü amastigote formları çoğaltmak asidik bölmeleri ile phagolysosomes özelliklerini oluşumu teşvik. Amastigotes ana bilgisayar dokularda kronik enfeksiyonlar sırasında kalıcı ve bulaşmamış olduğu için ileri sandflies, iletim döngüsü tamamlanıyor geçirilebilir. Bu nedenle, insan hastalığı geliştirme bağlamında, amastigotes en önemli LEISHMANIA yaşam döngüsü formu2vardır. Nasıl amastigotes içinde makrofaj PVs çoğaltmak araştıran ve anlayış LEISHMANIA virülans3,4,5,6,7 için kritik roman etkili tedaviler geliştirilmesi.

Biz burada düzenli olarak LEISHMANIA enfeksiyon ve hücre içi LEISHMANIA sayısı kantitatif değerlendirilmesi zamanla içeren makrofajlar (BMMs), kemik iliği türevi çoğaltmasında çalışmaya bizim laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kemik iliği ve farklılaşma monosit kültür makrofajlar, vitro enfeksiyon infektif formları (metacyclic promastigotes veya amastigotes) ile LEISHMANIA ve miktar, hasat işlemi içerir 72-96 h enfeksiyon sonrasında bir süre için her 24 saat aralıklarla intrasellüler parazit sayısı. Bu tahlil çeşitli çevresel faktörler ve parazit genler daha da footpad tarafından doğrulandı L. amazonensis virülans teşvik demir kritik rol kimliği de dahil olmak üzere, etkisini belirlemek için bizim laboratuvar olarak kullanılmıştır lezyon belirleme çalışmaları, fareler6,8,9,10,11,12,13,-14,15 . Bütün patojenik LEISHMANIA türlerin ana bilgisayar makrofajlar içinde ikileştirici onların niş kurmak, bu tahlil evrensel olarak tüm LEISHMANIA türlerin virülans tespitler için kullanılabilir.

BMM enfeksiyonlar yapmadan tek hücre düzeyinde ana bilgisayar-parazit etkileşimlerin analizi ve böylece nasıl LEISHMANIA parazitler makrofajlar PVs onların tercih edilen ana microenvironment ile etkileşim daha kapsamlı bir anlayış olanağı sağlar. Makrofaj enfeksiyon deneyleri başarılı bir şekilde birden çok grupları16,17,18,19,20,21,22 tarafından keşfetmek için kullanılmıştır işlevleri hem ana bilgisayar makrofaj ve LEISHMANIA belirli genler ve hücre içi enfeksiyon karakterize karmaşık etkileşim potansiyel onların katılımı. Miktar microbicidal nitrik oksit üretimi, Reaktif oksijen türleri nesil ve diğer olumsuz koşullar gibi hücre içi hayatta kalma etkileyen ana faktörler etkisinin bir okuma olarak parazit büyümenin BMM enfeksiyonlar izin içinde lysosome benzeri PVs23karşılaştı. Makrofaj enfeksiyon deneyleri de potansiyel anti-leishmanial uyuşturucu müşteri adayları terapötik geliştirme13,24tanımlamak için kullanılmıştır.

Vitro doğa BMM enfeksiyonların LEISHMANIA virülans değerlendirmek için diğer yöntemleri çeşitli avantajlar sağlar. Ancak, zamanla intrasellüler parazit kurtulma mekanizmaları incelerken birkaç önceki çalışmalarda enfeksiyon oranı20,21,24olarak ölçmek değil. Ayrıca, birçok çalışma zamanla vivo içinde enfeksiyonları takip duruldu kutanöz bir lezyon boyutu ve parazit çoğaltma25,-26 yalnızca dolaylı olarak ilgili diğer fizyolojik belirtiler ölçerek yaptım , 27. vivo içinde enfeksiyon parazit virülans değerlendirmek için sıkı bir yaklaşım olmakla birlikte, lezyon boyut ölçüleri footpad yalnız şişme tabanlı çoğu zaman yetersiz, enfekte dokularda inflamatuar yanıt yansıttıkları gibi değil parazitler mutlak sayısı. Bu nedenle, footpad lezyon geliştirme deneyleri, enfekte dokular, parazit seferdeki miktar tarafından takip edilmesi gerek uzun sınırlayıcı seyreltme gerektiren yordamı28deneyleri. Ayrıca, in vivo genellikle farklı noktalarda birden fazla hayvan dokuları faiz6,8,9,10, ayıklamak için zamanında ödün dahil çalışmaları 11 , 13. buna ek olarak, çok sayıda BMMs bir hayvandan elde edilebilir ve bu hücreler enfeksiyonu değerlendirilmesi çeşitli noktalarda zamanında izin koşullar altında kaplama. Ayrıca, in vivo çalışmalar için karşılaştırıldığında, vitro BMM enfeksiyonlar yapmadan deneysel koşullar üzerinde daha fazla denetim olanağı sağlar. Parazitler kendileri ile birlikte bulaşması için makrofajlar miktarının çokluğu enfeksiyon (MOI) ve kültür koşullardan hassas kontrol sağlar. Bu faktörler üzerinde daha iyi denetim anahtar içinde ayrı hücresel yollar özelliklerinin belirlenmesi ve enfeksiyon sahası üzerindeki etkilerini anlamak olabilir.

Bu avantajları göz önüne alındığında, çok az sayıda gruplar LEISHMANIA virülans eğitim defa makrofajlar hücre içi çoğaltma kantitatif değerlendirilmesi tüm avantajlarından almış biraz şaşırtıcıdır. Bu makalede, biz bu tahlil daha kapsamlı kullanımını engelleyici, ve onun düzgün şekilde uygulanmasını kolaylaştırmak için adım adım bir protokol sağlar ortak tuzaklar tartışıyorlar. Onun hassas ve çok yönlülük göz önüne alındığında, biz burada tarif BMM enfeksiyon tahlil, yalnızca ana bilgisayar-patojen etkileşimleri LEISHMANIA virülans etkileyen keşfetmek için aynı zamanda içinde çoğaltma diğer mikroorganizmalar çalışmaya yararlı olabilir değil makrofajlar29. Önemlisi, bu tahlil anti-leishmanial ilaç geliştirme için hızlı ve ekonomik önceden klinik tarama yöntemi olarak da geliştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel yordamlar bakım ve laboratuvar hayvanları Kullanım Kılavuzu'nda bulunan öneriler doğrultusunda Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yapılmıştır ve University of Maryland'ın IACUC tarafından kabul edildi. 1-4 arası bölümlerde açıklanan tüm adımları aseptik biyolojik Laminer akış kabinleri içinde yapılmalıdır. Kişisel koruma kullanılması gerektiğini ve her deneme aşaması boyunca canlı LEISHMANIA parazitler işlenmesi sırasında dikkat edilmelidir.

1. izolasyon ve kemik iliği türevi makrofajlar (BMMs)8,30,31 farklılaşma

  1. Gün 0: 4 - 6-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 veya BALB/c fare CO2 odasında kurban ve ölüm servikal yerinden çıkması ile onaylayın. Sterilizasyon makas ve forseps onları % 70 etanol batırılmış tutarak emin olun. Eldiven steril kemik iliği hücre izolasyon süreci boyunca işleme izin vermek için % 70 etanol ile sprey.
  2. Onun forelimbs iğneleyerek diseksiyon kuruluna kurban fare güvenli ve bol % 70 etanol ile püskürtülerek dezenfekte.
  3. Kalça eklemi yakınındaki makas ile küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1 cm) olun. Dikkatle makas temel kas ayrı ve Kalça eklemi çevresindeki tüm yol deriyi kesme deri altına yerleştirin.
    Not: Diseksiyon kurulu Kalça eklemi geliştirilmiş erişmesine izin vermek için döndürülmüş.
  4. Dikkatli bir şekilde bacak deri ayak bileği doğru çekerek derisini soymak ve kaldırın. Veya ayak bileği altında tibia tam olduğu gibi bırakma ortak kesmek çok dikkatli olmanın ayak bileği, ayak kesilmiş.
    Not: Bu aşamada fibula gevşek bağlı olduğu ve Forseps ile kolayca ayrılabilir.
  5. El ile Kalça eklemi döndürme noktası tanımlamak için uyluk manipüle ederek bulun. Dikkatle makas proksimal femur başında olduğu gibi bırakma ve Kalça eklemi yukarıda bacak sever için kullanın.
  6. Mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu bacak makasla kaldırın. Ayak bileği ve herhangi bir aşırı kemik malzeme ve Kalça eklemi yukarıda kalan herhangi bir cilt kaldırın.
  7. Temizlenmiş bacak kemikleri steril RPMI penisilin/streptomisin (%1 son konsantrasyonu) içinde bir petri buz ile takıma yerleştirin.
  8. 1.4 1.6 tibia ve uyluk arka diğer bacak dan izole etmek için aracılığıyla adımları yineleyin.
  9. Kalan kas ve bağ dokusu RPMI sterilize forseps ve steril #10 bıçak kullanarak iliklerine kemik kaldırın.
  10. Kemikler Petri kabına kapağını yerleştirin. Tibia dikkatle iliği erişmek için hemen ayak bileği eklemi yukarıda bıçak ile kesin. Tibia bacak kalan kısmından hemen altında diz eklemi keserek çıkarın.
  11. 10 mL steril RPMI 10 mL şırınga penisilin/streptomisin (%1 son konsantrasyonu) ile desteklenmiş ve 25 G iğne takmak çizin.
  12. Tibia sıkıca Forseps ile dikey olarak 50 mL konik tüp buz üzerinde tutun. Şırıngayı yavaşça yaklaşık 5 mL RPMI konik tüp içine diğer ucunu kemik iliğini temizlemek için kemik sonu içine enjekte etmek için kullanın. Beyaz kemik yaşına gelene kadar 10 mL RPMI sayısı ile kemik iliği sifonu çek.
    Not: ayrıntılı kızarma sonra kemik beyaz açmalısınız. Değilse, iliği kaldırmak için temizlemeye devam edin. Distal tibia sonuna iğne eklemek için çok dar ise geri bıçakla kesilmiş olabilir gerekir.
  13. Uyluk kemiği hemen diz eklemi üzerinde ve hemen altında her iki ucunda da kemik iliği erişmek için ortaya çıkarmak için Kalça eklemi kesti. Kemik iliği uyluk 10 mL RPMI tibia olarak aynı şekilde toplam üzerinden sifonu çek.
  14. Temizlik ve adımları 1.6 1,13 kalan kemikleri aracılığıyla kızarma yineleyin ve bir tek 50 mL konik tüp temizlenen kemik iliği hücrelerinde toplamak
    Not: bir kemik kemik kızarma önce diseksiyon sırasında herhangi bir noktada kırılırsa, bu kemik iliği kullanmayın.
  15. Santrifüj kemik iliği toplamak için kullanılan konik tüp 300 x g de 4 ° C'de 10 dakika için tüm dört kemik üzerinden atıp sifonu çektim.
  16. 60 mL steril BMM orta yerleştirin (RPMI % 20 son bir konsantrasyon ile FBS, % 1 penisilin/streptomisin, 1,2 mM Na-pyruvate, 25 µg/mL insan M-CSF) filtre kapağı ile 175 cm2 hücre kültür şişesi içine.
  17. Süpernatant aşağıdaki Santrifüjü atın ve hücre Pelet hafif yukarı ve aşağı BMM orta 5 mL balonun kullanarak pipetting tarafından resuspend.
  18. Hücre süspansiyon kültür şişeye aktarmak ve BMM orta ile iki kez konik tüp maksimal hücre kurtarma sağlamak için kültür balonun durulayın. Hücre süspansiyon orta iyice karıştırılır emin olun ve bir ikinci 175 cm2 hücre kültür şişesi filtre kapağı ile ilk 175 cm2 hücre kültür balonun üzerinden 30 mL dağıtmak.
  19. Her gece 37 ° c, % 5 CO2 herhangi bir bulaşıcı fibroblastlar, ikamet makrofajlar ve diğer yapışık hücreleri ayrılması izin vermek için 30 mL hücre süspansiyon içeren her iki şişe kuluçkaya.
  20. 1. gün: Farklılaşmamış kemik iliği hücrelerinden şişeler 100 mm x 15 mm TC tedavi polistren Petri yemekler yaklaşık 10 mL içeren süpernatant transfer/çanağı ve 37 ° C, % 5 CO2. kuluçkaya Şişeler atmak.
  21. Günde 3 ya da 4: (37 ° C için önceden ısındı) bir ek 5 mL BMM orta her Petri kabına ekleyin ve kuluçka 37 ° C, % 5 CO2devam edin.

2. kaplama BMMs üzerinde Coverslips enfeksiyonu (7 veya 8 gün)

  1. 6-iyi doku kültürü plakaları dört (4) steril 12 mm cam coverslips (autoclaved ve bir kapalı cam kap içinde saklı) her boş dibinde de koyarak hazırlamak.
    Not: her steril 12 mm coverslip bir vakum hattına monte alıyorum bir ipucu ile al. Coverslips vakum böldüğüm için tüp pinching tarafından istenen konumda bırakmadan örtüşme olmadan kuyu içine koyun.
  2. Petri yemekler yapisan kemik iliği aspiratı ile kaplı aspiratı medya (ve herhangi bir yapışık olmayan hücreleri) makrofajlar elde ve yavaşça durulama yapışık hücreleri 2 x ile steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz olmadan önceden ısınmış kalsiyum ve magnezyum klorür (PBS- /) 37 ° C'ye
  3. Dropwise, 5 mL steril 1 x PBS- / - 1 mM EDTA her Petri kabına için son bir konsantrasyon ile ekleyin ve 37 ° C'de yapışık BMMs. doğrula hücreleri bir mikroskop kullanarak ayrılır ayırmak için 5 min için kuluçkaya.
  4. 1 x PBS- / - 50 mL konik tüp içinde 1 mM EDTA ile takıma içinde tüm müstakil hücreleri toplamak. Durulama her 2 x 5 mL- / - PBS ile çanak ve hücre süspansiyon havuzuna ekleme.
    Not: Hücre süspansiyon seyreltilmiş ek PBS ile- / - makrofajlar EDTA toksisite toplama işlemi sırasında korumak için.
  5. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g, santrifüj Süpernatant atın ve makrofajlar tarafından pipetting 5-10 mL BMM ortamda resuspend. Yer hücreleri tüpler ve topaklanma eki önlemek için buz üzerinde resuspended.
  6. Hücrelerin içinde hemasitometre Trypan mavi dışlama kullanarak say.
    Not: 5 mL ortamda resuspended BMM hücreleri saymak için 25 µL hücre süspansiyon 445 µL PBS- / - ve 30 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm karışımı seyreltme genellikle kolay miktar (son hesaplama için bir 20 x seyreltme faktörü dikkate alarak bir hemasitometre verir ). Bu Trypan ile mavi (hücrelerin) değil hücreleri saymak. Bu karışım çok konsantre veya seyreltilmiş hücre süspansiyon hacmi değişmiş olabilir. Genel olarak, BMM verim hazırlık başına 2 x 107 ve 5 x 107 hücreleri tek bir fare arasında değişmektedir.
  7. BMM orta istenilen kaplama konsantrasyonu (5 x 105/mL), hücre süspansiyon hazırlamak ve böylece her şey 1 x 106 makrofajlar alır 2 mL orta iyi başına 6 iyi levha için süspansiyon dağıttı.
    Not: Bu makrofajlar coverslips aynı şekilde karşılamak için yeterli sayıda her şey gets sağlayan kritik bir adımdır. Coverslips Wells değil örtüşen veya ortamda yüzer kontrol edin. Eğer öyleyse, yavaşça bir steril pipet ucu ile ayarlayın.
  8. Gecede 37 ° C, % 5 CO2kuluçkaya.

3. infektif formları L. amazonensis arınma

Not: enfeksiyonlar - sabit promastigote kültürler8,13metacyclic promastigotes arındırmak veya kültür promastigotes standart L. amazonensis kullanarak amastigote forma ayırt etmek için LEISHMANIA hazırlamak axenic farklılaşma protokolü6,8.

  1. LEISHMANIA metacyclic promastigotes arıtma yoğunluk gradient media(Materials) kullanarak 33
    1. % 40 hisse senedi çözüm steril, endotoksin ücretsiz su yoğunluğu degrade ortam hazırlamak.
    2. M199 orta %10 konsantrasyon hazırlamak için (olmadan serum) 10 x M199 Orta yoğunluk degrade çözümde sulandırmak.
    3. Tüm çözümler 0,22 µm filtreden filtre.
      Not: Stok çözümleri, 4 oC için artık karanlıkta 1 ay daha saklanabilir.
    4. 2 mL % 40 yoğunluk gradient medya çözeltisi 15 mL konik santrifüj tüpü dibine ekleyin.
    5. 2 mL % 10 yoğunluk degrade medya çözeltisi M199 içinde % 40 yoğunluk gradient medya katman üzerine dikkatli bir şekilde, herhangi bir iki kat arasında karıştırma önlemek için bir Pasteur pipet kullanarak katman.
    6. 1 x 109 parazitler tarafından Santrifüjü 1.900 x g 10 min için de sabit fazlı kültüründen toplamak.
    7. Hücrelerin içinde 6 mL Dulbecco'nın değişiklik gerekli orta (DMEM) resuspend.
    8. Katman hücre süspansiyon doğrudan degrade medya katman, yavaşça, Pasteur pipet katmanlar arasında karıştırma önlemek için kullanarak % 10 yoğunluğu üzerine 2 mL.
    9. Degrade için 1.300 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
      Not: LEISHMANIA türler arasında fiziksel özelliklerindeki farklılıklar nedeniyle Santrifüjü koşulları her biri için biraz maksimum verim sağlamak için ayarlanması gerekebilir.
    10. Parazitler (metacyclic promastigote formunda zenginleştirilmiş) üst % 10 yoğunluk gradient medya sınır (%0 ve % 10 yoğunluk gradient medya katmanlar arasında arayüz), kurulan grubu toplamak.
    11. Parazitler DMEM bir hacmi ile sulandırmak ve Santrifüjü (oda sıcaklığında 10 dakika için 1.900 x g) tarafından toplamak.
    12. 500 µL DMEM ortamda resuspend ve bir hemasitometre verim ölçmek için say.
  2. L. amazonensis amastigotes axenic kültür koşullar altında nesil (düşük pH / yüksek sıcaklık)6,8,13
    1. Log fazı promastigote kültür (pH 7.4 26 oC de) Mix 5 mL amastigote orta (pH 4.5), eşit bir hacmi ile 25 cm2 şişeler (Toplam 10 mL orta) kullanarak ve 26 ° C'de gecede kuluçkaya.
    2. Şişeye 26 ° C'den 32 ° C'ye vardiya.
    3. Kültür 1:5 amastigote medya 32 ° C'de 3-4 gün sonra bölünmüş
    4. Parazitler önümüzdeki 3-4 enfeksiyonlar kullanıma hazır olup olmadıklarını görmek için gün (en fazla 7 gün) iade edin.
      Not: Sağlıklı axenic amastigotes görünür kamçı olmadan bir oval şekil olmalıdır. Kısmen farklılaşmış amastigotes kısa kamçı ile büyük bir oval şekil var. Kültür kümeleri çok olmamalıdır - birçok kümeleri sigara-parazitler ölüyor, büyüyen bir göstergesi. Amastigote kültür 1:5 bölünmüş ve en fazla 2 hafta için saklanır.

4. L. amazonensis enfeksiyonla

  1. Parazit süspansiyonlar göre istenilen MOI (genellikle 3-5 metacyclic promastigotes makrofaj [MOI 1:3 veya 1:5] başına) ve 1 amastigote makrofaj [MOI 1:1] başına oranında seyreltin. LEISHMANIA PBS- / - 50-100 µL hacmine zaten 2 mL orta içeren her şey ekleyin.
  2. BMMs ile amastigotes ve metacyclic promastigotes, 34 oC enfeksiyonu ile 3 h 1 h için kuluçkaya.
    Not: Optimum enfeksiyon sıcaklık türün farklılık gösterebilir.
  3. Kuluçka, takip iyice silsin- / - ücretsiz parazitler her şey 3 x 2 mL PBS ile önceden 37 ° C'ye ısıtılmış
    Not: hafifçe coverslips üst üste float değil emin olmak için PBS dağıtmak. Yavaşça plaka girdap ve sıvı Aspire edin. Ayrı alıyorum ipucu birden fazla suşları parazitler ve Çapraz bulaşma kaçınmak için kullanıyorsanız kullanın.
  4. 1 h veya 3 h her kuluçka süresi-noktası örnekleri düzeltmek de ile 1.5-2 mL % 2 PFA PBS- / - 10 dakika süreyle yıkayın PBS- / - 3 x. Son yıkama Aspire edin ve boyama kadar PBS coverslips içeren plakaları soğutmak değil.
  5. Daha fazla zaman-puan için her şey plakaları 2 mL taze BMM orta eklemek ve 34 ° C'de kuluçkaya
  6. Düzeltme kalan zaman-Puan istediğiniz gibi açıklandığı gibi 4.3 adım ve tabak boyama kadar buzdolabında bekletin.

5. DAPI boyama ve Coverslip montajı

  1. PBS coverslips içeren kuyulardan Aspire edin ve 1,5 mL PBS- / - %0,1 non-iyonik deterjan ile ekleyin. 3 x yıkama tarafından ile 2 mL PBS- / - takip oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  2. 1 mL PBS- / - 2 µg/mL (5 mg/mL stok çözümden suda seyreltilmiş) DAPI olarak coverslips içeren wells ekleyin ve başka bir 1 saat oda sıcaklığında için kuluçkaya.
    Not: DAPI kuluçka zamanla hücre içi LEISHMANIA parazitler doğru görselleştirme için önemlidir. Makrofaj hücre çekirdeği hızla leke, onların daha büyük boyutta ve DNA nedeniyle içerik ancak intrasellüler parazit çekirdekleri boyama daha yavaş. Böylece, kuluçka zaman ne BMM çekirdeği görselleştirmek için gereklidir ötesinde genişletme DAPI üzerinden nüfuz ve parazit plazma zarı ve parazit nükleer membran izin vermek gereklidir. Uygun DAPI leke ile parazit kamçılı cep yakınındaki DNA Mitokondrial kinetoplast Ayrıca, nükleer DNA ek olarak görüntülenmeyecektir.
  3. Her şey coverslips 3 içeren yıkama x 2 mL PBS- / - ve sonra Asansör ile ve hücre yan yerleştirin ve cam mikroskobunun monte Forseps ile fiske vurmak coverslips slaytlar ile piyasada bulunan antifade montaj reaktif.
    Not: Coverslips son derece kırılgan ve dikkatli işleme gerekir. Basınç onları, özellikle ne zaman kaldırma wells kenarındaki karşı koyarak kaçının. PBS- / - birkaç damla ekleme coverslip ve iyi arasındaki yüzey gerilimini azaltır ve kaldırma işlemini kolaylaştırır. İyi ölçer iğneyle kuyu dibinden coverslips meraklı yardımcı olmak için kullanılabilir. Slayt üzerinde bir coverslip koyduktan sonra yavaşça aşağı Forseps ile montaj medya herhangi bir hava kabarcıkları dışarı itmek için tuşuna basın. Bir coverslip bozuldu veya muhtemelen kaldırma işlemi sırasında saygısız, yeniden bağlayın değil; Sadece yedek dördüncü coverslip kullanın.
  4. Slaytlar miktar kadar buzdolabında bekletin.

6. enfeksiyon miktar

  1. Daldırma yağ ile 100 X objektif lens kullanarak makrofajlar üzerinde odaklanarak DAPI lekeli slaytları floresan mikroskop altında incelemek (358, uyarma nm; 461, en iyi emisyon nm).
    Odak makrofajlar cam slayt ve coverslip arasında tabakası açık olduğundan emin olun.
  2. Makrofajlar (büyük çekirdekler DAPI ile lekeli) sayısını ve her makrofaj çekirdeği kümelenmiş daha küçük amastigote çekirdeği sayısını ölçmek (bkz. şekil 2A, DAPI) görüş her alan için el ile bir sayaç kullanarak.
    Not: Amastigote çekirdeği tüm odak kendi küçük boyutu nedeniyle bir düzlemde görünür olabilir. Makrofaj hücre çekirdeği üzerinde odaklanmış zaman görünür olan saymak ve iyi odak parazit çekirdeklerin üstünde ve altında makrofaj hücre çekirdeği uçaklarda denetlemek için kullanın.
  3. Başka bir görme alanı için miktar tekrarlamak için hareket ettirin. Ayrı counter anahtar sayılan alanların sayısını izlemek için kullanın. Hareket ile visual alanlar paralel satırlardaki her coverslip arasında önlemek için örtüşme sayma.
  4. Coverslip başına 200 makrofajlar en az ölçmek. Her zaman noktası nüsha (3 coverslips) enfeksiyon ölçmek. Bir önceki sayımı nedeniyle coverslip örtüşme, zavallı montaj, cam kırılması, vb için uygun değilse dördüncü coverslip saymak
    Not: 200 makrofajlar herhangi bir bir coverslip sayılır, yedek lastik dördüncü saymak.
  5. Enfeksiyon oranları amastigotes/makrofaj veya amastigotes/100 makrofaj olarak hesaplamak ve ham miktar verilerden yüzde virüslü makrofajlar belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LEISHMANIA iki infektif - procyclic promastigotes kültür durağan faz ayırt metacyclic promastigotes ve hücre içi aşamaları (şekil 1) amastigotes vardır. L. amazonensisgibi bazı LEISHMANIA türler içinde amastigotes da axenic kültürü promastigote daha düşük pH (4.5) ve yüksek sıcaklık (32 ° C), koşullar BMM PVs içinde bulunan hücrelere ilerletmeniz ayrıştırılan 8 , 34. sadece ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan BMM enfeksiyon tahlil tarafından üretilen Nicel veri sağlar müfettişler enfeksiyon oranları ve güvenilir belirlenmesi virülans yapılan değişikliği (en fazla 2 2 ile karşılaştırıldığında hafta, nispeten daha kısa bir zaman dilimi içinde elde etmek için ay) içinde vivo deneyler için gerekli. Bu yöntem DNA belirli boya DAPI, özellikle makrofaj ve parazit çekirdeği lekeleri ve hızlı kimlik ve enfekte hücreleri miktar sağlayan dayanır. Buna karşılık, Giemsa gibi diğer lekeleri farklı hücresel bileş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek,

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Ulusal Sağlık hibe RO1 AI067979 NWA Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
YK Lisans Bursu dan Howard Hughes tıp Enstitüsü/üniversite Maryland College Park, alıcı olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 kuyulu hücre kültürü plakasıCellstar657160
AdeninAcros OrganicsAC147440250
Aerosol Bariyer Pipet Uçları (100-1000 & mu; L)Fisherbrand02-707-404
Aerosol Bariyer Pipet Uçları (20-200 & mu; L)Fisherbrand02-707-430
Aerosol Bariyer Pipet Uçları (2-20 μ L)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Kaburga Sırtlı Karbon Çelik Cerrahi Bıçak # 10Aspen Cerrahi371110
BD Luer-Lok Ucu 10 mL ŞırıngaBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide İğne, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Hücre Kültürü Kabı 35 mm x 10 mmCellstar627 160
Hücre Kültürü ŞişesiCellstar660175
Kapak Gözlükleri: 12 mm dairelerFisherbrand12-545-80
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)InvitrogenD1306
D-BiotinJT BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Etil alkol 200 kanıtPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm TC ile işlem görmemiş polistiren Petri kabıCorning351029
Fetal Sığır SerumuSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Floresan MikroskobuNikonE200
Keçi anti-fare IgG Texas kırmızıInvitrogenT-862
Keçi anti-tavşan IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Kimya Sanayi A.Ş. LTDH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II SeyrelticiBeckman Coulter
L-Glutaminİkizler400-106
Orta 199 (10X)Gibco11825-015
Na piruvat (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldehitAlfa Aesar43368
Penisilin / Streptomisinİkizler400-109
Fosfat Tamponlu Salin (-/-)ThermoFisher14200166
Polipropilen konik Santrifüj Tüpleri 15 mLCellstar188 271
Polipropilen konik Santrifüj Tüpleri 50 mLCellstar227 261
ProLong Altın antifade reaktifiThermoFisherP36930
Sıçan anti-fare Lambası-1 antikoruGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası1D4B
Rekombinant İnsan M-CSFPeproTech300-25
Reichert Parlak Çizgi  Hemositometre ve nbsp;Hausser Scientific1492
RPMI Orta 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 Yüzey AktifMadde Kırlangıç SigmaTX1568-1
Tripan MaviSigma AldrichT8154
Hassas Makas, 4 1/2"VWR82027-582
Diseksiyon Forsepsleri, İnce UçVWR82027-386
Mikroskop SlaytlarıVWR16004-368
Z1 Coulter Parçacık Sayacı, Çift EşikliBeckman Coulter6605699
8546719

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888(2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340(2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901(2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804(2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022(2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084(2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671(2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12(2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Leishmania Vir lansKemik li i K kenli MakrofajlarParazit KantifikasyonuMitokondriyal Demir Ta y cFloresan MikroskobuDAPI BoyamaParazitofor VakuollerAmastigot ekirdekleriKonak Patojen Etkile imi

İlgili makaleler