Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu
Bu makalede
Özet
Özet
LEISHMANIA, hastalığının leishmaniasis, yaşam döngüsü içinde böcek promastigote ve amastigote aşamaları ile omurgalı ana bilgisayarları arasında sırasıyla geçiş yapar. Patojenik leishmaniasis belirtileri çok, son derece ölümcül visseral hastalık formlara infektif tür bağlı olarak benign Kutanöz lezyonlarin üzerinden değişebilir iken tüm LEISHMANIA tür omurgalı aşaması sırasında ana bilgisayar makrofajlar içinde bulunan onların yaşam döngüsü. LEISHMANIA infektivite bu nedenle işgal, hayatta kalmak ve makrofajlar içinde parasitophorous boşluklar (PVs) içinde çoğaltmak için onun yetenek için doğrudan ilgilidir. Böylece, asıl olayın asalağın intracellularly çoğaltmak yeteneği değerlendirmek virülans belirlemek için güvenilir bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Hayvan modelleri kullanarak leishmaniasis geliştirme eğitim zaman alıcı, sıkıcı ve çoğu zaman zor, özellikle pathogenically önemli visseral formlarla. Biz burada makrofajlar (BMMs) kemik iliği elde edilen hücre içi LEISHMANIA gelişiminde izlemek için bir metodoloji açıklayın. İntrasellüler parazit numaraları, 72-96 h enfeksiyonu takip için 24 saat aralıklarla belirlenir. Bu yöntem güvenilir bir tayin edilmesi LEISHMANIA virülans çeşitli genetik faktörlerin etkilerini tanır. Örnek olarak, biz nasıl bozar tek gen silme LEISHMANIA mitokondrial demir taşıyıcı gen (LMIT1) LEISHMANIA amazonensis mutant suşu LMIT1/ΔLmit1 yetenek BMMs içinde büyümeye göstermek, sert bir düşüş vahşi-türüne göre virülans yansıtan. Bu tahlil de ayrı ayrı ana bilgisayar-patojen etkileşim çeşitli faktörler (besin, Reaktif oksijen türleri, vb) etkisi analiz etmek için manipüle edilebilir deneysel koşullar hassas kontrol sağlar. Bu nedenle, uygun yürütme ve miktar BMM enfeksiyon çalışmaların geleneksel hayvan modeli çalışmaları için non-invaziv, hızlı, ekonomik, güvenli ve güvenilir bir alternatif sağlar.
Giriş
Leishmaniasis insan hastalıkları protozoon parazit türü LEISHMANIAtarafından neden olduğu geniş bir yelpazede anlamına gelir. Yaklaşık 12 milyon kişi şu anda LEISHMANIA ile dünya çapında bulaşmış ve 350 milyondan fazla risk altındadır. Hastalık patoloji LEISHMANIA türler ve ana faktöre bağlıdır ve belirtiler zararsız kendi kendini iyileştirme deri lezyonları ölümcül visceralizing formları için değişir. Tedavi edilmezse, viseral leishmaniasis ölümcül ise, en ölümcül insan hastalık olarak sıtma sonra sıralama neden olduğu enfeksiyon protozoon parazit1. Hastalık patoloji ve belirtiler geniş kapsamlı görüş farklılıklarına....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneysel yordamlar bakım ve laboratuvar hayvanları Kullanım Kılavuzu'nda bulunan öneriler doğrultusunda Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yapılmıştır ve University of Maryland'ın IACUC tarafından kabul edildi. 1-4 arası bölümlerde açıklanan tüm adımları aseptik biyolojik Laminer akış kabinleri içinde yapılmalıdır. Kişisel koruma kullanılması gerektiğini ve her deneme aşaması boyunca canlı LEISHMANIA parazitler işlenmesi sırasında dikkat edilmelidir.
1. izolasyon ve kemik iliği türevi makrofajlar (BMMs)8,30,31 farklılaşma
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
LEISHMANIA iki infektif - procyclic promastigotes kültür durağan faz ayırt metacyclic promastigotes ve hücre içi aşamaları (şekil 1) amastigotes vardır. L. amazonensisgibi bazı LEISHMANIA türler içinde amastigotes da axenic kültürü promastigote daha düşük pH (4.5) ve yüksek sıcaklık (32 ° C), koşullar BMM PVs içinde bulunan hücrelere ilerletmeniz ayrıştırılan 8 , 34. sadece .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda açıklanan BMM enfeksiyon tahlil tarafından üretilen Nicel veri sağlar müfettişler enfeksiyon oranları ve güvenilir belirlenmesi virülans yapılan değişikliği (en fazla 2 2 ile karşılaştırıldığında hafta, nispeten daha kısa bir zaman dilimi içinde elde etmek için ay) içinde vivo deneyler için gerekli. Bu yöntem DNA belirli boya DAPI, özellikle makrofaj ve parazit çekirdeği lekeleri ve hızlı kimlik ve enfekte hücreleri miktar sağlayan dayanır. Buna karşılık, Giemsa gibi diğer lekeleri farklı hücresel bileş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek,
Teşekkürler
Bu eser Ulusal Sağlık hibe RO1 AI067979 NWA Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
YK Lisans Bursu dan Howard Hughes tıp Enstitüsü/üniversite Maryland College Park, alıcı olduğunu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6 kuyulu hücre kültürü plakası | Cellstar | 657160 | |
| Adenin | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Bariyer Pipet Uçları (100-1000 & mu; L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Bariyer Pipet Uçları (20-200 & mu; L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Bariyer Pipet Uçları (2-20 μ L) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Kaburga Sırtlı Karbon Çelik Cerrahi Bıçak # 10 | Aspen Cerrahi | 371110 | |
| BD Luer-Lok Ucu 10 mL Şırınga | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide İğne, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Hücre Kültürü Kabı 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Hücre Kültürü Şişesi | Cellstar | 660175 | |
| Kapak Gözlükleri: 12 mm daireler | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | JT Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Etil alkol 200 kanıt | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm TC ile işlem görmemiş polistiren Petri kabı | Corning | 351029 | |
| Fetal Sığır Serumu | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Floresan Mikroskobu | Nikon | E200 | |
| Keçi anti-fare IgG Texas kırmızı | Invitrogen | T-862 | |
| Keçi anti-tavşan IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Kimya Sanayi A.Ş. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Seyreltici | Beckman Coulter | ||
| L-Glutamin | İkizler | 400-106 | |
| Orta 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na piruvat (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehit | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penisilin / Streptomisin | İkizler | 400-109 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polipropilen konik Santrifüj Tüpleri 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polipropilen konik Santrifüj Tüpleri 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Altın antifade reaktifi | ThermoFisher | P36930 | |
| Sıçan anti-fare Lambası-1 antikoru | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 1D4B | |
| Rekombinant İnsan M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Parlak Çizgi Hemositometre ve nbsp; | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Orta 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Yüzey Aktif | Madde Kırlangıç Sigma | TX1568-1 | |
| Tripan Mavi | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Hassas Makas, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Diseksiyon Forsepsleri, İnce Uç | VWR | 82027-386 | |
| Mikroskop Slaytları | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Parçacık Sayacı, Çift Eşikli | Beckman Coulter | 6605699 |
Kaynaklar
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
